Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

Özet

Ökaryotik ekspresyon için tasarlanan karboksi-terminalinde bir GFP etiketli bir konstrukt şifreleyen TMEM184A, vasküler hücrelerde heparin reseptör olarak TMEM184A varlığını teyit etmek için tasarlanan deneylerde kullanılmıştır.

Özet

yeni proteinler afinite bazlı izolasyon ve biyoinformatik analizi ile tespit edildiğinde, genellikle büyük ölçüde uncharacterized vardır. tahmin edilen dizi içinde spesifik peptitler karşı antikorlar bir yer belirleme deneyleri sağlar. Bununla birlikte, antikorlar diğer muhtemel etkileşimleri genellikle göz ardı edilemez. Bu durum, protein dizisinin bağımlı testlerin bir dizi geliştirmek için bir fırsat sağladı. Özel olarak, proteinin C-terminal ucunda, GFP kodlama sekansına bağlanmış bir gen sekansı ihtiva eden bir yapı elde edilmiş ve bu amaçlar için kullanılmıştır. Deneyler lokalizasyonu, ligand afinitesi karakterize etmek için, ve fonksiyon kazancı ilk olarak tasarlanmış ve bir heparin reseptör ¹ ile TMEM184A varlığını teyit etmek için gerçekleştirildi. Buna ek olarak, yapı, membran topolojisi sorular ve ayrıntılı bir protein-ligand etkileşimine yönelik çalışmaları için kullanılabilir. Bu rapor, ar sunarKolayca diğer yeni proteinler için adapte edilebilir vasküler hücrelerde GFP-TMEM184A yapısı temel alan deneysel protokollerinin ange.

Giriş

yeni işlevler için aday proteinlerin tanımlanması genellikle kısmi sekans belirleme ardından afinite bazlı yalıtım protokolleri bağlıdır. Yeni tanımlanmış proteinlerin son örnekleri transmembran proteini 184a (TMEM184A), heparin afinite etkileşimleri ¹ sonra belirlenen bir heparin reseptörü ve TgPH1, fosfoinositid PI (3,5) _P2 ² bağlanan bir pleckstrin homoloji alanı protein içerir. Diğer yeni protein tanımlama gibi, diğerleri Vit tarafından bu kadar peptidler doğrudan dizisi analizini içerir. kim daha önce uncharacterized genlerden ³ protein ürünleri tanımlamak için zar peptitler kullanılır. Benzer şekilde, yeni protein sekanslarının tanımlanması gibi, yeni 4tm proteinlerin ⁴ tanımlanması daha önce, özelliği protein aileleri arayan biyoinformatik kullanılarak gerçekleştirilebilir. aquaporin ailesi geni dizilerinin incelenmesi al varböylece yeni fonksiyonlar ⁵ ile yeni üyelerin belirlenmesi vermiştir. belirlenmesinden sonra, protein fonksiyonlarının analizi bazen aquaporin durumunda olduğu gibi protein fonksiyonunun belli bir tahlil kullanılarak incelenebilir bir sonraki adım, tipik olarak.

Mümkün olduğunda, yeni tanımlanan proteinin fonksiyonu belirli bir enzimatik ya da benzer bir in vitro işlevi testleri ile kontrol edilebilir. Yeni proteinlere birçok fonksiyonu in vitro deneyler, sadece dokunulmamış hücreler ya da organizmalar meydana karmaşık etkileşimler bağlıdır, çünkü her zaman etkili değildir. Bununla birlikte, in vivo deneyler, bu gen sekansına bağlı olduğu bir şekilde tasarlanmalıdır. Hücre kültürü ve / veya basit bir model organizmalarda, demonte protein / fonksiyon tanımlama ⁶ destekleyici kanıt sağlayabilir. Yukarıda belirtildiği gibi, tanımlanan yeni proteinler ile, bir, fonksiyonu teyit etmek için, sadece bir proteini yıkmak genellikle yetersizdirD gen sekansı bağlıdır, in vivo fonksiyonel analizlerin tasarım yeni proteinlerin karakterizasyonu için önemli hale gelir.

Demonte tanımlama ile tutarlı sonuçlar sonra heparin reseptör olarak TMEM184A son tespiti afinite kromatografisi ve MALDI MS ¹ kullanarak (diğer bir deyişle damar düz kas ve endotel hücrelerinde enflamatuar yanıtlarda çoğalmasını modüle ^{eden), 7} deneylerin kümesi geliştirmek için bir fırsat temin . Yeni bir gözden heparin birçok büyüme faktörleri, reseptörler, hücre dışı matris bileşenleri, hücre yapışma reseptörlerinin, ve diğer proteinlerin ⁸ ile spesifik olarak etkileşime doğruladı. Damar sistemi, heparin ve heparan sülfat proteoglikanlardan olarak birkaç yüz proteinler, ⁹ ile etkileşim (heparin yapı içindeki heparan sülfat zincirlerini içeren). işlevsel tha onaylamak içint TMEM184A heparin alımı ve bağlama ile yer aldı, TMEM184A için gen yapısını istihdam teknikleri geliştirilmiştir. Bu rapor bir GFP-TMEM184A dayalı tahliller bir koleksiyon bir heparin reseptörü olarak TMEM184A kimliğini teyit kullanılmak üzere inşa içerir.

Protokol

GFP proteinin üretilmesi 1. Tasarım

1. Satın alma, ya da tasarım ve inşa, söz konusu protein dayalı bir GFP etiketli yapı.
   NOT: Satın alınan yapı için, standart vektörler bazılarını veya aşağıdaki önerilerden hepsini içerir ticari laboratuvarlarda temin edilebilir: membran proteini kaçakçılığı müdahale olasılığı daha düşük olduğu için membran proteini için, GFP bir C-terminal konumu seçin. ilgi gen ve söz konusu proteinin C-terminali kompakt proteinin bir etki alanına katlanır inanmak için bir neden varsa GFP arasında bir uzantı düşünün. Genel ökaryotik hücre ifadesi için yapı seçin, ancak bakteriyel sistemlerde üretim inşa sağlar. GFP proteini aktivitesine müdahale Bazı deneyler için, istenirse GFP çıkarılabilir hangi (örneğin, TEV proteaz gibi) bir bölünme bölgesini içerir. Böyle lokalizasyon veya afinite için ek bir etiket gibi diğer ekleri ekleyinetkileşimleri (örneğin, His6). Bu, burada tarif edilen deneyler için gerekli değildir, ancak GFP önce, GFP çıkarılması arzu edildiği takdirde, diğer deneyler kolaylaştırmak ya da gen doğrudan bitişik yararlı olabilir.

Vasküler hücrelerde 2. GFP-TMEM184A İfade

1. Kültür endotelyal ya da daha önceden ^{1, 6, 7} belirtildiği gibi,% 0.2 jelatin kaplı doku kültür tabaklarında, vasküler düz kas hücreleri.
2. 5 ml hücre kültürü tripsin solüsyonu (% 0.5 a / h) bir durulanmıştır 100 mm ya da daha büyük, hücreler konfluent çanak. Hücreler sadece plaka serbest kadar 37 ° C'de inkübe edilir ve steril polipropilen santrifüj tüpüne hücreleri transferi.
3. Tripsin aktivitesi sınırlamak için hücre / tripsin çözeltisine rutin kültürü kullanıldığı şekilde, bir tripsin inhibitörü (örneğin, normal bir kültür ortamının eşit hacimde) eklenir. approxim 5 dakika boyunca hücreler Peletgetirilmemektedir 600 xg (veya uygun hız ve zaman sadece standart doku kültürü için pelet hücreleri). süpernatant aspire.
4. Zaman hücrelerinin miktarını sınırlayan HeBS (Hepes-tamponlu tuzlu su), elektroporasyon tamponu 1 mL içinde süspanse hücreleri, pelet ya da süspansiyon içinde bulunmaktadır. Buz üzerinde hücre süspansiyonu yerleştirin ve buz üzerinde kalan adımları yürütmek.
   NOT: Pelet önce tabanda için HeBS ile bir kez yıkanabilir.
5. 20 ug / ml DNA nihai konsantrasyon elde etmek için hücrelere GFP etiketli TMEM184A plazmid yeterli hacim. GFP yapı için aynı protokolü kullanın.
6. bir elektroporasyon küveti içinde HeBS hücre çözeltisinin yaklaşık 0.4 mL yerleştirin. Kullanmadan önce küvetler önceden soğuk.
7. Aşağıdaki koşullar kullanılarak hücrelerin electroporate: Üstel Bozunma, 500 iF, ∞ ohm ve 170 V
   Not: belirli bir hücre tipi için voltaj optimize edilmelidir. endotelyal ve düz kas cel ile ön çalışmalarl tipleri burada belirtmek optimum voltaj değerini, örneğin ¹⁰ belirlemek için bir GFP vinkulin yapı ile gerçekleştirilmiştir.
   1. elektroporasyon optimize etmek için, (bazı standart hücre tipleri için koşulları içerir) ekipman üreticisinin tavsiyeleri ile başlar. istenen konstrukt ya da bir kontrol floresan proteini istenen yapısına boyut ve flüoresan özellikleri içindeki yapısı kullanmak.
      NOT: Küçük nükleik asitler büyük yapıları daha kolay hücrelere girmek için görünür, bu yüzden sadece bir flüoresan protein ile bir yapı biri daha büyük ifade etmek daha kolay olabilir.
   2. hücre canlılığı, floresan yapı 24 ve 48 saat sonra ifade edildiği hücre yüzdesi, ve ifade yoğunluğunu belirlemek için floresan mikroskobu kullanarak.
      NOT: hayatta kalma düşükse biraz gerilim ve / veya süresini azaltın. kültür yüzeyinden hücrelerin serbest bırakılması ve geri dönen arasındaki mümkün olan en kısa süre için Amaçkültür hücreleri, hayatta kalmak geliştirmek için. hayatta kalma yüksek ve ifade düşükse zaman ya da ikinci bir darbe hafif artışlar yapı alımını artırabilir. Optimum koşullar ve sentezleme hücre tipleri arasında değişir. bu yapının hücre yüzdesi yüksek, ama şiddeti yoğunluğunu geliştirebilir DNA konsantrasyonu artar ve protein yarı-ömrü ve ifade göre değişir uygun yoğunluk için, zaman içinde transfekte edilmiş hücrelerin izlenmesi, düşük olduğunu gösterir. Boyama yoğunluğu anti-GFP antikorları ile GFP immünofloresan boyama ile, gerektiğinde, bazı deneyleri için büyütülebilir
8. Elektroporasyondan sonra, görüntüleme için veya doku kültür tabaklarında lamelleri altı 30 mm doku kültürü oyukları içine hücreleri tohum. Kültür standart hücre kültür prosedürlerini kullanarak hücreleri.
9. İsteğe bağlı: HeBS elektroporasyon tampon kaldırmak için 24 saat sonra kültür ortamı değiştirin.

GFP-Tmem 3. Görselleştirme184a Yerelleştirme

1. En az 24 saat süreyle kültür edildikten sonra, PBS ve hafifçe çalkalanarak hücrelerin durulayın. GFP solmasını önlemek için, parlak ışığa maruz kalma sınırı.
2. hafifçe çalkalanarak oda sıcaklığında 15 dakika süreyle PBS içinde% 4 paraformaldehit (PFA) ile hücrelerin sabitleyin. Hücreleri geçirgenliği herhangi metanol içeren reaktifler kullanmaktan kaçının. ligand etkileşimlerini değerlendirmek için gerekli değilse, metanol ile sabitleme kullanılabilir.
   Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın. dikkatle, bir davlumbaz kullanın ve düzgün atın.
3. yukarıdaki gibi PBS ile durulayın. antikor bazlı boyama için aşağıdaki 3.6 bakınız.
4. Dağı Mowiol veya diğer uygun montaj orta kullanarak slaytlar lamelleri.
5. GFP uyarma ve emisyon spektrumları için uygun filtre setleri ile bir konfokal veya floresan mikroskop kullanılarak Görüntü slaytlar. Konfokal mikroskopi için Z-düzleminde örnekleri ayrı yeteneği nedeniyle tercih edilir. qu için gri ölçekli görüntüleri kaydetmeTIF formatında antitation ilanları (resimler için tam renkli görüntülere ek olarak).
6. Hücreler tarafından ifade WT TMEM184A ile karşılaştırılması için, örneğin TMEM184A dizisinden bir peptid (ler) e hazırlanan primer antikorlar kullanılarak imüno diğer hücreleri hazırlamak ^1. GFP TEMEM184A tanımlanması GFP karşı antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. aynı mikroskopi teknikleri ile her iki hücre örnekleri değerlendirin.

4. Rodamin-Heparin GFP-TMEM184A transfekte Hücreleri ile bağlama ve ko

1. Kültür ortamına ilave 100 ug / ml rodamin heparin hücreleri GFP TMEM184A ifade eden tedavi ve hücreler zaman belirli bir miktarda, A7r5 hücreleri için, tipik olarak en az 10 dakika boyunca inkübasyona izin verin. Durulayın ve 3.1 ve 3.2 olarak düzeltin.
   Not: en uygun zaman ve ligand konsantrasyonu hücre tepkisinin elde ligandı ve görüntü yoğunluğu floresan yoğunluğuna bağlıdır. bu concentratdiğer deneylerde ^11% 50 den fazla bir cevap ile sonuçlanır, çünkü heparin iyonu kullanılmıştır. Bu konsantrasyon, standart floresan mikroskopi teknikleri kullanılarak görüntülendi, bu yüzden bunu artırmak için gerekli değildi olabilir. hücrelerinde daha düşük floresan etiketlenmemiş Heparin rodamin heparin seyreltilmesi ve böylece görüntü ve ölçmek için daha zordur.
2. Nedeniyle GFP-TMEM184A transfeksiyon bağlanma rodamin heparin nicelendirmek transfekte GFP TMEM184A olmayan özdeş hücreleri hazırlamak.
3. Resim uygun GFP (488 nm) ve rodamin (543 nm) bir eksitasyon ve emisyon ile bir konfokal mikroskop kullanılarak hücre (500 - GFP için 530 nm ve rodamin için daha büyük 560 nm) değerleri ko-lokalizasyonunu tespit etmek. istatistikler elde etmek için en az üç ayrı deneylerden elde edilen en az 50 hücre görüntüler elde edilir. Deneylerde içinde aynı ayarları korumak ve th (hiçbir tedavi ile, örneğin transfekte hücreler) bir kontrol numunesi (ler) istihdambirden fazla deney analiz için veri standardize etmek için de kullanılabilir.
4. bağlayıcı miktarının belirlenmesi için her hücrede / alımını bağlayıcı göreceli rodamin belirlemek için bir bilgisayar programı kullanarak görüntüleri inceleyin.
   NOT: analiz için uygundur ve onlar başlangıçta bu formatta kaydedilmiş olmasaydı birçok bilgisayar programlarında gri skala dönüştürülebilir olarak TIF görüntüleri kullanılmalıdır. Resim J (ücretsiz), mevcut analizde kullanılan ve alan ve piksel yoğunluğu görüntüdeki herhangi bir kullanıcı tanımlı alan için ölçülebilir sağlar edildi.
   1. Bir floresan görüntü içinde bir hücreyi daire ve bu alan içinde yoğunluğunu belirlemek için ölçü aracı kullanmak için bir serbest aracını kullanın.
      NOT: Bu ölçümler, farklı geometriye sahip farklı hücreleri karşılaştırmak için bir yol sağlayan bir kullanıcı tanımlı alanın (bütün hücre, çekirdek, vs.) için toplam yoğunluğunu hesaplamak için gerekli bilgileri sağlamak. arka plan bir alan üzerinde yoğunluk rapor edilebilir demek ve o kolaylaştırmakAnaliz için arka plan yoğunluğu koleksiyonu.
   2. Bir e-tabloya aktar yoğunluğu ile çarpılır alanı hesaplamak ve bölgenin aynı miktarda arka plan çıkarmak için. istatistiksel anlamlılık elde etmek için yeterli hücre / deney için floresan / hücre ortalama.

Rodamin-Heparin GFP-TMEM184A 5. flüoresan rezonans enerji transferi

1. transfekte edilmiş hücrelerin hazırlanması ve 3.1 olarak 200 ug / ml rodamin etiketli ligand ile inkübe edin. Floresan ligand ile inkübasyon süresi hücre tipi bağlı olduğunu not edin. Sadece PFA düzeltmek ve görüntüleme için slaytlar monte edin.
2. (-; FRET 685 nm 566) Öncelikle rodamin emisyonu için 405 nm ve görüntüye heyecanlandırmak. İkinci olarak, GFP (493 görüntünün - 530) için 488 at heyecanlandıracak ve üçüncü (- 685 566 görüntünün) rodamin için 561'de heyecanlandırmak. GFP-TMEM184A olmadan veya rodamin-heparin olmadan Kontroller kritik öneme sahiptir.

Rodamin-Hepari 6. Canlı hücre Görüntülemen Alımı

1. canlı hücre görüntüleme için tasarlanmış bireysel yemeklerin içine GFP-TMEM184A transfekte hücreler Tohum ve protokol 3'teki gibi davranın.
   Not: Gerekli hücre sayısı, istenen hücre tipine ve yoğunluğuna bağlıdır. hücreleri yok saymak, hücreler süspansiyonda olan süreyi en aza indirmek için. Altı 35 mm canlı görüntüleme yemekleri içine 100 mm konfluent çanak Tohum hücreleri 48 saat içinde hücreler yakın izdiham elde etmek.
2. 48 saat sonra, fenol kırmızısı olmadan kültür ortamı ile orta yerine.
3. sıcaklık korumak ve mikroskop odaklanmak için bir ısınma aşamasında olan bir konfokal mikroskop hücrelerin bir tabak aktarın.
4. Pipet 100 ug / ml rodamin-heparin kabına ve hafifçe karıştırın.
5. Hemen canlı görüntüleri kaydetmeye başlamak. heparin hiçbir hücre alımı görünümünde bir bölgesinde bulunur ise, en az bir adet yeşil vezikül rodamin etiketi ihtiva eden hücreleri belirlemek için biraz çanağı hareket.
   NOT: Görüntüleme uyarma ve emisyon özellikleri şunlardırHeparin alım protokolü (bölüm 5) için aynıdır. görüntüler arasında süre yaklaşık 16 sn. Deney ve mikroskop koşulları tipik görüntüler elde edilebilir hızını belirleyecektir.

Kültürlenmiş hücrelerden GFP-TMEM184A ve GFP 7. izolasyonu

1. kültür ortamının ayrılması ve PBS ile yıkandıktan sonra, 2 ml% 0.2 (kontrol bağlama deneyleri için) GFP-TMEM184A veya GFP ifade eden bir hücre, 150 mm plaka proteaz inhibitörleri (ağırlık / hacim) CHAPS 1x PBS çözeltisi ilave edin. Çanak hücreleri Pençe buz üzerinde 15 ml polipropilen tüp içinde hücre / CHAPS çözeltisi yerleştirin ve hafifçe vurarak karıştırın. GFP etiketi altında bağlanma tahlili için ağartılmış sağlamak için parlak ışıkta tüm adımları tamamlayın.
2. özellikle GFP-TMEM184A (ya da, uygun bir GFP kontrol) bağlamak için, çözeltiye 2 ug / ml biyotinile anti-GFP antikor ekleyin ve sallanan 4 ° C'de bir gece boyunca inkübe edilir.
3. 500 uL ekleyinen az 5 ml% 0.2 CHAPS / PBS ve santrifüj yaklaşık 3 ila 5 dakika boyunca 600 x g'de streptavidin-agaroz boncuklar. süpernatantı. Taze CHAPS / PBS her seferinde iki kez daha tekrarlayın. antikor ve hücre çözeltisine boncuk ekleyin ve boncuk GFP veya GFP-TMEM184A bağlı biyotinile anti-GFP antikora bağlanmasına izin vermek için sallanan 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
4. (7.3 gibi) santrifüj boncuk pelet ve bağlanmamış malzemenin çıkarılması. yıkamak için en az 5 ml% 0.2 CHAPS / PBS / proteaz inhibitörleri ekleyin. Tekrarlayın yıkama ve santrifüj en azından etkin bir şekilde bağlanmamış protein kaldırmak için 3x.
5. Son yıkama ayrılmasından sonra, antikor, GFP bağlanma (serbest GFP-TMEM184A veya serbest sonuçlanan ayırmak 3 dakika boyunca buz üzerinde (HCI kullanılarak pH değerini 2.0 ye) PBS içinde 0.2 M glisin /% 0.2 CHAPS, 1 mL boncuk inkübe GFP). her 30 sn dokunarak yavaşça karıştırın.
6. Santrifüj yaklaşık 600 x g'de ve saflaştırılmış p ihtiva eden üst sıvıyı aktarmak5 ml 1 M sodyum bikarbonat (pH 7'ye getirmek) derhal nötrleştirme ardından yeni bir 15 ml tüp rotein.
7. 10.000 Dalton molekül ağırlığı kesme santrifüj konsantratör kullanılarak örnek Konsantre (satıcı tarafından santrifüj hızı kullanılır). hacmi yaklaşık 0.5 mL ulaştığında,% 0.2 CHAPS / PBS ilave edin. konsantre ve daha fazla% 0.2 CHAPS eklemeye devam edin / PBS% 0.2 CHAPS en az on hacimleri (katı başlangıç ​​numune hacmi) / PBS eklenene kadar.
8. izole edilmiş GFP veya GFP etiketli protein miktarının bir tahmin etmek için, 280 nm 'de okuma absorbans elde edilir ve aynı tampon maddesi içinde sığır serum albümini ya da kontrol proteini ile hazırlanan standart bir eğri ile karşılaştırmak.
   Not: yok olma katsayısı farkı nedeniyle, bu konsantrasyon tahmini, ancak örnek yitirmeden daha analizini kolaylaştırmak için yaklaşık protein konsantrasyonunu sağlayabilir. Doğru protein konsantrasyonu caydırıcı olabilirörnek olarak, aynı tampon içinde, standart protein hazırlamak için, belirli hale mikro Lowry protein deneyi kullanılarak çıkartılmaktadır. izole edilmiş proteinin daha fazla analizi, öngörülen molekül ağırlığı ve karşılaştırma (antikor GFP için algılama kullanılarak) izole edilmiş protein Western blotting ile gerçekleştirilebilir. Seçenek olarak ise, TMEM184A antikorların kullanımı tahmin yapı büyüklükte bir bant ile sonuçlanacaktır, ancak dimerler (ya da daha yüksek dereceli oligomerler) numune içinde mevcutsa, bir WT TMEM184A bant neden olabilir. saflık tahmini başlangıç ​​malzemesinin bir kısım toplam protein vs izole numune toplam protein için bir leke boyama ile elde edilebilir.

8. in vitro Heparin Bağlama Deneyi

1. çalkalanarak 200 uL% 0.2 CHAPS, 5 dakika boyunca / PBS üç kez yıkanarak siyah avidin kaplı 96 oyuklu plaka hazırlanması. aynı yıkama işlemi kullanılarak benzer bir siyah noncoated 96 oyuklu plaka hazırlanması. Bir ... hazırlamak(Üç kopya halinde), deneysel örnekler için düzeni tahlil sırasında takip etmek. GFP beyazlatma onaylamak için heparin olmadan standart heparin konsantrasyonlarında, tampon kontrolleri ve GFP örnekleri ile Kuyular için kuyu yer alır.
   NOT: Optimize edilmiş izolasyon veya ligand etkileşimi tamponlar, söz konusu proteinin farklı ise, optimum tampon sistemi ile plaka hazırlıkları ve yıkama her şeyi.
2. GFP istenen bağlanma avidin kaplı plaka tüm oyuklara 60 pmol / oyuk biyotinile edilmiş anti-GFP, 100 uL ekleyin. antikor miktarı sadece kuyularda yüksek afiniteli bir avidin doyurmak için yeterlidir.
   1. Sadece kontrol amaçlı kullanılan tüm oyuklara (hiçbir GFP veya GFP-TMEM184A istenen bağlanma) tampon ekleyin. buharlaşmasını önlemek için bir tabak kapağı ile kuyu Seal. çalkalayarak, oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin.
      NOT: kuyu ve inkübasyon süreleri eklenen Ciltler sağlayıcıdan tavsiyelerine dayanmaktadır.
3. Tüm wells üç kez yıkayın200 uL% 0.2 CHAPS / PBS ile 5 dakika karıştırıldı.
4. Avidin kaplı plaka gözenekleri içinde uygun ve çalkalanarak oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona 5 nmol / oyuk GFP-TMEM184A veya GFP 100 uL ekleyin. 8.3 gibi tekrar yıkayın.
   NOT: Bu protein konsantrasyonu tüm sitelerin aşırı GFP veya GFP-TMEM184A doyurulmuş emin olmak için seçildi. Bu protein aynı miktarda her bir bağlı olduğundan emin olmak için önemlidir. protein alt miktarları da, plaka ile proteinin çeşitli konsantrasyonlarda inkübe edilmesi ve bağlanmamış protein karşılaştırılması ve bağlama tahlilleri ligandın sonra kalan bağlanmamış protein değerlendirilerek incelenebilir bir olasılık bölgelerini doymuş hale olabilir.
5. Floresein-işaretli heparin çeşitli konsantrasyonlarda, hazırlama, örneğin, 10, 25, 50, 75, 100, 200 ug / ml,% 0.2 CHAPS içinde / PBS ile yıkandı. Karanlıkta bu ve kalan tüm çalışmaları yapmak.
   Not: Ön konsantrasyonları hazırlamak için, diğer ligandlar için spesifik konsantrasyonlar protein, belirlenmelidirSöz konusu N hedefi. düşük konsantrasyon plaka okuyucusu içinde tespit edilebilir. Nedenle, ilk kullanılan tampon sistemi içinde hassas bir şekilde tespit edilmiş olabilir belirlemek önemlidir. Sonra ölçülebilir bağlanma elde etmek için gerekli aralığını belirler. 10 ug / mL 'nin altında floresan heparin konsantrasyonları sürekli olarak kullanılan tampon koşulları altında plaka okuyucu kayıt yoktu. Benzer şekilde rodamin heparin, diğer deneylerde bu kullanıldığı haliyle ise, tampon şartlarında, plaka okuyucuda görüntülenmiştir olabilir ve bağlanma için gerekli konsantrasyonlarda standartlar için floresans okuma bu florofor ile yeniden üretilebilir farklı değildi.
6. Her iki avidin kaplı olan ve olmayan kaplı plaka içinde avidin kaplı plaka ve konsantrasyon standart kuyularda uygun test kuyulara floresan heparin 100 uL ekleyin. çalkalanarak oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Karanlıkta plakaları tutun (ya da folyo kaplı).
7. Bir tabak rea kullanarakder, tabak ve avidin kaplı plaka ilk floresan (toplam) hareketsiz GFP-TMEM184A ile kuyu emisyon ya da GFP hem kontrol kuyularında heparin gelen ilk floresan emisyonunu kaydedin. Gerekirse, en düşük ve en yüksek konsantrasyonları arasındaki floresan heparin tespitini sağlamak için alet kazancını ayarlayın.
   NOT: plaka okuyucu yukarıdan kuyuları okur ve ayarlanabilir olması durumunda kuyularda optimum konumda okur emin olun. Söz konusu çalışmada, optimum yer kuyuları aşağı yaklaşık% 75 idi. plaka okuyucu ile mevcut bilgiler siyah plakalarda bağlı numune deneyleri okumak için söz konusu plaka okuyucu özgü önerileri sunmalıdır.
8. hareketsiz GFP-TMEM184A veya GFP ile oyuklardan bağlanmamış floresan heparin çıkarın ve olmayan kaplı siyah plaka karşılık gelen kuyulara yerleştirin. Hemen floresan emisyon okuyun.
9. Taze% 0.2 CHAPS 100 uL ekle / PBS geri intO kuyuları olan floresan heparin çıkarıldı ve floresan emisyon okundu.
10. 8.9 3x - yineleyin 8.8 adımları.
    NOT: kaplı plaka Bu okumalar GFP veya GFP-TMEM184A kuyularda kalan floresein heparin göstermektedir. önemli bir floresan üçüncü bağlanmamış numune içinde bulunursa, ek bir yıkama yapılması gerekir. Floresan, her bir yıkama uzaklaştırılmıştır devam ediyorsa, ligandın düşük afinite ile olabilir ve koşulları yeniden değerlendirilmelidir. son okuma bağlı heparin okuma oluşturmaktadır.
11. Her yıkamadan numaralarını elde noncoated plaka kaldırılan, ilişkisiz, örneklerin, Tutanak floresans emisyon. Bu "ilişkisiz" okumalar vardır.
12. her oyuğa ilave heparin doğru seviyelerini teyit etmek 8.7'de elde edilen toplam heparin emisyon değerlerini kullanın. değerlerden ortalama arka plan okumaları çıkarın.
    NOT: Wells herhangi floresan heparin olmadan dolayı antikor, GFP ve tampona arka plan olarak hizmet vermektedir. average arka plan değerini elde etmek için tekrar eder. bağlı ve bağlı olmayan okumalardan Çıkar ortalama arka plan okumaları gerçek değerleri elde etmek için.
13. toplam floresan heparin heparin miktarı vs emisyon ölçeğini belirlemek için eklenen vs emisyon bir arsa kullanır.
    Not: Antikor, tek başına ya da antikor ve antijen floresan bir su verme ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle, toplam heparin 8.7'de belirtildiği gibi toplam katma heparin göre belirlenmiştir.
14. GFP-TMEM184A durumda ve GFP durumda hem de üç kopya için ilave heparin genel giderilmiştir bağlı heparin çizilir.
15. Belirli bir konsantrasyon için tüm yıkar ilişkisiz okumalar ekleyerek ücretsiz ligand belirleyin.

Sonuçlar

Teorik olarak, herhangi bir DNA transfeksiyon lipofilik transfeksiyon reaktifleri ile başarılabilir yapısının hücreler içine, birlikte, daha önceki raporlar GFP daha etkili transfeksiyon, elektroporasyon ¹² ile endotel hücrelerine yapıları göstermektedir. Burada verilen protokol, tipik olarak kullanılan primer endotel hücreleri ve düz kas hücreleri% 80'den ekspresyonu GFP-yapı elde. Kullanılan yapı tasarımı hızla bu yapı teslim olabilir ...

Tartışmalar

Burada bildirilen protokoller vasküler hücrelerde ¹ heparin reseptör olarak TMEM184A tanımlanması için doğrulayıcı kanıt sağlamak için tasarlanmıştır. Nakavt teknikler rutin yeni proteinlerin varlığını teyit etmek için, bir mekanizma olarak kullanılır. Ancak, demonte sonra bazı fonksiyon kaybı aday protein aslında doğru reseptör olduğunu yeterli kanıt (ya da diğer fonksiyonel protein), tipik değildir. Aday proteini aslında işlevi sergiler dair kanıt olması da ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GFP-TMEM184A construct	OriGene	RG213192
Rhodamine-Heparin	Creative PEGWorks	HP-204	Light Sensitive
Fluorescein-Heparin	Creative PEGWorks	HP-201	Light Sensitive
Mowiol	EMD Millipore	475904-100GM
Paraformaldehyde (methanol free)	Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific	PI28908 at Fisher	Use in Fume Hood
Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes)	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	PI15510 at Fisher	Pay attention to shelf-life
Black 96 well plates	Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific	064432 at Fisher
A7r5 vascular smooth muscle cell line	ATCC	CRL 1444	Can be exchanged into MEM medium1
BAOEC bovine aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	B304-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7
BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells	Cell Applications, Inc.	B354-05	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1
RAOEC rat aortic endothelial cells	Cell Applications, Inc.	R304-05a	Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7
Biotinylated anti-GFP	Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific	MA5-15256-BTIN
Streptavidin-coated beads	Sigma	S1638
HeBS	Available from Bio-Rad		Can be prepared in the lab.  The pH is 6.8
TMEM184A antibody to the N-terminus	Santa Cruz Biotechnology	sc292006	Only known TMEM184A antibody to N-terminal region.
TMEM184A antibody to the C-terminus	Obtained from ProSci Inc, Poway, CA	Pro Sci 5681	ProSci used in figure 1
GFP antibodies	Santa Cruz Biotechnology	sc9996	Used in figures 5
Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3	Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA	711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3)	Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining.
CHAPS	Purchased from Sigma	C5849	Note that this specific catalog number has been discontinued.  Supplier will provide information regarding replacement.
Live imaging 35 mm dishes	MatTek (Ashland MA)	P35G-1.0 – 20 mm - C
Confocal Microscope	Zeiss	LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens	Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3
Confocal Microscope	Nikon	C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens	Used for images in Figure 5
Confocal Microscope	Zeiss	Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens	Used for images in Figure 2C
Electroporation equipment	Bio-Rad	Gene Pulser X-Cell System
Electroporation cuvettes	Available from MidSci	EC2L	Can also be obtained from equipment supplier
Plate reader	TECAN	TECAN Infinite® m200 Pro plate reader	Readings in the middle of the wells rather than at the surface.
Computer program for measuring staining intensity	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line	Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail
Cell Culture trypsin solution	Sigma	T4174	purchased as a 10X solution