JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים את טיהור pneumophila הלגיונלה (pneumophila L.) שלפוחית הקרום החיצוני (OMVs) מתרבויות נוזלי. שלפוחית ​​מטוהרים אלה משמשות לטיפול מקרופאגים לנתח פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם.

Abstract

Bacteria are able to secrete a variety of molecules via various secretory systems. Besides the secretion of molecules into the extracellular space or directly into another cell, Gram-negative bacteria can also form outer membrane vesicles (OMVs). These membrane vesicles can deliver their cargo over long distances, and the cargo is protected from degradation by proteases and nucleases.

Legionella pneumophila (L. pneumophila) is an intracellular, Gram-negative pathogen that causes a severe form of pneumonia. In humans, it infects alveolar macrophages, where it blocks lysosomal degradation and forms a specialized replication vacuole. Moreover, L. pneumophila produces OMVs under various growth conditions. To understand the role of OMVs in the infection process of human macrophages, we set up a protocol to purify bacterial membrane vesicles from liquid culture. The method is based on differential ultracentrifugation. The enriched OMVs were subsequently analyzed with regard to their protein and lipopolysaccharide (LPS) amount and were then used for the treatment of a human monocytic cell line or murine bone marrow-derived macrophages. The pro-inflammatory responses of those cells were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay. Furthermore, alterations in a subsequent infection were analyzed. To this end, the bacterial replication of L. pneumophila in macrophages was studied by colony-forming unit assays.

Here, we describe a detailed protocol for the purification of L. pneumophila OMVs from liquid culture by ultracentrifugation and for the downstream analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages.

Introduction

חיידקים יכולים להפריש גורמים ארסיים באמצעות מנגנונים שונים 1. מלבד מערכות הפרשה הידועות, גראם שלילי חיידקים יכולים להחליף מידע ולספק גורמים ארסיים באמצעות שלפוחית ​​קרום חיצונית (OMVs), שהם קטנים, שלפוחית ​​אליפטית 10-300 ננומטר בקוטר עם מבנה קרום bilayered. הם מופרשים במגוון סביבות גידול (בתרבות הנוזלית, תרבות מוצקה, biofilms) ובכל שלבי הגדילה 2, 3. OMVs הם אמצעי חשוב של תחבורה (למשל, חלבונים, adhesins, רעלים, ואנזימים, כמו גם עבור LPS, אשר נמצא על פני השטח OMV) 4. מטען intraluminal מוגן מפני שפלה פרוטאוליטים, כך הוא מסוגל לפעול על פני מרחקים ארוכים, ואת השלפוחית ניתן למצוא בנוזלי גוף לאיברים מרוחקים 5, 6,"Xref"> 7, 8. הם לא יכולים להיות מוכרים בלבד נלקחו על ידי תאים איקריוטיים 9, 10, אבל יתר על כן, הם יכולים להקל על הכריכה של חיידקי הפלישה שלהם לתוך תאי מארחים 4. Pneumophila הלגיונלה (pneumophila L.) הוא חיידק גראם שלילי שיכול לשחרר OMVs. ב הריאה האנושית, זה בעיקר מדביק מקרופאגים מכתשיים, למרות המארח הטבעי הם 11 מים מתוקים אמבות. זיהום pneumophila ל עלול לגרום למחלת הליגיונרים, צורה חמורה של דלקת ריאות 12. היא חוסמת phagosome-ליזוזום היתוך בתוך התא המארח. כמו כן מגייס אברונים מארחים, לפיה נישה שכפול, את vacuole המכיל הלגיונלה (LCV), נוצרת 13, 14. השפלה ליזוזומלית היא עכבות לא רק על ידי tra חלבון מפעילnslocation באמצעות מערכת הפרשת IV סוג, אלא גם על ידי שחרור של OMVs 15.

טיהור OMVs מתרבויות חיידקי נדרש לנתח את השפעתם על תאי הנמען. מחקרים קודמים התמקדו תכולת החלבון של ל pneumophila OMVs ועל ההשפעה של שלפוחית על תאי אפיתל המכתשית 16, אך מחקרים מאוחרים יותר עם השתלות רקמת הריאה האנושית הראו כי ל pneumophila OMVs נתפסות על ידי מקרופאגים מכתשיים 17.

כמו דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן הנוכחי OMVs (PAMPs) ו אנטיגנים חיידקיים אחרים, הם עלולים להשפיע על הזיהום של תאי איקריוטיים ולווסת את התגובה החיסונית המארחת 18. ל pneumophila OMVs הפתיל במהירות עם קרום התא המארח, יתר על כן, הם להפעיל את קרומי TLR2 19. כידוע כי ל pneumophמינהל מקרקעי ישראל OMVs לעורר מקרופאגים ותאי אפיתל באופן פרו-דלקתיים 16, 17, ניתחנו את ההשפעה של OMVs על תהליך ההדבקה ב מקרופאגים האדם Murine.

כאן אנו מתארים פרוטוקול לגידול של pneumophila ל בתרבות הנוזלית לבודד את OMVs המופרש על ידי ultracentrifugation הפרש ועל מנת להעריך את ההשפעה של השלפוחית בתא פונדקאי איקריוטיים, במישרין או בעקבות זיהום.

Protocol

1. הכין צלחות בינוניות אגר

  1. כן 1 ליטר של מדיום מרק (ייב). ממיסים 10 גרם של אסים 10 גרם של תמצית שמרים 900 מ"ל מים מזוקקים. התאם את ה- pH 6.9 עם KOH (5 N). הוסף 10 מ"ל של L-ציסטאין (0.4 גרם ב 10 מ"ל מים מזוקקים) ו -10 מ"ל של Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0.25 גר 'ב 10 מ"ל מים מזוקקים). מלאו עד 1 ליטר עם מים מזוקקים ולסנן לעקר את (הגודל הנקבובי: 0.22 מיקרומטר) פתרון. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכין תמצית שמרי פחם שנאגר (BCYE) צלחות אגרו. ממיסים 10 גרם של אסים 10 גרם של תמצית שמרים 900 מ"ל מים מזוקקים. התאם את ה- pH 6.9 עם KOH (5 N). הוסף 15 גרם של אגר ו -2.5 גרם של פחם פעיל. מלאו עד 1 ליטר עם מים מזוקקים חיטוי.
    1. הוסף 10 מ"ל של L-ציסטאין (0.4 גרם ב 10 מ"ל מים מזוקקים) ו -10 מ"ל של Fe (NO 3) 3 x9H 2 O (0.25 גר 'ב 10 מ"ל מים מזוקקים, הן לעקר על ידי סינון דרך 0.22 מיקרומטרנקבובי) כדי BCYE המקורר (כ -50 ° C). יוצקים צלחות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.

2. לטפח pneumophila L.

  1. מורחים זן pneumophila ל Corby (סוג בר, WT) על צלחות אגר BCYE דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. לחסן 10 מ"ל של ייב ב OD של 600 0.3 עם pneumophila ל מהצלחת preculture; דגירת החיידקים על 37 ° C על שייקר סובב (150 סל"ד) במשך 6 שעות.
  2. בדוק את טוהר התרבות הנוזלית על ידי הפצת 100 μL של ההשעיה על צלחת אגר דם. דגירה לילה בשעה 37 ° C.
  3. מוסיפים את תרבות הנוזל הנותר עד 90 מ"ל של מדיום ייב טרי דגירה על שייקר הסובב (37 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד) להגיע OD של 600 3.0-3.5 הנמשך כ 16-20 שעות.

3. כן ולכמת ל pneumophila OMVs

הערה: לבצע את כל שלב צנטריפוגה הבאים בתנאים סטריליים על 4 מעלות צלזיוס.

  1. צנטריפוגה התרבות הנוזלת ב 4000 XG במשך 20 דקות עד גלולות החיידקים. מעבירים את supernatant לצינורות צנטריפוגות טריים, וזורקים את הכדור חיידקי, וחזור על צנטריפוגה (4,000 XG במשך 20 דקות). חזור על פעולה זו פעם.
  2. מסנן סטרילי את supernatant הנותרים פעמים (הגודל הנקבובי: 0.22 מיקרומטר). מעבירים את supernatant חיידקים ללא צינורות ultracentrifuge ו ultracentrifuge ב 100,000 XG למשך 3 שעות.
  3. למזוג supernatant וזורקים אותו. Resuspend גלול OMV ב פוספט שנאגר מלוח סטרילית (PBS) ultracentrifuge (100,000 XG במשך 3 שעות) כדי להסיר חלבוני LPS מזהמים.
  4. בטל supernatant ו resuspend גלולה OMV ב 500 μL של PBS סטרילית. Streak 20 μL על צלחת דם אגרו על צלחת אגר BCYE להוציא זיהום חיידקים של השלפוחית ​​המוכנה. דגירה את הצלחת דם אגר לילה צלחת אגר BCYE במשך 3 ימים (שני ב 376: C).
  5. לכמת את כמות החלבון המתקבל הכנה OMV באמצעות assay חומצה bicinchoninic פי הוראות היצרן.
    הערה: ריכוז 100 מ"ל של L. תרבות pneumophila הוא בדרך כלל 1 מיקרוגרם / μL. אחסן את OMVs מוכן לכמת ב -20 ° C.

המקרופאגים 4. טרום לטפל

  1. כן תאי THP-1.
    הערה: THP-1 הוא קו התא monocytic נגזר חולה לוקמיה.
    1. הוסף 2x10 5 תאים THP-1 לכל 24 בארות ולבדל אותם על ידי הוספת 20 phorbol ננומטר 12-myristate 13-אצטט (PMA) לתאים מקרופאג דמוי. דגירה של 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס.
    2. החלף בינוני עם 500 μL של מדיום חדש דגירה במשך עוד 24 שעות; המדיום האופטימלי עבור תאי THP-1 מורכב גלוקוז הגבוהה RPMI 1640 בתוספת 10% נסיוב עגל עוברי.
  2. לבודד את מקרופאגים בעכברים עצם שמקורם במח (mBMDM), כמתואר עייןence 20.
  3. פנקו מקרופאגים THP-1-derived או mBMDM עם OMVs.
    1. ההפשרה OMVs מוכן בשלב 3 ולהוסיף אותם על פי כמות החלבון שלהם (0.1, 1, ו -10 מיקרוגרם / מ"ל) אל אדם או מקרופאגים בעכברים. דגירה מקרופאגים עם OMVs ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעות 20 לפחות. השתמש supernatant עבור ELISA או להמשיך הלאה עם שלב 5.

5. להדביק את המקרופאגים ולהעריך שכפול חיידקים באמצעות 'יחידה קולוני-פורמינג (CFU) Assay

  1. השתמש pneumophila L. משלב 2.1, טרום טיפול תאי THP-1 או mBMDM משלב 4.3, ולא מראש שטופלו מקרופאגים שולטת (2x10 5/24 בארות). אל תחליף את המדיום.
  2. להדביק תאים THP-1 עם L. pneumophila Corby WT ו mBMDM עם מוטציה חסר-flagellin של קורבי pneumophila L. (שניהם עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 0.5; 1x10 5 pneumophila ל / 24 בארות) ו דגירה של 24 ו 48 שעות, בהתאמה. כן boה ל pneumophila Corby (WT או flagellin-חסר מוטציה) כמתואר בשלב 2.1.
  3. Lyse התאים הבינוני שלהם על ידי התוספת של saponin (ריכוז סופי: 0.1%) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  4. Resuspend את החיידקים על ידי pipetting ולהעביר את ההשעיה לכלי התגובה. כן דילולי סדרה של pneumophila L. המכיל תקשורת ב PBS סטרילית.
  5. Streak 50 μL של דילולים הנדרש על צלחות אגר BCYE דגירה במשך 3 ימים ב 37 מעלות צלזיוס.
  6. חזותי לספור מושבות נוצרו. חשב את CFU figure-protocol-6201 לנרמל את התוצאה לספור CFU כדי לא טרום טיפול אבל נגוע מקרופאגים, אשר נקבע על 100%.

תוצאות

הגדרת הניסוי להכין ל pneumophila OMVs ולנתח את השפעתם על התגובה פרו-דלקתיים של מקרופאגים בעקבות זיהום מתואר באיור 1. הפוטנציאל הפר-הדלקתי של OMVs המוכן ניתן לנתח על תאי PMA בדיל THP-1, אשר מוצגים באיור 2. THP-1 תאים מגיבים עם עלייה הזמן- ואת תלוי במינון של IL-8 ו- IL-6 הפרשה. בנוסף, ההשפעה של TLRs שונים על הכרה ל pneumophila OMV ניתן לנתח באמצעות mBMDM מרקע גנטי שונה, כפי שהוצגו על ידי CXCL1 ELISA באיור 3. mBMDM מעכברים WT מופרש CXCL1 לאחר גירוי OMV, בעוד mBMDM TLR2 / 4 - / - מופרש באופן משמעותי פחות. כדי לחקור את ההשפעה של ל pneumophila OMVs על שכפול חיידקים THP-1 מקרופאגים, התאים היו מראש מודגרות עם OMVs ולאחר מכן גם נגועעם pneumophila L. (איור 4 א). טרום-גירוי של מקרופאגים THP-1 הנגזרות הראשונה מפחיתה את שכפול חיידקים לאחר 24 שעות של זיהום, אבל זה מוביל הכפלה ב CFU לספור בנקודת זמן מה לאחר מכן (48 pi ח). ההשפעה של קולטן דמוי אגרה (TLR) איתות על הכרת OMV בעקבות הזיהום של מקרופאגים ניתן להעריך על ידי mBMDM, כמוצג באיור 4 B. עליות שכפול חיידקים על ידי פי עשרה mBMDM מחיות WT לאחר הדגירה מראש OMV, בעוד TLR2 - / - ו טריף / MyD88 - / - תאים לא מראים עלייה זו שכפול pneumophila ל.

figure-results-1455
איור 1: נוהל ניסיוני. (א) ל pneumophila Corby WT מ -10 ס"מ BCYE צלחות אגר משמשים לחסן תרבות נוזלי קטן (10 מ"ל), אשר מועבר לתוך 90 מ"ל של ייב טרייםבינוני לאחר 6 שעות. נפח קטן גם הוא מצופה על צלחת אגר דם כדי לבדוק את טוהר. חיידקים מודגרת על 37 מעלות צלזיוס עד השלב נייח מוקדם (OD 600 = 3.0-3.5). (ב) התרבות הנוזלית היא centrifuged ו-מסונן סטרילי כדי להסיר את החיידקים. את supernatant הלגיונלה -חינם הוא ultracentrifuged אז להשיג גלולה OMV, אשר resuspended ב PBS ultracentrifuged שוב. השלפוחית ​​המבודדת הן resuspended, בדק עבור טוהר, לכמת את כמות החלבון. סרגל הסולם מייצג 2.5 סנטימטר. (C) מקרופאגים אדם או בעכברים הם מגורה עם OMVs הניתן לכימות. את supernatant תרבית תאים יכול לשמש ELISA, או מקרופאגים יכול להיות נגוע pneumophila L. לקבוע שכפול חיידקים על ידי assay CFU על 10 ס"מ BCYE צלחות אגר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2662
איור 2: הפעלה פרו-דלקתית של תאי THP-1 על ידי ל 'pneumophila OMVs. (א) הנה, הקו הסלולרי THP-1 monocytic משמש כמודל מקרופאגים מכתשיים. PMA הבדיל THP-1 התאים טופלו עם הגדלת מינון של ל pneumophila OMVs (0.01-25 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 24 ו -48 שעות, בהתאמה. את supernatant התא ללא שמש IL-8 ELISA. הערכים הממוצעים של שלושה ניסויים עצמאיים ± SEM מוצגים. תאי THP-1 הגיבו קטן כמו 0.01 מיקרוגרם / מיליליטר ל pneumophila OMVs עם הפרשת IL-8 משמעותית, שהייתה לזמן, תלוי מינון. (ב) ל pneumophila OMVs (0.1-10 מיקרוגרם / מ"ל) שימשו כדי לעורר תאי PMA הבדיל THP-1. Supernatant היה שנאסף לאחר 24 ו -48 שעות של דגירה, ואת שוחרר IL-6 נמדד supernatant באמצעות ELISA. הערכים הממוצעים של שלושה ניסויים עצמאיים ± SEM מוצגים. THP-1 תאים המופרשים כמויות משמעותיות של IL-6, אפילו עם המינון הנמוך ביותר של OMVs (0.1 מיקרוגרם / מ"ל). הפרשת IL-6 מוגברת עם הגדלת מינונים OMV ועם פעמים דגירה ממושכת. סטטיסטיקות: מבחן מאן-ויטני; * P <0.05 ו ** p <0.01 לעומת OMV 0 מיקרוגרם / מ"ל ​​המקביל. הודפס מחדש באישור ההפניה 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-4039
איור 3: ההפעלה פרו-הדלקתית של מקרופאגים תלוי TLR2 / 4. mBMDM מ WT ו TLR2 / 4 - / - עכברים הודגרו עם L. pneumophila OMVs (0.1 או 1 מיקרוגרם / מ"ל). הפרשת CXCL1 נותחה על ידי ELISA לאחר 24 ו -48 שעות, בהתאמה. הערכים ממוצעים ± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים מוצגים. mBMDM מעכברי WT הגיב עם הפרשת CXCL1 תלוי מינון לאחר דגירה ל pneumophila OMV. TLR2 / 4 - / - mBMDM מופרש באופן משמעותי פחות CXCL1 לעומת WT mBMDM, והפרשה זה לא להגדיל את המינון-באופן תלוי. סטטיסטיקות: מבחן מאן-ויטני; * P <0.05 לעומת OMV 0 מיקרוגרם / מ"ל ​​המקביל; #p <0.05 לעומת מדגם WT יחס שווה. הודפס מחדש באישור ההפניה 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-5004
איור 4: ל pneumophila OMV הדגירה מראש עליות חיידקי שכפול מקרופאגים. (א) הבדיל THP-1 התאים היו מראש מודגרות עם OMVs (0.1, 1, או 10 μ; G / מ"ל) או LPS / IFN-γ (200 ng / mL כל אחד) או נותרו ללא טיפול לשליטה. לאחר הדגירה מראש (20 שעות), תאים THP-1 נדבקו ל pneumophila Corby WT (משרד הפנים 0.5) עבור 2, 24, ו 48 שעות, בהתאמה. תאים THP-1 היו lysed על ידי תוספת של saponin, ואת החיידקים היו מצופה על צלחות אגר BCYE. CFUs חושבו ביחס 0 מיקרוגרם / מ"ל ​​OMV אחרי כל נקודת זמן. העמודות אלו מייצגות ערכים הממוצעים ± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים, כל לבצעו כפילויות טכניות. לא נמצאו הבדלים ב ספיגת בקטריאלי (2 שעות לאחר זיהום (pi)) בהשוואה לא התאים מראש שטופלו. שינויים שכפול חיידקים נקבעו לאחר 24 ו -48 שעות, בהתאמה. LPS / IFN-γ טרום טיפול THP-1 תאים הראו ירידה pi h 24 עומס חיידקי זה גם נצפתה במינון באופן תלוי עבור תאים טרום שטופלו ל pneumophila OMV. בנקודת זמן מה לאחר מכן (48 pi ח), OMV טרום טיפול THP-1 תאים הראו הכפלת מחדש pneumophila L.קפול, ואילו LPS / IFN-γ מקרופאגים טרום טיפול הראו ירידה נוספת של עומס חיידקים. סטטיסטיקות: מבחן מאן-ויטני; * P <0.05 ו ** p <0.01 לעומת OMV 0 מיקרוגרם / מ"ל ​​המקביל. (ב) mBMDM מעכברים עם רקע גנטי שונה (WT, TLR2 - / -, ו טריף / MyD88 - / -) היו מראש מודגרות עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל ל pneumophila OMVs במשך 20 שעות ולאחר מכן נדבקו עם flagellin- מוטציה לקויה של ל pneumophila Corby (משרד הפנים 0.5) במשך 48 שעות. mBMDM היו lysed על ידי תוספת של saponin, ואת הלגיונלה היו מצופה על צלחות אגר BCYE. את CFU חושב ביחס 0 מיקרוגרם / מיליליטר OMV, שמסומן על ידי הקו המוצק. הברים מייצגים את הערכים הממוצעים ±± SEM של שלושה ניסויים בלתי תלויים, כל לבצעו כפילויות. mBMDM מעכברי WT הראה עלייה שכפול pneumophila L. לאחר טיפול מקדים OMV. TLR2 - / - מקרופאגים הראו ירידה משמעותית שכפול הלגיונלה, אשר היה דומה טריף / MyD88 - / - mBMDM. סטטיסטיקות: מבחן מאן-ויטני; p <0.05 לעומת מדגם WT. הודפס מחדש באישור ההפניה 20. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

OMVs של חיידקים פתוגנים ואת ההשפעה של שלפוחית ​​קרום אלה על תאי היעד שלהם כרגע נלמד באופן אינטנסיבי. לדוגמה, perfringens Clostridium -derived OMVs לעורר הפרשת ציטוקינים ב מקרופאגים, לימפוציטים מסוג B יכול להיות מופעל על ידי OMVs מ Borrelia burgdorferi, ו הליקובקטר פילורי -released שלפוחית הממברנה יכול לפעול על תאי אפיתל קיבה 21, 22, 23. ל pneumophila, פתוגן תאי שיכול לגרום צורה חמורה של דלקת ריאות לא טיפוסי, גם משחרר OMVs כי הם מסוגלים להפעיל תאי אפיתל ריאות מקרופאגים 16, 19. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידוד בקנה מידה קטן של ל pneumophila OMVs מתרבות נוזלי ללמוד את התפקיד הפוטנציאלי של OMVs דלקת ריאות. זה קריטי לעבוד תחת קונדיט סטרילייונים כדי לשלול זיהום מחיידקים אחרים כדי להשיג pneumophila ל טהור -derived הכנה OMV. בידודו של OMVs כולל צעד סינון דרך הנקבוביות 0.22 מיקרומטר כדי למנוע זיהום של גלולה OMV שהושג עם pneumophila ל ', למרות שזה מקטין את התשואה OMV, מאז OMVs הגדול הם איבדו אחר צעד סינון זה.

יתר על כן, בדקנו את התגובה של מקרופאגים אדם murine לאלה שלפוחית מבודדת תאים נגועים עם pneumophila ל ביתר דיוק משוער מצב דלקת ריאות הלגיונלה, שם OMVs משתחררים בתוך LCV ידי חיידקים תאיים 15. מינוני OMV המועסקים היו מוערכים בהתאם לסכום OMV החופשי זיהום במבחנה של מקרופאגים אדם לאחר 24 שעות של דגירה (מתואר התייחסות 20). עבור הגירוי של תאי נמען אחרים או בניסויי vivo,מינוני OMV אחרים עשויים להיות נחוצים וצריכים הוקמו. הניתוח של השפעת L. pneumophila OMVs מייצג התקדמות לפרוטוקול שתיאר Jager ו שטיינהרט 24.

הנה, PMA בדיל THP-1 תאים לשמש מודל עבור מקרופאגים מכתשיים בשל ההיצע המוגבל של חומר אנושי עיקרי. התוספת של PMA מבדיל בין תאי THP-1 monocytic לתאים מקרופאג דמוי 25. יתר על כן, הם קו תא מודל ידוע pneumophila ל שמלומד 26. מלבד שורת תאים monocytic האנושי הזה, תאי mBMDM משמשים. mBMDM הם מקובל לחקר ההשפעות של ל pneumophila 27, 28, 29. האפשרות להשתמש knockouts הגנטי TLRs שונה או חלבונים אחרים ולגרום להם כלי רב ערך ללימוד תופעות OMV. ב ORDאה כדי להפחית את כמות עכברים בכל ניסוי, mBMDM משמש במקום מקרופאגים מכתשיים בשל המגבלות של מקרופאגים. ניסויי מפתח עשויים לדרוש מקרופאגים מכתשיים למתן תוקף.

מלבד פרוטוקול בזאת המתואר של ultracentrifugation לטהר OMVs, אפשר לבצע צנטריפוגה שיפוע צפיפות, אשר נכלל בפרוטוקול ידי Chutkan et al. 30. זה יכול לשפר את הטוהר של התכשיר OMV השיג ולהפחית את כמות אגרגטים חלבון מטוהרים שיתוף, flagellin, ו LPS. טוהר הכנת OMV המתקבל ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים או על ידי ניתוח מעקב nanoparticle כצעד משלים בקרת איכות. זה יכול לספק אמצעי נוסף של כימות, מעבר הליך מדידת חלבון המוצגת כאן. לחלופין, ריכוז LPS ניתן לנתח על ידי מבחן lysate Limulus amebocyte. אם התשואה OMV היא נמוכה,צעד ריכוז נוסף באמצעות מסנני צנטריפוגלי יכול להתבצע, דבר שלא נעשה כאן. אם התשואה הייתה נמוכה מהצפוי, OMVs שהושלך.

במסגרת המאמץ המתמשך להבהיר את המנגנונים ביולוגיים ופונקציות מאחורי OMVs, השפעת תנאי לחץ שונים על ייצור OMV יכולה להיבדק. מניעת מזון, שינויי טמפרטורת דגירה, או חשיפה לחומרים מזיקים עלולות להשפיע על הפרשת OMV 31. בתנאי עקה אפשריים הם דנו בפרוטוקול ידי Klimentova ו Stulik 32. יתר על כן, יתר או hypovesiculating ל מוטנטים pneumophila יכול להיווצר. הכנות OMV השונות ניתן תהיינה לנתח ניסויי זיהום עם מקרופאגים, explants רקמת ריאה האנושית (מתואר התייחסות 17), או אפילו במודלי in vivo. מלבד התפקיד של OMVs איתות חיסון מולד, השפיע בתקשורת חיידקיםניתן לטפל באופן ניסיוני. יתר על כן, את ההשפעה של מפלי איתות חיסוניים שונים מולד עשויה להיות מנותחת על ידי השימוש בתאי נוקאאוט בעכברים או דור CRISPR / Cas9 נוק-אאוט שורות תאים אנושיים. מחקר בסיסי זה ב OMVs יסייע בפיתוח אסטרטגיות חיסון חדשים, אשר כבר קיימות עבור B דלקת קרום המוח מועברים על ידי meningitides Neisseria 33.

החל מן הפרוטוקול על בידוד ואפיון OMV, אפשר ליישם את זה על חיידקים גראם שליליים אחרים לתאי המארח אחרים; זה צריך להיות מותאם רק לצמיחה של החיידקים בתרבות נוזלית. הפרוטוקול בהוצאת Chutkan et al. מספק מידע מפורט על הדור של OMVs מ coli Escherichia ו Pseudomonas aeruginosa 30. התרבות צריכה לא להגיע בשלב נייח מאוחר כדי להימנע מהעלאות בחיידקים lysed וחלבונים זיהום ומםbranes. בנוסף, מינון OMV משמש גירוי של תאי המארחים צריך להיקבע על פי כמות ה- OMVs במהלך זיהומי in vivo, תוך הקפדה על שיעור נמוך של רעילות. בדרך זו, את התפקיד פתולוגית של OMVs, השפיע על תקשורת בין-מינים, ואינטראקציות מארח הפתוגן יכול להיבחן.

כדי להמשיך ללמוד את התפקיד של ל pneumophila OMVs דלקת ריאות, הכנות OMV סטנדרטיות עם תשואות מספיק ניסויי זיהום דומים נדרשות. פרוטוקול זה יעזור לתקנן נהלי בידוד להאריך מחקרי OMV כדי חיידקים גראם שליליים אחרים לתאים מארחים אחרים. יתרה מזאת, מחקר יהנה מפורט בידע במבחנה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להרחיב את הניסויים להגדרות in vivo. בעתיד, פרוטוקול זה יכול להתארך עד הבידוד של OMVs מחומר ביולוגי ראשוני, כגון סרום או lav ברונכואלוואולריתנוזל גיל, כדי לקבל תובנות לגבי הרכב OMVs שוחרר לביתו בתנאים פיזיולוגיים. זה יעזור לקבוע פרמטרים מרכזיים של הרכב OMV וכדי להבין את המאפיינים של במבחנה OMVs -generated.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים פרופ 'ד"ר מרקוס Schnare לספק לנו TLR2 - / - ו TLR2 / 4 - / - עכברים פרופ' ד"ר קרסטן Kirschning עבור טריף / MyD88 - / - עכברים. חלקים של עבודה זו מומנה על ידי Bundesministerium für Bildung und Forschung (ה: miRSys ביו - FKZ 0316175B, דואר: מד CAPSYS - FKZ 01X1304E; http://www.bmbf.de/), דויטשה Forschungsgemeinschaft (SFB / TR-84; http://www.sfb-tr84.de/), ו Hessisches Ministerium für Wissenschaft und Kunst (RNomics רפואי LOEWE - FKZ 519/03 / 00.001- (0003); http://www.proloewe.de/medicalrnomics), כל כדי BS.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dishSarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany)82.1473
70 Ti rotorBeckman Coulter Incorporation (California, USA)337922
ACESCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)9138.2
activated charcoalCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)X865.2
agar-agar, Kobe ICarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)5210.2
Columbia agar with 5% sheep bloodBecton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)254005
cuvettesSarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany)67.742
ELISA (human)BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germany)IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murine)DuoSet, R&D (Minneapolis, USA)CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2OCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)5632.1
Fetal calf serum (FCS)Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)10270-106
Heracell 240i CO2 incubatorThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)40830469
Heraeus Multifuge X3RThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)75004515
Inoculation loop Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germany)86.1567.010
KOHCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)6751.1
L. pneumophila Corby------kindly provided by Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlin, Germany)
L. pneumophila Corby ΔflaA------kindly provided by Prof Dr Klaus Heuner (RKI, Berlin, Germany)
L-cysteinCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)
mBMDM------kindly provided by Prof Dr Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germany) and Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBSBiochrom GmbH (Berlin, Germany)L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetateSigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)P8139-1MG
rotating shaker (MaxQ 6000)Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)SHKE6000
RPMI 1640 high glucoseLife Technologies GmbH (Darmstadt, Germany)11875-093
saponinCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)9622.1
Ultrospec 10Biochrom Ltd (Cambridge, England)80-2116-30
sterile filter (pore size: 0.22 µm)Corning Incorporated (new York, USA)431096
THP-1Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SEThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)
yeast extractCarl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germany)2363.2
Pierce BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germany)23225

References

  1. Cambronne, E. D., Roy, C. R. Recognition and delivery of effector proteins into eukaryotic cells by bacterial secretion systems. Traffic. 7 (8), 929-939 (2006).
  2. Ellis, T. N., Kuehn, M. J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (1), 81-94 (2010).
  3. Beveridge, T. J. Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles. J Bacteriol. 181 (16), 4725-4733 (1999).
  4. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes Dev. 19 (22), 2645-2655 (2005).
  5. Chi, B., Qi, M., Kuramitsu, H. K. Role of dentilisin in Treponema denticola epithelial cell layer penetration. Res Microbiol. 154 (9), 637-643 (2003).
  6. Kolling, G. L., Matthews, K. R. Export of virulence genes and Shiga toxin by membrane vesicles of Escherichia coli O157:H7. Appl Environ Microbiol. 65 (5), 1843-1848 (1999).
  7. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. J Biol Chem. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  8. Dorward, D. W., Schwan, T. G., Garon, C. F. Immune capture and detection of Borrelia burgdorferi antigens in urine, blood, or tissues from infected ticks, mice, dogs, and humans. J Clin Microbiol. 29 (6), 1162-1170 (1991).
  9. Mashburn, L. M., Whiteley, M. Membrane vesicles traffic signals and facilitate group activities in a prokaryote. Nature. 437 (7057), 422-425 (2005).
  10. Kesty, N. C., Mason, K. M., Reedy, M., Miller, S. E., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli vesicles target toxin delivery into mammalian cells. EMBO J. 23 (23), 4538-4549 (2004).
  11. Abu Kwaik, Y., Gao, L. Y., Stone, B. J., Venkataraman, C., Harb, O. S. Invasion of protozoa by Legionella pneumophila and its role in bacterial ecology and pathogenesis. Appl Environ Microbiol. 64, 3127-3133 (1998).
  12. Winn, W. C., Myerowitz, R. L. The pathology of the Legionella pneumonias. A review of 74 cases and the literature. Hum Pathol. 12 (5), 401-422 (1981).
  13. Ge, J., Shao, F. Manipulation of host vesicular trafficking and innate immune defence by Legionella Dot/Icm effectors. Cell Microbiol. 13 (12), 1870-1880 (2011).
  14. Hubber, A., Roy, C. R. Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors. Annu Rev Cell Dev Biol. 26, 261-283 (2010).
  15. Fernandez-Moreira, E., Helbig, J. H., Swanson, M. S. Membrane vesicles shed by Legionella pneumophila inhibit fusion of phagosomes with lysosomes. Infect Immun. 74 (6), 3285-3295 (2006).
  16. Galka, F., et al. Proteomic characterization of the whole secretome of Legionella pneumophila and functional analysis of outer membrane vesicles. Infect Immun. 76 (5), 1825-1836 (2008).
  17. Jager, J., et al. Human lung tissue explants reveal novel interactions during Legionella pneumophila infections. Infect Immun. 82 (1), 275-285 (2014).
  18. Ellis, T. N., Leiman, S. A., Kuehn, M. J. Naturally produced outer membrane vesicles from Pseudomonas aeruginosa elicit a potent innate immune response via combined sensing of both lipopolysaccharide and protein components. Infect Immun. 78 (9), 3822-3831 (2010).
  19. Jager, J., Keese, S., Roessle, M., Steinert, M., Schromm, A. B. Fusion of Legionella pneumophila outer membrane vesicles with eukaryotic membrane systems is a mechanism to deliver pathogen factors to host cell membranes. Cell Microbiol. , (2014).
  20. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila-Derived Outer Membrane Vesicles Promote Bacterial Replication in Macrophages. PLoS Pathog. 12 (4), (2016).
  21. Jiang, Y., Kong, Q., Roland, K. L., Curtiss, R. Membrane vesicles of Clostridium perfringens type A strains induce innate and adaptive immunity. Int J Med Microbiol. 304 (3-4), 431-443 (2014).
  22. Whitmire, W. M., Garon, C. F. Specific and nonspecific responses of murine B cells to membrane blebs of Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 61 (4), 1460-1467 (1993).
  23. Ismail, S., Hampton, M. B., Keenan, J. I. Helicobacter pylori outer membrane vesicles modulate proliferation and interleukin-8 production by gastric epithelial cells. Infect Immun. 71 (10), 5670-5675 (2003).
  24. Jager, J., Steinert, M. Enrichment of outer membrane vesicles shed by Legionella pneumophila. Methods Mol Biol. 954, 225-230 (2013).
  25. Park, E. K., et al. Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli. Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).
  26. Casson, C. N., et al. Human caspase-4 mediates noncanonical inflammasome activation against gram-negative bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (21), 6688-6693 (2015).
  27. Molofsky, A. B., Shetron-Rama, L. M., Swanson, M. S. Components of the Legionella pneumophila flagellar regulon contribute to multiple virulence traits, including lysosome avoidance and macrophage death. Infect Immun. 73 (9), 5720-5734 (2005).
  28. Isaac, D. T., Laguna, R. K., Valtz, N., Isberg, R. R. MavN is a Legionella pneumophila vacuole-associated protein required for efficient iron acquisition during intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (37), 5208-5217 (2015).
  29. Zhu, W., et al. Sensing cytosolic RpsL by macrophages induces lysosomal cell death and termination of bacterial infection. PLoS Pathog. 11 (3), 1004704 (2015).
  30. Chutkan, H., Macdonald, I., Manning, A., Kuehn, M. J. Quantitative and qualitative preparations of bacterial outer membrane vesicles. Methods Mol Biol. 966, 259-272 (2013).
  31. Macdonald, I. A., Kuehn, M. J. Stress-induced outer membrane vesicle production by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 195 (13), 2971-2981 (2013).
  32. Klimentova, J., Stulik, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiol Res. 170, 1-9 (2015).
  33. . Novartis.com Available from: https://www.novartis.com/news/media-releases/novartis-bexsero%C2%AE-vaccine-approved-fda-prevention-meningitis-b-leading-cause (2016)

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

120Pneumophilaultracentrifugation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved