בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Summary

מחקר זה מציג שיטה סטנדרטית ומאומתים עבור בידוד והתרבות של סטרומה רירית הרחם העכבר העיקרי ותאי אפיתל, אשר ניתן להשתמש בהם במערכת coculture ללמוד decidualization במבחנה.

Abstract

Decidualization הוא תהליך התמיינות תלוי פרוגסטרון של תאי סטרומה רירית רחם הוא תנאי הכרחי להשתלת עובר מוצלחת. למרות מאמצים רבים נעשו כדי לחשוף את המנגנון הבסיסי של decidualization, האיתות המדויקת בין תאי אפיתל כי נמצאים בקשר עם העובר ואת בתאי סטרומה הבסיסיים נותרה הבינה היטב. לכן, לומד decidualization באופן שלוקח הוא אפיתל ותאי סטרומה בחשבון יכול לשפר את הידע שלנו לגבי הפרטים המולקולריים של decidualization. לשם כך, במודלים vivo של decidualization מלאכותית פיזיולוגית הרלוונטי ביותר; עם זאת, מניפולציה של תקשורת בין תאית מוגבלת. נכון לעכשיו, בתרבויות במבחנה של תאי סטרומה רירית רחם נמצא בשימוש כדי לחקור את האפנון של decidualization ידי מספר מולקולות איתות. כמקובל, תאי סטרומה אדם או עכבר רירית רחם הםמְשׁוּמָשׁ. עם זאת, את הזמינות של דגימות אנושיות לעתים קרובות מאוד מוגבלת. יתר על כן, השימוש ברקמות murine מלווה במגוון בשיטת culturing. מחקר זה מציג שיטה תוקפת סטנדרטית להשיג תא רירית רחם אפיתל טהור (EEC) ו- Cell סטרומה (ESC) תרבויות באמצעות עכברים שלמים מבוגרים שטופלו באסטרוגן במשך שלושה ימים רצופים. הפרוטוקול הוא מותאם כדי לשפר את התשואה, כדאיות, וטוהר של התאים הוארך נוסף על מנת ללמוד decidualization בתוך coculture של EEC ו- ESC. מודל זה עשוי להיות מתאים כדי לנצל את החשיבות של שני סוגי תאים decidualization וכדי להעריך את התרומה של מולקולות איתות משמעותי המופרשים EEC או ESC במהלך תקשורת בין תאית.

Introduction

רירית הרחם האנושית הוא הציפוי הפנימי של הרחם עובר מחזורים חודשיים של התמוטטות ותיקון כהכנת הריונות אפשריים. הוא מורכב בשכבה אחת של תאי אפיתל המצפים את לומן הרחם ואת stroma הבסיסית אשר משתנה עובי פי תנודות של אסטרוגן הורמונים בשחלות ופרוגסטרון. בשלב הלוטאלי, עלייתו פרוגסטרון postovulatory תהיה להשרות התמיינות של תאי סטרומה רירית רחם אל, תאי decidual עגולים גדולים, תהליך הנקרא decidualization ^{1, 2.} ב אדם, תופעה זו מתרחשת באופן ספונטני כדי ליצור את predecidua, אבל הופך בולט יותר על השתלת העובר. תוצאה תפקודית של decidualization היא שהרחם זמני הופך פתוח השתלה עוברת. מרווח זה מסומן כמו "החלון של השתלה". במהלך התקופה המוקדמת של השתלה עוברת, דואר decidualizedתאי ndometrial סטרומה סביב עובר ההשתלה יספקו מחסום למנוע המעבר של חומרים מזיקים לעובר ^3. במהלך הריון, decidua זו תספק חומרי הזנה עבור העובר המתפתח לפני placentation שקרה, ובהמשך תהווה את החלק האימהי של השליה ^4.

שיקולים אתיים ומעשיים להגביל את העיצוב של מחקרים בבני אדם כדי לחקור את תהליך decidualization ו יש הנחיות השימוש במודלים של בעלי חיים. להיות חבר בקבוצת placentation hemochorial, האנדומטריום של מכרסמים יעבור גם decidualization לפני placentation ^5. במכרסמים, לעומת זאת, תחילת תהליך decidualization תלוי בנוכחות של blastocysts לומן הרחם, המציין כי גירוי נוסף יש צורך יפעיל את התגובות decidual ^6. זה מתווה תקשורת מורכבת שבין הדואר רירית רחם אפיתל תאים שיש קשר ישיר עם הבלסטוציסט, ואת בתאי סטרומה הבסיסיים. אף על פי כן, decidualization יכול להיגרם באופן מלאכותי באמצעות גירויים כמו גירוד מכאני או ההחדרה של שמן רחם דרוך הורמונלית. למרות שמחקרי in vivo באמצעות מודלי decidualization מלאכותיים אפשרו לנו לשפר את תובנה שלנו בתהליך האיתות המורכב של decidualization, המחקרים מעמיקים מכניסטית, למשל, חקירת התקשורת ההכרחית בין תאי אפיתל סטרומה, מוגבלת. לכן, במבחנה מחקרים decidualization ניתן להשתמש כדי לתפעל מסלולים חשובים וללמוד תהליכים בסיסיים. לשם כך, תרביות תאי סטרומה רירית רחם עיקריות ניתן להגדיר מ רירית רחם אדם או מכרסמים. העסקת מכרסמים מסכימה השימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית כדי לחקור את התפקיד של חלבון מסוים של עניין בתהליך decidualization. עם זאת, לא בוגר, prepuberעכברי ty משמשים לעתים קרובות כדי למנוע סיבוכים של מחזור הייחום, בעוד שבמקרים אחרים uteri נאסף מכל שלבי מחזור הייחום, שתוצאתה ההטרוגניות התרבויות. יתר על כן, בתהליך של decidualization נחקר פרוטוקולים שונים, למשל, על ידי (i) הורמונים וישלימו (אסטרוגן, פרוגסטרון או monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP)) למדיום culturing, או על ידי (ii) בידוד של תאי decidual מעכברים בבית יום 4.5 של (פסאודו) הריון, אשר הביקוש להם צורך נוסף לבדיקת תקע וזכרים שעוקרים. מגבלות אלו האחרונות ממחישות את הצורך של שיטה סטנדרטית ללמוד decidualization במבחנה. במחקר זה, מודל פיסיולוגי לבחון במבחנת decidualization החל מבוגר, שאינם (פסאודו) עכברות הרות יוצגו. בשיטה זו, זריקה יומית של 17β-אסטרדיול (E2) תניע תרבות תאים של רירית רחם, ותוצאה היא תשואה מוגברת של הומוגנית pאוכלוסיות תאי יור. יתר על כן, השימוש של מערכת coculturing מאפשר לימוד של crosstalk-סטרומה אפיתל היכולת לתפעל את תהליך decidualization ברמות שונות.

Protocol

AlexaFluor

כל הניסויים בבעלי חיים לצורך מחקר זה אושרו על ידי ועדת הביקורת האתית של לובן KU (בלגיה) (פרויקט P174 / 2013). עכברים שוכנו בתנאים סטנדרטיים, עם גישה כרצונך מודעה כדי כדורי מזון ומי ברז, והמשיכו בתנאים מבוקרים (23 ± 1.5 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 40 - 60%, 12/12 מחזור אור / חושך).

1. עכברים

1. לשימוש מסחרי זן עכבר זמין (כלומר C57Bl / 6, נקבה 8 - בן 12 שבועות). בדרך כלל, 4 - 5 עכברים יניבו כמות מתאימה של תאים עבור ניסויים נוספים.
2. להזריק עכברים שלמים מתחת לעור עם 100 μL של-אסטרדיול 17β (E2) פתרון (100 ng / 100 μL) עבור 3 ברציפות ד לפני הבידוד כדי לתקנן את השלב של מחזור הייחום של החיות כדי לגרום לשגשוג של רירית הרחם תאים. הצורך לבדוק בשלב המחזור של העכברים לפני תחילת הפרוטוקול זה להיות מיותרסיבת הטיפול אסטרדיול 3 ד '.

2. תכשירים

1. בצע פתרון של 100 ng / 100 μL E2 ב arachis שמן. את הזריקות של חמישה עכברים (כמתואר 1.2), בסכום של 1.5 מ"ל הוא זקוק.
   1. ממיסים 1 מ"ג E2 ב 1 אתנול מ"ל יש פתרון המניות של 1 מ"ג / מ"ל.
   2. לדלל פתרון מניות זה 1: 1,000 בשמן arachis.
2. הפוך 500 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של האנק (HBBS) 1x השלימו עם 100 פניצילין U / mL ו -100 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (המכונה נוספת כמו HBSS +).
3. הפוך 500 מ"ל של תא מסונן עכבר רירית הרחם סטרומה (המסקלין) בינוני עד המסקלין תרבות: F12 תערובת בינוני הנשר שונה של Dulbecco / מזון (DMEM / F12) עם פנול אדום, L- גלוטמין ו 4- (2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה, N - (2-Hydroxyethyl) piperazine- N '- (חומצה 2-ethanesulfonic) (HEPES) המכיל 10% FBS, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל amphotericin B, ו- 100 מיקרוגרם / מ"ל גנטמיצין (פוrther המכונה בינוני המסקלין).
4. הפוך 500 מ"ל של מדיום המסקלין מסונן 2% לתרבות המסקלין במהלך decidualization: DMEM / F12 עם פנול אדום, L- גלוטמין ו HEPES המכיל 2% FBS, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B, ו- 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​גנטמיצין.
5. הכן 500 מ"ל של תא מסונן עכבר רירית הרחם אפיתל (MEEC) בינוני: DMEM המכיל 10% FBS, 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​amphotericin B, 100 מיקרוגרם / גנטמיצין מ"ל, 25% MCDB-105 בינוני, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​אינסולין (המכונה נוספת כמדיום MEEC).
6. כן פולי- L- ליזין (PLL) coverslips מצופה לתרבות המסקלין.
   1. ממיסים 25 מ"ג של PLL ב 250 מ"ל של מים מזוקקים. סנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר.
   2. הוסף coverslips סטרילי בצלחת 12-היטב. הוספת 300 μL של מומס PLL על coverslips.
   3. הסר את הפתרון לאחר 30 דקות של דגירה. הצלחות יכולות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף (עד 1 - 2 חודשים).
7. הכן פתרון המניות 10 מ"ג / מ"ל ​​oסוג collagenase ו IA ולאחסן aliquots של 300 μL ב -20 ° C. מסנן לפני השימוש.

3. הכנות דרושות 24 שעות לפני הבידוד

1. כן coverslips קולגן מצופה לתרבות MEEC.
   1. הכן פתרון חומצה 0.02 M אצטית במים מזוקקים (1 מ"ל לכל coverslip).
   2. הוספת 150 μL הקולגן 12 מ"ל של 0.02 M חומצה אצטית כדי לקבל ריכוז סופי של 50 מיקרוגרם / מ"ל.
   3. הוסף coverslips סטרילי בצלחת 12-היטב.
   4. הוסף 1 מ"ל של הפתרון קולגן (ראה 3.1.2).
   5. דגירה O / N (h 12 מינימום) על 37 מעלות צלזיוס.
      במהלך בידוד:
   6. הסר את הפתרון קולגן את coverslips על ידי שאיבה ולתת לו אוויר יבש בסביבה סטרילית (בקבינט זרימה למינרית).
   7. שטפו את coverslips פעמיים עם בופר פוספט (PBS).
2. הכן פתרון 2.5% pancreatin על ידי הוספת 0.25 גרם pancreatin בתוך שפופרת הקנונית 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל שלHBSS +. Shake (200 סל"ד) הפתרון על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 כדי להגדיל את המסיסות. חנות ב 4 מעלות צלזיוס.

בידוד 4. והתרבות של תאי אפיתל רירית רחם העכבר (MEEC) ועכבר רירית רחם סטרומה תאים (המסקלין)

1. הוסף 25 מ"ג של טריפסין בתוך שפופרת 15 מ"ל המכיל פתרון 2.5% pancreatin (ראה 3.2) כדי לגמור עם הפתרון הסופי המכיל טריפסין 0.25% (המכונה נוספת כמו תערובת העיכול המסקלין).
2. בידוד של uteri
   1. בדוק את שלב המחזור של החיות עם בחינה למרוח בנרתיק.
      1. לרסן את החיה ולשטוף את הנרתיק בעדינות עם 50 μL PBS 3 - 5 פעמים.
      2. אסוף את הסומק הסופי בשקופית זכוכית.
      3. בדוק את החומר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר באמצעות מטרת 10X או 20X.
      4. רק משתמשים בעכברים כי נמצאים בשלב ייחום. שלב זה מאופיין על ידי נוכחות של תאים cornified אפיתל של שטיפה וגינלית (איור 1 ).
   2. להרדים את החיות באמצעות השיטה המתאימה כגון נקע בצוואר הרחם או CO ₂ הרדמה -induced.
   3. רסס את הפגרים עם 70% אתנול על מנת לייצר סביבת סטרילית.
   4. שימוש בכלי ניתוח סטרילי, לפתוח את הבטן ולדחוף את המעיים הצידה כדי להמחיש הן קרני הרחם.
   5. תפוס את קרן הרחם בקצה הדיסטלי ביותר תחת החצוצרה. לנתח את קרני הרחם מן החצוצרה ולהסיר שומן ורקמת חיבור. חותכים את הצופר בקצה הדיסטלי מעל לגוף הרחם ומניחים אותו בצלחת פטרי 35 מ"מ עם 3 מ"ל של HBSS +.
      1. חזור על שלב זה עבור הקרן השנייה ועבור חיות האחרות עד שכל קרן הרחם נאספת.
   6. נקו את קרן הרחם (ב HBSS +) נוסף תחת stereoscope ולהסיר את כל השומן שיורית או רקמת חיבור.
   7. חותכים את קרני הרחם פתוח longitudinally לחשוף את לומן הרחם ולהחליף הצופר דואר בצלחת פטרי חדשה עם + HBSS הטרי.
   8. להעביר את כל קרני הרחם עד 15 הצינור מ"ל המכיל pancreatin טריפסין.
   9. דגירה אופקית במשך 60 דקות ב 4 ° C על שייקר מסלולית (50 סל"ד).
   10. דגירה אופקית במשך 45 דקות ב 23 ° C (RT), בלי לרעוד.
   11. דגירה אופקית במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (אמבט מים), בלי לרעוד.
   12. בינתיים לעשות את המיקס העיכול המסקלין ידי המסת 300 μL של המניה 1 מ"ג / מ"ל ​​collagenase ב 2.7 מ"ל של 0.05% טריפסין- Ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) פתרון.
       הערה: מעתה ואילך, צעדי בידוד נוספים מבוצעים בסביבת סטרילית מתחת לארון זרימה למינרית.
3. תא עכבר רירית הרחם אפיתל (MEEC) תרבות
   1. לאחר 2 שעות של דגירה, ובזהירות לשפוך משם הפתרון supernatant.
   2. מעבירים את uteri לתוך צלחת פטרי המכילה בינוני MEEC קר דגירה במשך 5 דקות כדי להשבית טריפסיןפעילות.
   3. מעבירים את uteri לצינור 15 מ"ל המכיל 3 מ"ל של HBSS קר +.
   4. וורטקס למשך 10 שניות כדי לשחרר את הגיליונות אפיתל.
   5. שוטפים את uteri בצלחת פטרי נקי עם 3 מ"ל HBSS +.
   6. חזור על שלב 4.3.2 - 4.3.4 להשיג סכום כולל של שלוש השעיות המכילות גיליונות אפיתל.
   7. מעבירים את uteri לתערובת העיכול המסקלין דגירה במשך 30 דקות ב 37 ° C תוך רועד (200 סל"ד) (עבור לשלב 4.4 לבידוד נוסף של המסקלין).
   8. שחזור סדיני אפיתל ידי pipetting שלוש השעיות התא בעדינות על רשת ניילון 100 מיקרומטר כדי להסיר שאריות רקמה.
   9. צנטריפוגה השעית התא שנאספה ב XG 500 במשך 5 דקות.
   10. Resuspend גלולה ב 12 מ"ל של מדיום MEEC ומערבבים היטב.
   11. Settle הפתרון במשך 5 דקות על מנת להפריד המסקלין הנותרים באמצעות שקיעה הכבידה.
   12. הסר בזהירות את 2 מ"ל העליון באמצעות פיפטה 5 מ"ל.
   13. צנטריפוגה התא suspension ב XG 500 במשך 5 דקות.
   14. גלולה במדיום MEEC ידי pipetting מעלה מטה בעדינות.
   15. פלייט התאים על coverslips מצופה קולגן בצפיפות הרצויה עבור ניסויים נוספים (איור 2 א).
   16. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO ₂ למשך תקופה מינימלית של 12 שעות.
       הערה: לקבלת immunostaining או ניסויים פונקציונליים כמו הדמית סידן פלורסנט, מומלץ צלחת התאים ישירות על coverslips, תוך זריעה בצלחת 6-היטב מומלצת כאשר RNA או חלבון הבידוד הוא רצוי. בידוד של תאי סטרומה עכבר רירית רחם מחולק לשני סיבובים כמו הטוהר של התאים לאחר רק עיכול אחד יכול להיות מספיק. Uteri מתעכל פעמים בגין הבראה אופטימלית תא וטוהר. בשני סיבובי ההתערבויות הטכניות זהות. תאים שנאספו סיבובים שניהם יכולים להישמר עבור ניסויים נוספים, לפי הצורך על ידי החוקר.
4. עכבר רירית הרחם StrCell omal (המסקלין) תרבות: 1 ^st עגול
   1. לפני תחילת סיבוב העיכול הראשון, להכין תערובת עיכול שנייה על ידי המסת 300 μL של מניית 1 מ"ג / מיליליטר collagenase ב 2.7 מיליליטר 0.05% פתרון טריפסין- EDTA. תמהיל זה נחוץ בשלב 4.4.8.
   2. הכן שלוש צלחות פטרי קטנה עם קר (4 ° C) HBSS + ו -3 x 15 צינורות מ"ל עם 3 מ"ל של מדיום המסקלין (שפופרת X1, X2 ו X3).
   3. לאחר 30 דקות של דגירה, לנער את פתרון טריפסין המכיל uteri בעדינות במשך 10 שניות. תאי המסקלין תנתק מרקמת הרחם יישארו פתרון טריפסין.
   4. מעבירים את uteri המנה הראשונה פטרי המכילה 3 מ"ל קר (4 ° C) HBSS + ולשטוף היטב.
   5. הוסף 3 מ"ל של מדיום המסקלין אל הצינור במקור המכיל את קרני הרחם (צינור בשלב 4.4.3) לעכב פעילות טריפסין.
   6. מעבירים את uteri מצלחת פטרי עם קר (4 ° C) HBSS + כדי X1 צינור המכיל 3 מ"ל של מדיום המסקלין ולנער בעדינות במשך 10 שניות.
   7. חזור על שלבים 4.4.4 (מעבירים לצלחת פטרי עם קר (4 ° C) HBSS +) ו 4.4.6 (העברת צינור X2 ו X3) פעמיים.
      הערה: לבסוף, פרוטוקול זה יגרום 4 השעיות תא: צינור אחד המכיל את פתרון טריפסין ו -3 צינורות עם מדיום המסקלין המכיל המסקלין (צינורות X1, X2 ו X3).
   8. העבר uteri בעיכול המסקלין החדש, כמתואר בשלב 4.4.1 דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, אנכית.
   9. אוסף את תאי סטרומה ידי העברת ארבעת המתלים התא דרך רשת ניילון 40 מיקרומטר. שוטף את הרשת עם 5 מיליליטר נוסף של המסקלין.
   10. צנטריפוגה השעית התא XG ב 500 במשך 7 דקות.
   11. Resuspend גלול ב המסקלין צלחת על coverslips מצופה PLL עבור ניסויים נוספים עם הצפיפות הרצויה.
   12. דגירה למשך תקופה מינימלית של 4 - ח 6 או O / N ב 37 מעלות צלזיוס חממה ₂ 5% CO.
5. תא סטרומה עכבר רירית הרחם (המסקלין) תרבות: 2 ^nd עגול
   1. הכן שלוש צלחות פטרי קטנה עם קר (4 ° C) HBSS + ו -3 x 15 צינורות מ"ל עם 3 מ"ל של מדיום המסקלין (צינורות Y1, Y2 ו Y3).
   2. חזור על שלבי 4.4.3 - 4.4.7.
   3. מעביר את השעית התא האחרונה יחד עם uteri על רשת ניילון 40 מיקרומטר.
   4. אוספים את התאים סטרומה על ידי העברת התוכן של Y1 צינור, Y2 ו Y3 דרך רשת ניילון. שוטף את הרשת עם 5 מיליליטר נוסף של המסקלין.
   5. צנטריפוגה השעית התא XG ב 500 במשך 7 דקות.
   6. Resuspend גלולה במדיום צלחת המסקלין על coverslips מצופה PLL עבור ניסויים נוספים (איור 2b).
   7. דגירה למשך תקופה מינימלית של 4 - 6 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO _2.
      הערה: לקבלת immunostaining או ניסויים פונקציונליים כמו הדמית סידן פלורסנט, מומלץ צלחת התאים על coverslips, תוך זריעה בצלחת 6-היטב מומלץ כאשר RNA או חלבון הבידוד הוא רצוי.

Vimentin 5./ Cytokeratin זוגי מכתים עבור אימות של MEEC טהור ותרבויות המסקלין

1. זרעים התאים על coverslips.
2. לשטוף 3 x 5 דקות עם PBS המכיל סידן ומגנזיום על שייקר מסלולית (50 סל"ד).
3. תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) (זהירות!) במשך 10 דקות, לא על שייקר.
4. לשטוף 3x עם PBS ללא סידן ומגנזיום על שייקר (50 סל"ד).
5. Permeabilize את התאים עם 0.2% Triton X-100 במשך 10 דקות על שייקר (50 סל"ד).
6. לשטוף 3x עם PBS על שייקר.
7. בלוק עם 5% עז בסרום (GS) ב- PBS עבור 2 שעות על שייקר (50 סל"ד)
8. דגירת תאים עם vimentin אנטי אנושי ארנב חד שבטי (1: 500) ו pancytokeratin אנטי אנושי עכבר חד שבטי (1: 1,000) ב 4 ° C על שייקר (50 סל"ד). נוגדנים הם מדוללים PBS עם 0.5% GS.
9. 3x לשטוף עם PBS על (סל"ד 50) שייקר.
10. דגירה תאים עם נוגדנים משני (1: 1,000 ב -0.5% GS) Alexa פלואוריד 488 מצומדות נגד ארנב IgG ו אלקסה פלואוריד 488-conjuIgG אנטי עכבר מגודר על שייקר.
11. לשטוף 3x עם PBS על שייקר.
12. הר שקופיות עם הרכבה בינונית מימית המכילה DAPI ו- O יבש / N.
13. חותם את השקופיות עם לק ולשמור על 4 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף (איור 2 א, ב).

6. במבחנה Decidualization בתוך מערכת Coculture

הערה: ארבעה עד חמישה בעלי חיים נדרשים להקים מערכת coculture בצלחת 24 גם. המשך עם הפרוטוקול הבא בסביבת סטרילית, רצוי מתחת לארון זרימה למינרית.

1. הכן את מוסיף תרבית תאים במהלך שלבי צנטריפוגה ו / או דגירה של בידוד תא אפיתל (כמתואר 4.3) ב צלחת 24 באר נוספת.
   1. הוספת 200 - 400 μL של מדיום המסקלין לתוך הכמות הרצויה של בארות בצלחת 24 גם.
   2. מניחים את מוסיף על 24 בארות prefilled באמצעות מלקחיים סטרילית.
2. Resuspend גלולה MEEC(שלב 4.3.14) במדיום MEEC ומתחלקים על המחדיר (נפח עבודה: 150 - 300 μL לכל כנס). התרבות התאים על 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO _2.
3. זרעי תאי סטרומה ב עוד צלחת 24 גם (תואמים עם מוסיף תרבית תאים) לאחר הסיבוב השני של בידוד תא סטרומה (שלב 4.5.6). השתמש נפח עבודה של השעית תא 400 μL לכל טוב.
4. אפשר תאי סטרומה לצרף מינימום 4 - ח 6 ב 37 מעלות צלזיוס חממת ₂ 5% CO.
5. מעבירים את מוסיף תרבית תאים מכוסה תאי אפיתל מהצלחת 24 הבאר הראשונה לתוך צלחת 24 גם השני מכוסה על ידי תאי סטרומה. שימוש במלקחיים מעוקרים או לגעת מוסיף רק ברגל התלייה שלהם.
6. התרבות התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה 5% CO ₂ לתקופה של 3 - 5 ד עד לתאי האפיתל ליצור בשכבה ואת בתאי סטרומה להשיג 80 - 90% confluency. בנוסף לכך, השתמש בהתנגדות החשמלית Transepithelial (TEER)כדי לפקח על monolayer אפיתל על ידי שימוש מטר אפיתל וולט / אוהם כפי שתואר על ידי גרנט et al. ^7. ערכים של 800-1,000 / גם היו די להידרש ומחוברות monolayer אפיתל.
7. במידת הצורך, להחליף את מדיום כל 2 - ד 3 באמצעות טפטפות זכוכית או טיפים pipet בסדר. התחל עם החלפתו של המדיום של תאי סטרומה (זורע בתחתית), לפני ההחלפה הבינונית מוסיף. מומלץ להשתמש תרבית תאים בינוניים שחומם מראש ב 37 מעלות צלזיוס.
8. הכן את המדיום decidualization כדי לעורר decidualization במבחנה לפני תחילת הניסוי. השתמש נפח עבודה של 400 μL לכל טוב של תאי סטרומה.
   1. הכן את פתרונות מניות aliquots במאגר הבאים ב -20 ° C.
      1. הכן 250 מיקרומטר medroxyprogesterone 17-אצטט (MPA) באתנול.
      2. הכן פתרון המניות 100 מ"מ 8-Bromoadenosine 3 ', 5'- cAMP במים ultrapure.
   2. הפוך את המדיום decidual המכיל MPA 1 מיקרומטר ו 0.5 מ"מ cAMP במדיום המסקלין המכיל 2% FBS.
9. בעדינות להסיר את המדיום מבאר ולהוסיף מדיום decidual על גבי תאי סטרומה. אם מצב מלא יש צורך, להשתמש במדיום המסקלין המכיל 2% FBS.
10. הסר את המדיום מן מוסיף תרבית תאים ולהוסיף 300 μL של מדיום MEEC על התאים.
11. דגירה התאים למשך 5 ד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO _2.
12. אחרי היום החמישי, להעריך את היקף decidualization בתאי סטרומה על ידי RT-qPCR (ראה להלן).
13. אמת את הכדאיות של תאי אפיתל באמצעות ריאגנט הכדאי המבוסס Resazurin.
    1. כן 1:10 פתרון של מגיב כדאיות במדיום MEEC.
    2. מעביר את מוסיף תרבית תאים לתוך צלחת 24-באר חדשה.
    3. הוספת 150 - 300 μL של מגיב הכדאיות - פתרון MEEC על התאים.
    4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO ₂ למשךלפחות 4 - כדאיות התא 5 שעות או למשך הלילה ולהעריך על ידי התבוננות שינוי צבע (כחול / ורוד סגול).
       הערה: Decidualization ניתן להעריך גם באמצעות עכבר פרולקטין ספציפי ELISA, כפי המועדפת על ידי החוקר.

7.Validation של Decidualization ידי qRT-PCR

הערה: לקבלת אימות של decidualization ידי qRT-PCR, מומלץ לבצע את כל מבחן התנאים בשני עותקים על מנת לקבל כמות מספקת של תאים לניתוח RNA.
RT-PCR כמותי מבוצעת כפי שתואר לעיל דה קלרק et al. ^8.
בקיצור:

1. לבודד RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית.
   1. להעריך את הכמות והאיכות של ה- RNA באמצעות שיטות מסחר על פי פרוטוקול של היצרן, בהתאמה.
2. לסנתז cDNA, על פי פרוטוקול של היצרן החל מיום 1 מיקרוגרם של רנ"א מוחלט.
3. השתמש ערכה מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן לבצע את תגובת qRT-PCR.
   1. הפעל את כל הדגימות בשלושה עותקים.
   2. לעשות שימוש של מיקס מאסטר TaqMan המסחרי בדיקות TaqMan ספציפיות עבור גני המשק הרצויים ופרולקטין (prl8a2) כדי לבצע את התגובה.

תוצאות

סקירה כללית של פרוטוקול

איור 1 א ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול. זריקה יומית של E2 (100 ng) במשך שלושה ימים רצופים שמשה לסנכרן החיות ולתקנן את השלב של מחזור הייחום. מחזור הייחום ניתן להעריך על ידי lavages בנרתיק מחולק proestrus, ייחום, diestrus והפאזה metestrus. שלב המחזור יכול להיקבע בהתאם ליחס של תאי desquamated ב השטיפה, אשר חשופים לשינויים הורמונליים. הגדלת רמות של אסטרוגן תגרום החיות להתפתח לשלב ייחום. בשלב זה ניתן לאתר בקלות על ידי נוכחות של תאי אפיתל cornified בלעדי והיעדר לויקוציטים (איור 1B). ביום 4, uteri של חיות שנמצאות בשלב ייחום נאספים MEEC ו המסקלין מבודדים (תרשים 1C). ג Decidualizationלהיגרם על ידי הוספת 0.5 מ"מ cAMP ו -1 מיקרומטר MPA למדיום FBS 2% במהלך תקופת הדגירה של 5 ד.

בקרת איכות של תרבויות MEEC ו המסקלין

טוהר בתרביות תאים ראשוניים ניתן להעריך על ידי ההבדל ביטוי vimentin ו cytokeratin. Vimentin הוא סיבי ביניים אשר באה לידי ביטוי בתאים mesenchymal, ומכאן בתאי סטרומה רירית הרחם. Cytokeratin הוא סיבי ביניים נמצא שלד התא של רקמות אפיתל. איור 2 א מראה את רמת ביטוי mRNA של vimentin ו cytokeratin ב MEEC ו המסקלין הוערכה באמצעות qRT-PCR. רמות vimentin עשירות המסקלין ודלות MEEC (2.2x גבוה, p <0.001), בעוד שרמות cytokeratin עשירות MEEC ודל המסקלין (36x גבוה, p <0.001). Vimentin / צביעה כפולה cytokeratin בוצעה וציינה כי תאי סטרומה להביע vimentin ואילו epitתאים helial להביע cytokeratin (תרשים 2B, C). העדר נוגדן ראשוני שימש כביקורת שלילית עבור immunostaining (איור 2 ד, ה). stainings immunohistological אלה מראים כי הן בתרביות תאים של רירית הרחם (MEEC ו המסקלין) יש טוהר של עד 90%.

Decidualization ב MEEC / המסקלין cocultures

לאחר בידוד, עכבר תאי רירית רחם סטרומה היו זורעים במערכת שיתוף התרבות לחקות את הסביבה של רירית הרחם. תאים בתרבית עד לתאי האפיתל נוצרו בשכבה של כנס תרבית תאים (ערכי TEER של 800 - 1,000 / טוב), ואת בתאי סטרומה הגיעו למצב תת ומחוברות. Decidualization הושר תאי סטרומה עם היישום של 0.5 המ"מ cAMP ו -1 מיקרומטר MPA. לאחר חמישה ימים של דגירה, רמות ה- mRNA פרולקטין הוערכו בתאים סטרומה ידי qRT-PCR משום אינדיקציה decidualization (איור 3 א). רמות הפרולקטין היו מבוטאות בכמות גבוהה בתאים נתונים ההורמונים nondetectable בתאים מודגרות עם מדיום הביקורת (p <0.01).

מאחר ותאי אפיתל קשים לדמיין בתוך מוסיף תרבית תאים, assay כדאית בוצעה מייד לאחר תקופת הדגירה של חמישה ימים (איור 3 ב). שילוב של מדיום גידול רגיל ריאגנט כדאיות נוסף הבארות וטופח במשך תקופה של 8 מינימאלי - h 12. מעבר צבע מכחול ורוד בהיר הצביע על הנוכחות של תאי אפיתל קיימא. ראוי לציין, כי שינוי הצבע יתרחש רק כאשר תאי קיימא נוכחים.

איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. (א) תכנית של פרוטוקול הבידוד מתחילה עם שלושימים רצופים של זריקות אסטרוגן. ביום 3, צריכות להיות מוכנות את ההכנות הדרושות. ביום 4, שלב ייחום מוערך (מסומן על ידי כוכב) על ידי ביצוע שטיפה וגינלית. המסקלין ו MEEC מבודדים באמצעות צעדי עיכול שונים. ביום 6, או כאשר תאים הם ומחובר, יכול להיגרם decidualization במערכת שיתוף התרבות ידי הוספת cAMP ו MPA הבינוני תקופת דגירה של חמישה ימים (יום 6 - 11). (ב) תמונה מייצגת של השלב ייחום מאופיין בנוכחות של תאים cornified אפיתל של שטיפה וגינלית (בהגדלה 10X). (C) תמונה מייצגת של המסקלין ו MEEC (בהגדלה 20X, סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

g> איור 2: Immunostaining וכמותי RT-PCR עבור vimentin ו Cytokeratin ב MEEC ו המסקלין. (א) רמות RNA שליח ביטוי vimentin ו cytokeratin כדי לציין את הטוהר של תרבויות. רמות RNA כומתו יחסית לממוצע הגיאומטרי של גנים משק ACTB ו TBP. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. Vimentin / צביעה כפולה cytokeratin על תרבויות המסקלין (B) ותרבויות MEEC (C). הכנס ב משמאל מראה נוף בהגדלה 63X. בקרה שלילית עם נוגדן ראשוני השמיט עבור המסקלין (ד) ו MEEC (E) (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). ***: P <0.001 עם ANOVA דו כיוונית עם תיקון Bonferroni למבחנים מרובים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

EP-together.within-page = "1">
איור 3: תיקוף Decidualization באמצעות RT-PCR. (א) רמות mRNA ביטוי פרולקטין בתאי סטרומה להעריך decidualization. רמות RNA כומתו יחסית לממוצע הגיאומטרי של גנים משק PGK1 ו TBP. השינוי לקפל בתאים בתרבית בשליטה או בינוני decidual מוצג ממוצע ± SEM. (ב) תמונות להמחשה של תאי סטרומה לפני (למעלה) ואחרי גירוי decidualization (למטה). את הכנס מימין ממחיש בהגדלה של תא סטרומה decidualized. Decidualization מאופיין בנוכחות של תאים multinucleated, שמסומן על ידי חיצים שחורים. (ג) נציג תמונות של הערכה של כדאיות התא האפיתל את הכנס לאחר assay. התמונות צולמו מיד לאחר מתן של מגיב הכדאיות (Prestoblue) (0 ח) ואת following הבוקר (אונ). **: P <0.01 עם מאן-ויטני מבחן U. ON: לילה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

Decidualization הוא הבידול תלוי פרוגסטרון של תאי סטרומה רירית רחם לתאי decidual עגולים והסתרתו. ב אדם, תהליך זה מתרחש באופן ספונטני במהלך שלב הלוטאלי של המחזור והוא יזם בתאים סטרומה סביב תאי כלי הדם כדי ליצור את predecidua. עם זאת, במכרסמים, הנוכחות של הבלסטוציסט היא הכרחית כדי לגרום decidualization. העובדה decidualization מתרחשת רק לאחר מגע עם תאי אפיתל רירית הרחם מרמז כי גורמים חשובים מופרשים על ידי תאי אפיתל לגרום decidualization ב stroma הבסיסית. למרות ההבדל הזה התנעת decidualization ראויה להכרה, העובדה decidualization אדם הופך להיות יותר חזק על השתלת עובר עולה כי מנגנונים דומים יכולים להיות מעורבים. במבחנה בתרביות תאים משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות ספציפיות בתהליך decidualization.עם זאת, הזמינות והכמות של רקמה אנושית שניתן לגבות מוגבלת לעתים קרובות ומלווים וריאציות, למשל, מחזור שלב, מספר ההריונות ונוכחות של מחלות גינקולוגיות כמו אנדומטריוזיס או אדנומיוזיס. רבים של בעיות אלה ניתן למנוע על ידי שימוש ברקמה בעכברים כי הוא נגיש ושלב במחזור עצמאית. יתרון חזק נוסף של שימוש רקמות בעכברים הוא ההזדמנות להשתמש מכרסמים מהונדסים גנטי ואפשרות ההתקנה מספר רב של ניסויים. כרגע, פרוטוקולי בידוד שונים תוארו בספרות עם שונות גבוהות בעידן של החיות והתקופה בשלב הייחום ברגע השימוש.

מחקר זה מציג שיטה חדשה תרבויות-שיתוף רירית הרחם העיקרי של סטרומה ותאי אפיתל שבו היתרון צולמה של מחזור הייחום מתוקנן זריקה יומית של אסטרוגן לפני הבידוד. יתר על כן, אסטרוגן הוא known לגרום התפשטות בתאי אפיתל סטרומה אשר מגדילה עוד יותר את התשואה לכל בידוד. פרוטוקול הבידוד המתואר במאמר זה התבסס על ואח גרנט. ^7, לעומת זאת, צעדים אופטימיזציה נוספים נכללו כדי להגדיל את התשואה, טוהר, ואת הכדאיות של תרביות תאים השונות. ראשית, HBSS תמיד משלים עם אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום של התרבות העיקרית. במהלך הבידוד של MEEC, עיבוד טמפרטורה נעשה (15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס) כדי להגדיל את היבול של תאי אפיתל במהלך העיכול הראשון. הבא, צעד נוסף נכלל למתן הפעילות האנזימטית לאחר עיכול טריפסין על ידי הוספת בינוני המכיל FBS לעכב את פעילותו. יתר על כן, MEECs הועבר דרך פילטר של שבו הרשת הייתה גדולה יותר מה שמתואר בדרך כלל (100 מיקרומטר) כפי שהם באים בדרך כלל באשכולות ויריעות תא. יתר על כן, זיהום על ידי תאי סטרומה הופחת על ידי ביצוע רחבצעד itional שבו MEECs ו MESCs הופרדו מבוסס על שקיעה הכבידה. לבסוף, MEECs היו זורעים על coverslips מצופה קולגן להגדיל את הקובץ המצורף של תאים coverslips זכוכית, כפי שהתברר כי מצורף coverslips זכוכית ללא ציפוי או PLL מצופה היה מספיק. במהלך הבידוד של MESCs, collagenase (1 מ"ג / מ"ל) נוספה כדי לשפר את העיכול. יתר על כן, צעד עיכול זה בוצע בשני עותקים, כדי למנוע זיהום של MEECs נותר. כל פעולות נוספות הבאות הביאו תרבויות טהורות ובת קיימא של אוכלוסיות תאים הומוגנית.

טוהר אוכלוסיית התא הוערך עם immunostaining ו qRT-PCR באמצעות vimentin כסמן סטרומה cytokeratin כסמן אפיתל. מובן כי דפוס ביטוי הפוך של vimentin ו cytokeratin נצפה MEEC ו המסקלין. עם זאת, ניתן להבחין כי הביטוי mRNA היחסי של vimentin ו cytokeratin דומה בתרבויות MEEC. similתוצאות ar מתפרסמות על ידי קבוצות מחקר אחרות, שבו תאי אפיתל בביטוי vimentin לרכוש תרבות ^9. מה שחשוב יותר הוא ההבדל ביטוי חלבון בין vimentin ו cytokeratin כמו נצפתה stainings immunohistological של אוכלוסיות תאים שונות. immunostaining הזוגי הראה כי EECS היה חיובי עבור cytokeratin ו- ESC היה חיובי עבור vimentin. שימוש סמנים אלה immunostaining הוא שיטה הוקמה standardly משמש כדי לציין את סוגי התאים ^10.

למרות הרבה מחקר שבוצע על decidualization של המסקלין, אפשרי עדיין כי הנוכחות של תאי אפיתל מודל זה עשויה לשנות את התוצאות של decidualization. ראשית, הוכח שאם MEEC לגדול בשכבה בנוכחות בינוני המסקלין ממוזג או בסביבה שיתוף תרבות, בשכבה יש התנגדות חשמלית משופרת אפיתל תאי transepithelial (TEER), כתוצאה מגורמים המופרשים המסקלין ^7. יתר על כן, פיירו et al. ¹¹ סיפקו הוכחות לכך התפשטות אפיתל, מושפע 17β-אסטרדיול, עשוי להיות מתווכת על ידי גורמים המופרשים מתאי סטרומה, ולחילופין, תאי אפיתל יכול לשחרר גורמים לווסת סטרומה decidualization ^{12, 13.} בסך הכל, זה ברור שסביבת שיתוף התרבות-סטרומה אפיתל מספקת מצב פיסיולוגי יותר המאפשר אינטראקציה ותקשורת paracrine. השיטה של culturing שני סוגי תאים שונים באמצעות מערכת שיתוף תרבות כנס שתוארה קודם לכן ^{14, 15} ו הותאמה לשימוש של תאים ראשוניים בעכברים. על ידי זיהוי של רמות ה- mRNA פרולקטין בתור מחוץ לקרוא decidualization, הטכניקה המתוארת יש לקריאה מתוך לשחזור מאוד עבור decidualization זמין ולאפשרזה ובכך בחקר היחסים אפיתל סטרומה במהלך decidualization. אותות paracrine בתיווך מן MEEC עשויים לשנות את היקף decidualization בתאים סטרומה. יתר על כן, המודל מאפשר אפנון ספציפי של הצד אפיתל ללא ישירות המשפיע על תאי סטרומה. לכן, זו התרבות המשותפת של MEEC ו המסקלין מציעה כלי מושלם כדי להעריך את ההשפעה של הורמונים, ציטוקינים, וכו 'על תאי אפיתל עם מחוץ לקרוא על decidualization סטרומה. יתרון נוסף של מערכת שיתוף תרבות זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור את מעורבותם של חלבון מסוים של תהליך decidualization כלשהי באחד משני אפיתל או תא סטרומה באמצעות תאים מבודדים מבעלי חיים מהונדסים. יתר על כן, טכניקה זו תהיה מועילה מאוד לחקור דבקה הבלסטוציסט להעריך האם גורמי paracrine מופרש מתא אפיתל בנוכחות של הבלסטוציסט מספיקים כדי לגרום decidualization של סטרומה הבסיסיתתאים. צעד חשוב הפלישה trophoblast בקורלציה השפלה מטריקס, אשר מתווכת על ידי פעולה של אנזימים פרוטאוליטים. הטכניקה המוצעת ניתן ליישם מודל במבחנה לחקור את ההצטלבות בין הבלסטוציסט, לתאי האפיתל ואת stroma תומך.

עם זאת, כרגע מעט מאוד ידוע על מקורם של תאי אפיתל אשר יכול להיות גם לומינל כפי בלוטות. לכן, אפיון נוסף של הפרופיל הגנטי והמולקולרי של תאי אפיתל נדרש. בנוסף, השיטה המתוארת היא מוגבלת הידע הזמין על הקיטוב של תאי אפיתל. כרגע, הקיטוב של תאי אפיתל לא נלקח בחשבון. עם זאת, ההבדלים בביטוי של חלבונים בממברנה מתוארים ממברנות apical ואת הבסיס. הקיטוב לא ראוי של שכבת האפיתל יכול להשפיע על האינטראקציה paracrine בין epitheliאל ותאי סטרומה. עם זאת, שיטות להשיג תאי אפיתל מקוטבים התואר ויכולות להיכלל הטכניקה המתוארת ^{15, 16.}

בסך הכל, הפרוטוקול המתואר מציע טכניקת בהצלחה להקים בתרביות תאים ראשוניות של אפיתל עכבר רירית רחם ותאי סטרומה. טכניקה זו גורמת בתרביות תאים טהורות כפי שאושרה על ידי qRT-PCR ו immunostaining של vimentin ו cytokeratin. בסופו של דבר, גידול אפיתל סטרומה שיתוף תרבות הוצגה המאפשר חקירת אותות paracrine בתיווך או MEEC ו / או המסקלין בתהליך decidualization.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant	Greiner Bio-one	662610	Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Cell culture treated 24 well plates	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma Aldrich	B7880	Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma Aldrich	M1629	Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE
Arachis oil	Supermarket		Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175-046	Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I	Corning	354236	From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)	Cell Signalling Tech	#5741	Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin	Sigma Aldrich	C2562	Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;;
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium	Gibco	14040174	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133