마우스 자궁 내막 상피와 기질 세포의 분리에 대한<em&gt; 체외</em&gt; 탈락

요약

본 연구는 체외 탈락에서 공부하는 공 배양 시스템에서 사용할 수있는 기본 마우스 자궁 내막 기질과 상피 세포의 분리 및 문화에 대한 표준화 및 검증 방법을 제시한다.

초록

탈락은 자궁 내막 기질 세포의 황체 호르몬에 의존 분화 과정과 성공적인 배아 이식을위한 전제 조건입니다. 많은 노력이 탈락의 기전을 표시하려고 하였지만, 배아 및 하부 기질 세포와 접촉하는 상피 세포의 정확한 신호가 제대로 이해 남아. 따라서, 탈락의 분자 세부 사항에 대한 우리의 지식을 향상시킬 수있는 계정으로 상피와 기질 세포 모두를 취하는 방법으로 탈락을 공부. 이를 위해, 인공 탈락의 생체 내 모델에서 생리 학적으로 가장 적합하다; 그러나, 간 통신의 조작이 제한된다. 현재 내막 기질 세포의 체외 배양 여러 시그널링 분자가 탈락의 조절을 조사하기 위해 사용되고있다. 종래, 인간 또는 마우스 내막 기질 세포는익숙한. 그러나, 인간의 샘플의 유용성은 매우 종종 제한된다. 또한, 쥐 조직의 사용은 배양 방법에서 다양한 수반한다. 이 연구는 순수 자궁 내막 상피 세포 (EEC)와 세 개의 연속 일 동안 에스트로겐 치료 성인 그대로 마우스를 사용하여 기질 세포 (ESC) 문화를 얻을 수있는 검증되고 표준화 된 방법을 제시한다. 프로토콜은 세포의 수율, 생존 및 순도를 향상시키기 위해 최적화되며 상기 EEC ESC와의 공 배양에 탈락을 연구하기 위해 확장되었다. 이 모델은 탈락의 두 세포 유형의 중요성을 악용하고 세포 간 통신시 EEC 또는 ESC 분비 중요한 신호 분자의 기여를 평가하는 데 적합 할 수있다.

서문

인간의 자궁 내막은 자궁의 내부 안감이며, 가능한 임신을위한 준비로 고장 및 수리의 월간주기를 겪는다. 그것은 자궁 내강과 난소 호르몬 에스트로겐과 프로게스테론의 변동에 따라 두께에 변화 기본 기질을 긋고 상피 세포의 단일 층으로 구성되어 있습니다. 황체기 동안, postovulatory 프로게스테론 서지 큰 라운드 탈락 세포로 자궁 내막 기질 세포의 분화, 탈락 ^{1, 2라는} 과정을 유도 할 것이다. 인간에있어서, 이러한 현상은 predecidua을 형성하는 자연 발생하지만 배아 착상 할 때 더욱 현저해진다. 탈락의 기능적 결과는 자궁이 일시적으로 배아 이식에 수용되고 있다는 점이다. 이 간격은 '이식의 창'으로 표시됩니다. 배아 이식의 초기 기간의 decidualized 전자 중이식 배아를 둘러싸고 ndometrial 간질 세포는 배아 ^(3)에 유해한 물질의 통과를 방지하는 장벽을 제공한다. 임신 중에이 탈락은 태반이 자리를 차지하기 전에 태아에 대한 영양분을 제공 할 것입니다, 나중에 태반 ^(4)의 모체 일부를 구성한다.

윤리 실용적인 고려 탈락하는 과정을 조사하기 위해, 인간 연구의 설계를 제한하고 동물 모델의 사용을 자극했다. hemochorial 태반 그룹의 구성원이기 때문에, 설치류의 자궁 내막은 태반 ⁵ 이전에 탈락을 받게 될 것이다. 설치류 그러나 탈락 프로세스의 개시는 추가 자극이 탈락 ^{6 응답을} 트리거 할 필요가 있음을 나타내는, 자궁 내강의 포배의 존재에 의존한다. 이것은 일 간의 복잡한 통신을 의미E 배반포와 직접 접촉이 자궁 내막 상피 세포 및 기저 세포 기질. 그럼에도 불구하고, 탈락 인위적으로 기계 긁힘이나 호르몬 준비하는 자궁 오일의 점안과 같은 자극을 사용하여 유도 할 수있다. 인공 탈락 모델을 사용하여 생체 내 연구는 예를 들어 탈락의 복잡한 신호 처리, 기계적인 심층 연구, 우리의 통찰력을 개선하기 위해 우리를 허용했지만, 상피와 기질 세포 사이의 필수적인 통신의 조사는 제한되어 있습니다. 따라서, 시험 관내 연구는 탈락 중요한 경로를 조작하고 기본적인 공정을 연구 할 수있다. 이를 위해, 주요 자궁 내막 기질 세포 배양 인간 또는 설치류 자궁 내막에서 설정할 수 있습니다. 설치류를 이용하면 탈락 과정 관심있는 특정 단백질의 역할을 조사하기 위해 유전자 변형 동물의 사용을 동의 한. 그러나, 미성숙, prepuberTY 마우스는 종종 다른 경우가 자궁 배양에서 이질성 초래 발정주기의 모든 단계에서 수집되는 동안 발정주기의 합병증을 방지하기 위해 사용된다. 또한, 탈락의 방법은 배양 배지 (I) 보충 호르몬 (에스트로겐, 프로게스테론 또는 사이 클릭 아데노신 모노 포스페이트 (cAMP))에 의해 서로 다른 프로토콜, 예를 들면, 연구, 또는 한 생쥐에서 탈락 막 세포 (II) 분리에 의해 플러그 검사 및 vasectomized 남성에 대한 추가의 필요성을 요구 (의사) 임신의 날 4.5. 이러한 제한은 체외 탈락에서 공부하는 표준화 된 방법의 필요성을 보여줍니다. 본 연구에서는 생리 학적 모델은 성인에서 시작하여 체외 탈락을 조사, 비 (의사) 임신 한 쥐가 표시됩니다. 이 방법에서는 17β-에스트라 디올 (E2)의 매일 주사 동질 및 P의 증가 된 수율로 수득 내막 세포의 증식을 유도 할 것이다URE의 세포 집단. 또한, 공동 배양 시스템의 사용은 각막 상피 ​​누화와 상이한 레벨에서 탈락하는 과정을 조작 할 수있는 능력의 조사를 허용한다.

프로토콜

AlexaFluor

이 연구의 모든 동물 실험은 KU 루벤 (벨기에) (/ 2013 프로젝트 P174)의 윤리 심사위원회에 의해 승인되었다. 마우스는 음식 펠릿에 광고 무제한 액세스, 표준 조건 하에서 보관 및 수돗물, 그리고 통제 된 조건 (23 ± 1.5 ° C, 상대 습도 40-60%, 12/12 빛 / 어둠 사이클)에서 유지되었다.

1. 마우스

1. 시중에서 판매하는 마우스 변형 (- 12 주 오래 된, 즉 C57BL / 6, 여성 8)를 사용합니다. 일반적으로, 4-5 마우스는 상기 실험에서 세포의 적절한 양을 산출한다.
2. 위한 17β-에스트라 100 μL (E2) 용액 (100 NG / 100 μL)로 피하 손상 쥐 주입 연속 3 D 동물의 발정주기의 위상을 표준화 내막의 증식을 유도하기 위해 단리 전에 세포. 프로토콜을 시작하기 전에 마우스의 사이클 위상 검사의 필요성은 피할 수있다 BE3 D '에스트라 디올 처리의 원인.

2. 준비

1. 100 NG / 아라 키스 오일 100 μL E2의 솔루션을합니다. 다섯 마우스 (1.2에서 설명)의 주사를, 1.5ml의 양이 필요하다.
   1. 1 ㎎ / ㎖의 원액을 1 mL의 에탄올에 1 mg의 E2를 녹여.
   2. 이 원액 1을 희석 : 1,000 아라 키스 오일에.
2. 500 ㎖의 1X 100 U / ㎖ 페니실린 및 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신으로 보충 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBBS) 중 (상기 HBSS + 라 함) 만든다.
3. 문화 MESC에 여과 마우스 자궁 내막 기질 세포의 500 mL로 (MESC) 매체 페놀 레드, L- 글루타민 및 4- (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -1- 에탄과 둘 베코의 변형 이글 중간 / 영양 혼합물 F12 (DMEM / F12) 아세트산, N - (2- 히드 록시 에틸) 피페 라진 -N '- (2- 에탄 설 폰산) (HEPES), 10 % FBS, 0.5 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 100 μg의 / ㎖의 젠타 마이신을 함유하는 (푸rther)는 MESC 매체 라 함.
4. 탈락시 문화 MESC에 필터링 2 % MESC 매체의 500 mL로 : 페놀 레드, L- 글루타민 및 2 % FBS, 0.5 μg의 / ML의 암포 테리 신 B를 포함하는 HEPES, 100 μg의 / ML의 겐타 마이신과 DMEM / F12.
5. 여과 마우스 내막 상피 세포, 500㎖를 준비 (MEEC) 배지 : 10 % FBS, 0.5 μg의 / ㎖의 암포 테리 신 B, 100 μg의 / ㎖의 겐타 마이신, 25 % MCDB-105 배지, 5 μg의 / ㎖ 인슐린을 포함하는 DMEM (상기 언급 ) MEEC 매체로서.
6. MESC 문화에 대한 폴리 - L - 라이신 (PLL) 코팅 된 커버를 준비합니다.
   1. 증류수 250 mL에 PLL의 25 mg을 녹이고. 0.22 μm의 필터를 사용하여 상기 용액을 필터.
   2. 12 웰 플레이트에 멸균 된 커버를 추가합니다. 커버 슬립에 용해 PLL의 300 μL를 추가합니다.
   3. 인큐베이션 30 분 후, 용액을 제거한다. (- 2개월 최대 1) 판은 4 ° C 더 사용할 때까지 저장할 수 있습니다.
7. 10 ㎎ / ㎖ 원액 O를 준비F 형 콜라게나 -20 ° C에서 300 μL의 IA 저장 분취. 사용하기 전에 필터링합니다.

24 시간 격리하기 전에 필수 3. 준비

1. MEEC 문화 콜라겐 코팅 된 커버를 준비합니다.
   1. 증류수 0.02 M 아세트산 용액 (커버 슬립 당 1 ml)로 준비한다.
   2. 를 50㎍ / ㎖의 최종 농도를 얻기 위해 0.02 M로 아세트산 12 ㎖의 콜라겐 150 μL를 추가한다.
   3. 12 웰 플레이트에 멸균 된 커버를 추가합니다.
   4. 콜라겐 액 1 mL로 (3.1.2 참조)에 추가합니다.
   5. 37 ℃에서 O / N (최소 12 시간)을 인큐베이션.
      격리 중 :
   6. 흡입에 의해 커버 슬립 오프 콜라겐 솔루션을 제거하고 (층류 캐비닛) 무균 환경에서 그것을 자연 건조를 할 수 있습니다.
   7. 인산 완충 식염수 (PBS)로 두 번 씻어 커버 슬립.
2. 10 mL를 함유하는 15 mL의 표준 튜브에 0.25 g 크레아틴을 추가하여 2.5 % 판 크레아틴 용액을 준비HBSS +. 용해도를 증가시키기 위해 1 시간 동안 (200 rpm으로) 37 ° C에서 상기 용액을 흔들어. 4 ℃에서 보관하십시오.

4. 분리 및 마우스 자궁 내막 상피 세포의 문화 (MEEC) 및 마우스 자궁 내막 기질 세포 (MESC)

1. (상기 MESC 소화 믹스라고 함) 0.25 % 트립신을 함유하는 최종 용액 결국 2.5 % 크레아틴 용액 (3.2 참조)를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 트립신을 25㎎ 추가한다.
2. 자궁의 분리
   1. 질 도말 검사와 동물의 사이클 단계를 확인합니다.
      1. 동물을 억제하고 50 μL PBS 3 부드럽게 질을 세척 - 5 회.
      2. 유리 슬라이드에 대한 최종 플러시를 수집합니다.
      3. 10 배 또는 20 배 대물 렌즈를 사용하여 명 시야 현미경 물질을 조사한다.
      4. 만 발정 단계에있는 마우스를 사용합니다. 이 단계는 질 세척의 각질화 된 상피 세포의 존재 (도 1 특징 ).
   2. 이러한 자궁 경부 전위 또는 CO ₂ - 유도 마취 등의 적절한 방법을 사용하여 동물을 안락사.
   3. 무균 환경을 생성하기 위해 70 % 에탄올로 시체 스프레이.
   4. 무균 수술 도구를 사용하여 복부를 열고 모두 자궁 뿔을 시각화하기 위해 따로 장을 밀어 넣습니다.
   5. 나팔관에서 가장 말단에 자궁 뿔을 잡아. 나팔관에서 자궁 뿔을 해부하고 지방과 결합 조직을 제거합니다. 자궁 체 위의 말단부에 뿔을 잘라 HBSS + 3 mL를 가진 35mm 페트리 접시에 넣습니다.
      1. 모든 자궁 뿔이 수집 될 때까지 다른 혼과 다른 동물이 단계를 반복합니다.
   6. 더 입체경에서 (HBSS +에서) 자궁 경적을 청소하고 모든 잔여 지방이나 결합 조직을 제거합니다.
   7. 자궁 내강을 노출하고 일을 대체 할 길이 방향으로 열려있는 자궁 뿔을 잘라신선한 HBSS의 +와 새로운 배양 접시에서 전자 혼.
   8. 크레아틴과 트립신을 포함하는 15 ML의 튜브 모든 자궁 뿔을 전송합니다.
   9. 궤도 셰이커 (50 회전)에 4 ° C에서 60 분 동안 수평으로 품어.
   10. 흔들림없이 23 ° C (RT)에서 45 분 동안 수평으로 품어.
   11. 흔들림없이 37 ° C (수조)에서 15 분 동안 수평으로 품어.
   12. 한편 0.05 % 트립신 - 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액 2.7 mL에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 주식의 300 μL를 용해하여 MESC 소화 믹스를 확인합니다.
       참고 : 지금부터, 더 분리 단계는 층류 캐비닛에서 무균 환경에서 수행된다.
3. 마우스 자궁 내막 상피 세포 (MEEC) 문화
   1. 배양 2 시간 후에, 조심스럽게 상층 액을 얻어 붓는다.
   2. 트립신을 불 활성화시키기 위해 냉간 MEEC 배지를 함유하는 페트리 접시로 옮기고 자궁을 5 분 동안 배양활동.
   3. 차가운 HBSS +의 3 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 자궁 전송.
   4. 10 초 동안 소용돌이는 상피 시트를 분리합니다.
   5. 3 ㎖의 HBSS + 깨끗한 페트리 접시에있는 자궁을 씻어.
   6. 단계를 반복 4.3.2 - 4.3.4 상피 시트를 포함하는 세 현탁액의 총을 얻었다.
   7. MESC 소화 믹스에 자궁을 전송하고 (200 RPM)를 흔들어 섞으면 서 37 ° C에서 30 분 동안 배양 (MESC의 추가 분리를 위해 4.4 단계로 이동합니다).
   8. 조직 파편을 제거하기 위해 100 ㎛의 나일론 메쉬 가볍게 세 세포 현탁액으로 피펫 팅 상피 시트를 복구.
   9. 5 분 동안 500 XG에 수집 된 세포 현탁액을 원심 분리기.
   10. MEEC 매체의 12 ㎖의 펠렛을 재현 탁하고 잘 섞는다.
   11. 중력 침강을 이용하여 나머지 MESC을 분리하기 위해 5 분 동안 상기 용액을 침전.
   12. 5 mL를 피펫을 사용하여 조심스럽게 상단 2 mL로 제거합니다.
   13. 셀 suspensio을 원심 분리기n은 5 분 500 XG에.
   14. 부드럽게 피펫 팅 아래로 MEEC 매체를 Resuspend.
   15. 추가 실험 (그림 2a)에 대해 원하는 밀도의 콜라겐 코팅 된 커버에 세포를 플레이트.
   16. 12 시간 이상 동안 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
       참고 : RNA 또는 단백질 분리가 필요한 경우 6 웰 플레이트에 파종을 권장하면서 면역 형광 칼슘 이미징과 같은 기능 실험을 위해, 그것의 커버 슬립에 직접 세포를 판 것이 좋습니다. 마우스 내막 기질 세포의 분리는 불충분 할 수있는 하나의 소화 후에 세포의 순도와 같은 두 라운드로 분할된다. 자궁은 최적의 세포 회복 및 순도 두 번 소화하고 있습니다. 두 라운드에서 기술적 개입은 동일합니다. 연구자가 원하는대로 모두 발사로부터 수집 된 세포를 상기 실험에 유지 될 수있다.
4. 마우스 자궁 내막 str을OMAL 셀 (MESC) 문화 : 1 ^차 라운드
   1. 첫 번째 소화 라운드의 시작하기 전에, 2.7 mL의 0.05 % 트립신 - EDTA 용액에 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 주식의 300 μL를 용해하여 초 소화 믹스를 준비합니다. 이 혼합 단계 4.4.8 필요하다.
   2. 감기 (4 ° C) HBSS + 및 MESC 매체의 3 mL를 3 × 15 mL의 튜브 (튜브 X1, X2와 X3)와 세 개의 작은 배양 접시를 준비합니다.
   3. 인큐베이션 30 분 후, 10 초 동안 가볍게 자궁 함유 트립신 용액을 흔들어. MESC 세포는 자궁 조직으로부터 분리되고 트립신 용액에 남아있을 것이다.
   4. 감기 (4 ° C) HBSS + 3 mL로 포함하는 첫 번째 페트리 접시에 자궁을 전송하고 잘 헹구어.
   5. 트립신 활성을 저해하기 위해 원래 (단계 4.4.3 튜브) 자궁 뿔을 포함하는 튜브에 MESC 배지 3 ㎖을 추가한다.
   6. HBSS + MESC 매체의 3 용액을 포함하는 튜브 X1에 감기 (4 °에 C)와 페트리 접시에서 자궁을 전송하고 10 초 동안 부드럽게 흔들어.
   7. 반복 4.4.4 (감기 (4 °의 C와 페트리 접시로 전송) HBSS +) 두 번 4.4.6 (튜브 X2와 X3에 전송) 단계를 반복합니다.
      참고 : 마지막으로,이 프로토콜은 4 세포 현탁액가 발생합니다 : 하나의 튜브 트립신 용액과 MESC를 포함 MESC 매체 3 튜브 (튜브 X1, X2와 X3)를 포함.
   8. 단계 4.4.1에서 설명 된 바와 같이, 새로운 MESC 소화에 자궁 전송 수직 37 ° C에서 30 분 동안 배양한다.
   9. 40 μm의 나일론 메쉬를 통해 네 개의 세포 현탁액을 전달하여 기질 세포를 수집합니다. MESC 추가로 5 ㎖의 메쉬를 헹군다.
   10. 7 분 동안 500 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
   11. 원하는 밀도 추가 실험을위한 PLL - 코팅 된 커버에 MESC 및 접시에 펠렛을 재현 탁.
   12. 5 % CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 6 시간 또는 O / N - (4)의 최소 인큐베이션.
5. 마우스 자궁 내막 기질 세포 (MESC) 문화 : 2 ^차 라운드 <올>
6. 감기 (4 ° C) HBSS + 및 MESC 매체의 3 mL를 3 × 15 mL의 튜브 (튜브 Y1, Y2 및 Y3)와 세 개의 작은 배양 접시를 준비합니다.
7. 4.4.7 - 반복 4.4.3 단계를 반복합니다.
8. 40 μm의 나일론 메쉬로 자궁과 함께 마지막 세포 현탁액을 전송합니다.
9. 나일론 메쉬를 통해 튜브 Y1, Y2 및 Y3의 내용을 전달하여 간질 세포를 수집한다. MESC 추가로 5 ㎖의 메쉬를 헹군다.
10. 7 분 동안 500 XG에 세포 현탁액을 원심 분리기.
11. 추가 실험 (그림 2b)을위한 PLL - 코팅 된 커버에 MESC 매체와 플레이트의 펠렛을 재현 탁.
12. 5 % CO _2와 37 ° C에서 6 시간 - 4의 최소 품어.
    참고 : RNA 또는 단백질 분리가 요구 될 때 추천 6 웰 플레이트에 파종하는 동안 면역 형광 칼슘 이미징과 같은 기능 실험을 위해, 그것은, 커버 슬립에 세포를 도금하는 것이 좋습니다.

5. 멘틴/ 순수 MEEC 및 MESC 문화의 유효성에 대한 사이토 케라틴을 두 번 염색

1. 커버 슬립에 세포를 시드.
2. PBS는 궤도 셰이커 (50 회전)에 칼슘과 마그네슘을 포함하는 3 × 5 분을 씻으십시오.
3. 하지 쉐이커에서 10 분 동안 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) (주의!)으로 세포를 고정한다.
4. 셰이커 (50 회전)에 칼슘과 마그네슘없이 PBS로 3 배 씻으십시오.
5. 쉐이커 (50 RPM)에서 10 분 동안 0.2 % 트리톤 X-100 세포를 Permeabilize 하시려면.
6. 쉐이커에 PBS로 3 배 씻으십시오.
7. 쉐이커에 2 시간 동안 PBS에서 5 % 염소 혈청 (GS)와 블록 (50 회전)
8. 쉐이커 (50 회전)에 4 ° C에서 (: 500 1) 및 단일 클론 마우스 항 - 인간 pancytokeratin (1000 1) 단일 클론 토끼 항 - 인간 멘틴와 세포를 품어. 항체는 0.5 % GS로 PBS에 희석된다.
9. 쉐이커 (50 회전)에 PBS로 세척 배.
10. 이차 항체와 세포를 품어 (1 : 1,000 0.5 % GS에) 알렉사 플 루어 488 - 복합 항 - 토끼 IgG의 알렉사 플 루어 488 - conju쉐이커에 문이 항 - 마우스 IgG를.
11. 쉐이커에 PBS로 3 배 씻으십시오.
12. 마운트 DAPI 건조 O / N을 포함하는 수성 장착 매체 슬라이드.
13. 매니큐어와 슬라이드를 밀봉하고 더 사용하기 위해 4 ° C에 보관 (그림 2A, B).

공 배양 시스템에서 체외 탈락 6.

참고 : 네 다섯 동물이 24 웰 플레이트에서 공 배양 시스템을 구축해야합니다. 바람직하게는 층류 캐비닛 하에서 무균 환경에서 다음 프로토콜을 계속한다.

1. 추가로 24 웰 플레이트에있는 상피 세포 분리 (4.3에서 설명)의 원심 분리 및 / 또는 배양 단계 동안 세포 배양 물 삽입물을 준비한다.
   1. 24 웰 플레이트에 웰의 원하는 금액에 MESC 매체의 400 μL - (200)를 추가합니다.
   2. 멸균 집게를 사용하여 프리 필드 24 우물에서 삽입을 놓습니다.
2. MEEC 펠렛을 재현 탁인서트를 통해 MEEC 중간 분할에 (단계 4.3.14) (작업 볼륨 : 150 - 삽입 당 300 μL). 배양을 5 % _CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포.
3. 간질 세포 격리의 두 번째 라운드 (단계 4.5.6) 후 (세포 배양 삽입과 호환) 또 다른 24 웰 플레이트에서 기질 세포를 시드. 물론 당 400 μL 세포 현탁액의 작동 볼륨을 사용합니다.
4. 5 % CO ₂ 배양기에서 37 ℃에서 6 시간 - 기질 세포가 최소 4 첨부 할 수 있습니다.
5. 기질 세포에 의해 커버되는 제 24 웰 플레이트에 처음 24 웰 플레이트에서 상피 세포로 덮여 세포 배양 삽입을 전송합니다. 멸균 집게를 사용하거나 그들의 매달려 다리에서 삽입을 누릅니다.
6. 배양 3 기간 동안 5 % _CO2 인큐베이터에서 37 ℃에서 세포 - 90 % 컨 플루 - 상피 세포까지 5 D는 단층 및 간질 세포 (80)를 달성 형성한다. 또한, 사용하는 Transepithelial 전기 저항 (봉사자)그랜트 등에 의해 기술 된 바와 같이 볼트 / 상피 옴 미터를 이용하여 상피 단층을 모니터링한다. ^7. 800-1,000 / 웰의 값은 상피 단층 합류를 고려하기에 충분했다.
7. 유리 피펫 또는 미세 피펫 팁을 사용하여 3 일 - 필요한 경우, 매체마다 2를 교체합니다. 인서트에 배지를 교체하기 전에 (하단 시드) 기질 세포의 배지의 교환과 함께 시작한다. 이는 37 ℃에서 예열 된 세포 배양 배지를 사용하는 것을 권장한다.
8. 실험을 시작하기 전에 체외 탈락에 유도하기 탈락 매체를 준비합니다. 기질 세포의 웰 당 400 μL의 작업 볼륨을 사용합니다.
   1. -20 ° C에서 다음 원액 저장 분취 액을 준비한다.
      1. 에탄올 250 μM의 메드 록시 프로게스테론 (17) - 아세테이트 (MPA)를 준비합니다.
      2. 100 mM의 원액 8 Bromoadenosine 3 ', 5'- 초순수에 캠프를 준비합니다.
   2. 1 μM의 MPA와 2 % FBS를 포함 MESC 매체에서 0.5 mM의 캠프를 포함 탈락 매체합니다.
9. 조심스럽게 우물에서 매체를 제거하고 기질 세포 상에 탈락 매체를 추가합니다. 제어 조건이 필요한 경우에는 2 % FBS를 함유하는 MESC 매체를 사용한다.
10. 세포 배양 삽입에서 매체를 제거하고 세포에 MEEC 매체의 300 μL를 추가합니다.
11. 5 % CO _2에서 37 ℃의 인큐베이터에 5 (D)에 대해 세포를 인큐베이션.
12. 다섯 번째 하루를 보낸 후, RT-qPCR에 의한 기질 세포의 탈락의 정도를 평가 (아래 참조).
13. 레사 주린 기반의 생존 시약을 사용하여 상피 세포의 생존을 확인합니다.
    1. MEEC 배지에서 생존 시약시 10 분 솔루션을 준비합니다.
    2. 새로운 24 웰 플레이트에 세포 배양 삽입을 전송합니다.
    3. 세포에 MEEC 솔루션 - 생존 시약 300 μL - (150)를 추가합니다.
    4. 에서 5 % CO _2에서 37 ℃에서 인큐베이션적어도 4-5 시간 또는 하룻밤 (보라색 / 분홍색 파란색) 색상 변화를 관찰함으로써 세포 생존 능력을 평가합니다.
       주 : 바람직한 연구자로 탈락 또한 마우스 프로락틴 특정 ELISA를 사용하여 평가 될 수있다.

QRT-PCR에 의한 탈락의 7.Validation

참고 : QRT-PCR에 의한 탈락의 검증을 위해,이 RNA 분석을위한 세포의 충분한 양을 받기 위해 중복 모든 테스트 조건을 수행하는 것이 좋습니다.
드 Clercq 등의 알에서 전술 한 바와 같이 정량적 RT-PCR이 수행된다. ^8.
간단히 :

1. 상업적인 RNA 분리 키트를 이용하여 총 RNA를 분리.
   1. 각각 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 방법을 이용하여 RNA의 양과 질을 평가한다.
2. 총 RNA 1 μg의부터 제조 업체의 프로토콜에 따라, cDNA를 합성.
3. QRT-PCR 반응을 수행하기 위해 제조자의 프로토콜에 따라 상업적 키트를 사용한다.
   1. 세중의 모든 샘플을 실행합니다.
   2. 반응을 수행하는 것이 바람직한 하우스 키핑 유전자 및 프로락틴 (prl8a2)에 상용의 TaqMan 마스터 믹스 특정의 TaqMan 프로브를 사용한다.

결과

프로토콜의 일반 개요

도 1a는 프로토콜의 일반적인 개요를 도시한다. 세 개의 연속 일 E2 (100 NG)을 매일 주입 동물을 동기화하고 발정주기의 위상을 표준화 하였다. 발정주기 질 세척액에 의해 평가 될 수 있고, 발정, 발정, diestrus 및 metestrus 단계로 분할된다. 사이클 상 호르몬 변화에 노출되는 세척에 desquamated 세포의 비율에 따라 지정 될 수있다. 에스트로겐의 수준을 증가 시키면 동물이 발정 단계로 진화 할 것입니다. 이 상을 쉽게 단독 각질화 된 상피 세포의 존재 및 백혈구의 부재 (도 1b)에 의해 검출 될 수있다. 하루에 4 일, 발정 단계에있는 동물의 자궁을 수집하고 MEEC 및 MESC (그림 1C) 격리됩니다. 탈락의 C5 (d)의 인큐베이션 기간 동안 0.5 mM의 캠프 및 2 % FBS 배지로 1 μM MPA를 첨가하여 유도된다.

MEEC 및 MESC 문화의 품질 관리

일차 세포 배양 물의 순도 및 멘틴 사이토 케라틴 발현의 차이에 의해 평가 될 수있다. 멘틴, 따라서 자궁 간질 세포, 중간 엽 세포에서 발현하는 중간체 필라멘트이다. 사이토 케라틴은 상피 조직의 세포 골격에있는 중간 필라멘트이다. 도 2a 및 MEEC MESC에서 멘틴 및 사이토 케라틴의 mRNA 발현 수준 QRT-PCR을 사용하여 평가 나타낸다. 멘틴 수준은 MEEC에 MESC 높고 낮은 (높은 2.2 배, P <0.001), 사이토 케라틴 수준이 MESC에 MEEC에 높고 낮은 반면 (36 배 이상, P <0.001). 멘틴 / 사이토 케라틴 이중 염색을 수행하고 간질 세포가 epit 반면 멘틴을 표현하는 것을 나타내었다helial 세포 (그림 2B, C) 사이토 케라틴을 표현한다. 일차 항체의 부재는 면역 염색 (도 2d, E)에 대한 음성 대조군으로 사용 하였다. 이러한 면역 조직 염색에 모두 내막 세포 배양 (MEEC 및 MESC)는 90 %의 순도를 갖고 있음을 보여준다.

MEEC / MESC 공 배양에서 탈락

분리 후, 마우스 내막 및 간질 세포 내막 환경을 모방하는 공존 배양 시스템에서 시딩 하였다. 및 간질 세포는 서브 컨 플루 언트 상태에 도달 - 상피 세포 (/ 웰 1000 티이 (800)의 값) 세포 배양 인서트 단층이 형성 될 때까지 세포를 배양 하였다. 탈락은 0.5 mM의 cAMP를 적용하고 1 μM MPA와 간질 세포에서 유도 하였다. 배양 5 일 후, 프로락틴 mRNA 수준은 decid에 대한 표시로 QRT-PCR에 의한 간질 세포에서 평가되었다ualization (그림 3A). 프로락틴 수준이 높은 셀 제어 매질 (p <0.01)로 배양 된 세포에서 분비 실시하고 nondetectable 표현 하였다.

상피 세포는 세포 배양 인서트 내부 시각화하기 어려운 때문에, 생존력 분석법 5 일 잠복기 (도 3b) 직후에 수행 하였다. 정상적인 성장 배지 및 생존 시약의 혼합은 웰에 첨가하고, 최소 8의 기간 동안 인큐베이션 하였다 - 12 시간. 밝은 핑크 청색의 컬러 시프트가 가능한 상피 세포의 존재를 나타내었다. 생존 세포가 존재하는 경우 색깔 변화 만 발생합니다.

그림 1 : 프로토콜의 일반 개요. (A) 절연 프로토콜 반응식 세부터 시작에스트로겐 주사의 연속 일. 3 일에 필요한 준비를 준비해야한다. 4 일째, 발정상은 질 세척을 수행하여 (별표로 표시)으로 평가된다. MESC 및 MEEC 다른 소화 단계를 사용하여 격리됩니다. 세포가 합류 할 때 일 6 일 또는 탈락이 매체 오일의 잠복기 (11 - 6 일)에 캠프 MPA를 첨가하여 공동 배양 시스템에서 발생 될 수있다. (B) 질 세척에 각질화 된 상피 세포의 존재를 특징으로 발정 위상 대표 사진 (배율 10 배). (C) MESC 및 MEEC의 대표 사진 (배율 20 배, 스케일 바 : 100 μm의). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2 : 면역 염색 및 MEEC 및 MESC에 멘틴 및 사이토 케라틴에 대한 정량적 RT-PCR. (A) 및 사이토 케라틴 멘틴 메신저 RNA 발현 수준은 배양 물의 순도를 나타 내기 위해. RNA 수준은 상대적으로 하우스 키핑 유전자 ACTB 및 TBP의 기하 평균을 정량화 하였다. 데이터는 SEM ± 평균으로 표시 하였다. MESC 문화 (B) 및 MEEC 문화 (C)에 멘틴 / 사이토 케라틴 이중 염색. 왼쪽에 삽입은 63X 확대보기를 보여줍니다. MESC (D) 및 MEEC (E) 생략 일차 항체와 음성 대조군 (스케일 바 : 50 μm의). *** : p <여러 테스트를위한 페로 니 보정과 양방향 ANOVA와 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3 : RT-PCR을 통해 탈락의 검증. 간질 세포에서 발현 프로락틴 (A) mRNA 수준은 탈락을 평가한다. RNA 수준은 상대적으로 하우스 키핑 유전자 PGK1와 TBP의 기하 평균을 정량화 하였다. 제어 또는 탈락 배지에서 배양 세포에서 배의 변화는 SEM ± 평균으로 표시됩니다. (B) (위)과 후 (아래) 탈락 자극 전에 기질 세포의 예시 사진. 오른쪽의 삽입은 decidualized 간질 세포의 배율을 나타낸다. 탈락 검정색 화살표로 표시된 다핵 세포의 존재에 의해 특징된다. (C) 분석 후 삽입의 상피 세포 생존 능력의 평가의 대표 이미지. 사진은 생존 시약의 관리 (Prestoblue) (0 시간)과 F 직후 찍은따르게 아침 (ON). ** : p <맨 - 휘트니 U 테스트와 0.01. ON : 하룻밤. 스케일 바 : 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

탈락 라운드 탈락 분비 세포로 내막 간질 세포의 분화 프로게스테론 의존적이다. 인간에서,이 과정은 생리주기의 황체기 동안 자연적으로 발생하고 predecidua을 형성하는 혈관 주변 세포를 간질 세포에서 개시된다. 그러나, 설치류, 배반포의 존재 탈락을 유도하기 위해 필수적이다. 탈락 만 내막 상피 세포와 접촉 이후에 발생한다는 사실은 중요 요소가 기본 기질의 탈락을 유도하는 상피 세포에 의해 분비되는 것을 의미한다. 탈락 처리의 개시의 차이는 인정해야하지만, 인간의 탈락은 배아 착상시 더 강력해진다는 사실 유사한 메커니즘이 관여 할 수 있음을 시사한다. 시험 관내 세포 배양 물은 종종 탈락하는 과정에서 특정 분자의 효과를 연구하기 위해 사용된다.그럼에도 불구하고, 수집 할 수있는 가용성 및 인체 조직의 양이 종종 제한 예를 들어, 변형,주기 단계, 임신의 수와 자궁 내막증이나 자궁 선근증과 같은 부인과 질환의 존재에 의해 동반한다. 이러한 많은 문제는 쉽게 접근 할 수 있고주기 단계 독립적 뮤린 조직의 사용으로 방지 될 수있다. 쥐의 조직을 사용하는 또 다른 장점은 강력한 유전자 변형 설치류를 사용할 수있는 기회와 실험을 다수 설치 할 수있는 가능성이다. 현재, 많은 다른 분리 프로토콜 높은 동물의 나이의 변동 및 사용 시점의 발정 단계의 기간 문헌에 기재되어있다.

이 연구는 장점은 분리 이전에 에스트로겐의 매일 주사에 의해 표준화 된 발정주기의 찍은있는 기질과 상피 세포의 기본 자궁 내막 공동 문화에 대한 새로운 방법을 제시한다. 또한, 에스트로겐은 K입니다nown 더 격리 당 수율을 증가 상피와 기질 세포의 증식을 유도한다. 이 문서에 설명 된 격리 프로토콜은 부여 등의 알을 기반으로했다. ^{(7) 그러나,} 상기 최적화 단계가 다른 세포 배양의 수율, 순도 및 생존율을 증가 하였다. 먼저 HBSS 항상 주 문화의 오염을 피하기 위해 항생 물질로 보충 하였다. MEEC의 분리 동안 온도 적응 제 소화 동안 상피 세포의 수확을 증가 (37 ° C에서 15 분) 수행 하였다. 이어서, 추가의 단계가 그 활성을 억제하는 FBS를 함유하는 배지를 첨가함으로써 트립신 분해 후 효소 활성을 템퍼링하기 위해 포함되었다. 또한, MEECs는 메시가 일반적으로 그들은 종종 클러스터 및 세포 시트에 와서 (100 μm의) 설명하는 것보다 더 컸다있는 필터를 통과했다. 또한, 간질 세포에 의한 오염이 추가를 수행함으로써 감소MEECs 및 MESCs 중력 침강에 따라 분리하는 itional 단계. 이 코팅 또는 PLL 코팅 된 커버 글라스에 부착이 불충분 명확하게되었다 마지막으로, MEECs는, 커버 글라스에 세포의 부착을 증가시키는 콜라겐 코팅 된 커버에 접종 하였다. MESCs의 분리 동안 콜라게나 제 (1 ㎎ / ㎖)의 소화를 향상시키기 위해 첨가 하였다. 또한,이 분해 단계는 나머지 MEECs의 오염을 방지하기 위해 이중으로 수행 하였다. 이러한 모든 추가 단계는 균일 한 세포 집단의 순수하고 가능한 문화의 결과.

세포 집단의 순도 및 면역 QRT-PCR은 상피 마커로서 기질 마커 및 사이토 케라틴으로 멘틴을 이용하여 평가 하였다. 분명히 멘틴 및 사이토 케라틴의 대향 발현 패턴 및 MEEC MESC 관찰되었다. 그러나, 멘틴 및 사이토 케라틴의 상대 mRNA 발현이 MEEC 문화 유사하다는 것을 알 수있다. Simil아칸소 결과는 다른 연구 그룹에 의해 게시 문화 취득의 멘틴 식 ^(9)에있는 상피 세포입니다. 더 중요한 비 멘틴하고 다른 세포 집단의 면역 조직 염색에 관찰 된 바와 같이 사이 사이토 케라틴 단백질 발현의 차이이다. 이중 면역 염색은 EECS는 사이토 케라틴에 대한 긍정적이었고, ESC는 vimentin에 대한 긍정적 인 것으로 나타났다. 면역 이러한 마커의 사용은 확립 방법이며 표준 적 세포 유형 ^(10)를 나타내는 데 사용.

많은 연구가 MESC의 탈락을 수행 하였지만,이 모델에서 상피 세포의 존재가 탈락의 결과를 변경할 수 있다는 가능성 남아있다. 먼저, 이는이 MEEC MESC - 조정 배지의 존재하에 또는 공동 배양 환경에서 단층으로 성장하는 경우에는 단분자막을 개선 상피 세포 transepithelial 전기 저항 (갖는 것이 밝혀졌다봉사자), MESC ⁷ 분비 요인에 기인. 또한, Pierro 등의 알. ^{도 11은} 17β-에스트라 영향 상피 증식, 기질 세포로부터 분비 인자에 의해 매개 될 수 있다는 증거를 제공하고, 선택적으로, 상피 세포는 각막의 탈락 ^{(12, 13)을} 조정 인자를 분리 할 수있다. 전체적으로는 상피 기질 공 배양 환경 분비 작용하고 통신 할 수있는 더 많은 생리 학적 상태를 제공하는 것이 분명하다. 삽입 공 배양 시스템을 이용하여 두 개의 서로 다른 유형의 세포를 배양하는 방법은 ^{14, 15} 및 전술 된 뮤린 일차 전지를 사용하도록 하였다. 탈락하는 판독 등 프로락틴 mRNA 수준을 검출함으로써, 상술 한 기술을 사용할 수있게하고 탈락하는 매우 재현성 판독을 가지고이에 탈락시 상피 - 기질의 관계에 대한 연구이야. MEEC에서 중재하는 분비 신호를 간질 세포에서 탈락의 범위를 변경할 수있다. 또한, 상기 모델은 직접 기질 세포에 영향을주지 않고 상피 측의 특정 변조 허용한다. 따라서, MEEC 및 MESC이 공동 문화는 간질 탈락의 판독과 상피 세포에 등 호르몬, 사이토 카인의 효과를 평가하기위한 완벽한 도구를 제공합니다. 본 공 배양 시스템의 또 다른 장점은 연구자 형질 전환 동물로부터 분리 된 세포를 사용하여 상피 또는 기질 구획 중 하나의 탈락 공정에서 특정 단백질의 관련을 조사 할 수 있다는 것이다. 또한,이 방법은 배반포의 존재하에 상피 세포에 의해 분비 분비 인자 하부 기질의 탈락을 유도하기에 충분한인지 평가 배반포의 밀착성을 조사하기 위해 매우 도움이 될 것이다세포. 영양막 내습 중요한 단계는 단백질 분해 효소의 작용에 의해 매개되는 세포 외 기질 분해, 상관. 제안 된 기법은 배반포, 상피 세포와지지 기질 간의 크로스 토크를 조사하는 시험 관내 모델로 적용될 수있다.

그러나, 순간 작은 선의로 잘 내강 될 수있는 상피 세포의 기원에 대한 알려져있다. 따라서, 상피 세포의 유전 및 분자 프로파일의 추가적인 특성이 요구된다. 또한, 상술 한 방법은 상피 세포의 편광에 대한 가능한 기술로 제한된다. 이 순간, 상피 세포의 편광은 고려되지 않았다. 그러나 막 단백질의 발현에 차이는 정단 및 기저 막에 기재되어있다. 상피층의 부적절한 편광 epitheli 분비 간의 상호 작용에 영향을 미칠 수도알와 기질 세포. 그러나, 방법이 설명되었다 편광 상피 세포를 얻기 위해 상기 기재된 기술 ^{(15, 16)에} 포함될 수있다.

전체적으로 설명 된 프로토콜이 성공적으로 마우스 내막 상피 및 간질 세포의 일차 배양 세포를 수립하는 방법을 제안한다. QRT-PCR에 의해 확인 및 멘틴 및 사이토 케라틴의 면역 염색으로이 기술은 순수 세포 배양을 초래한다. 궁극적으로, 상피와 기질 공동 문화는 탈락 과정에서 MEEC 및 / 또는 MESC 중 하나에 의해 매개 분비 신호의 조사를 허용하는 도입되었다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant	Greiner Bio-one	662610	Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Cell culture treated 24 well plates	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma Aldrich	B7880	Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma Aldrich	M1629	Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE
Arachis oil	Supermarket		Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175-046	Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I	Corning	354236	From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)	Cell Signalling Tech	#5741	Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin	Sigma Aldrich	C2562	Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;;
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium	Gibco	14040174	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133