Выделение мыши Эндометриальный эпителиальных и стромальных клеток для<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Резюме

Это исследование представляет собой стандартизацию и апробацию способ выделения и культуры первичных стромальных мыши внутриматочной и эпителиальных клеток, которые могут быть использованы в системе совместного культивирования для изучения в пробирке decidualization.

Аннотация

Decidualization является прогестерон-зависимый процесс дифференциации эндометрия стромальных клеток и является необходимым условием для успешной имплантации эмбриона. Хотя многие были предприняты усилия, чтобы выявить основные механизмы decidualization, точная передача сигналов между эпителиальными клетками, которые находятся в контакте с эмбрионом и нижележащих стромальных клеток еще недостаточно изучена. Поэтому, изучая decidualization таким образом, который принимает как эпителиальные и стромальные клетки во внимание могли бы улучшить наши знания о молекулярных деталях decidualization. С этой целью в естественных условиях модели искусственного decidualization являются физиологически наиболее актуальными; Тем не менее, манипулирование межклеточной коммуникации ограничено. В настоящее время в пробирке культур эндометрия стромальных клеток используются для исследования модуляции decidualization нескольких сигнальных молекул. Обычно стромальные клетки человека или мыши являются внутриматочныеиспользуемый. Тем не менее, наличие образцов человека очень часто ограничены. Кроме того, применение мышиных тканей сопровождается разнообразием в способе культивирования. Данное исследование представляет собой проверенную и стандартизированный метод для получения чистого Эндометриальный эпителиальной клетки (ЕЭС) и стромальных клеток (ESC) с использованием культуры взрослых интактных мышей, получавших эстроген в течение трех дней подряд. Протокол оптимизирован для повышения выхода, жизнеспособности и чистоты клеток и затем было продлено с целью изучения decidualization в сокультивирования ЭВП и ESC. Эта модель может быть пригодным для использования важность обоих типов клеток в decidualization и оценить вклад значащих сигнальных молекул, секретируемых ЕЭС или ESC во время межклеточной коммуникации.

Введение

Человек эндометрий внутренней оболочки матки и проходит ежемесячные циклы пробоя и ремонта в качестве подготовки к возможной беременности. Он состоит из одного слоя эпителиальных клеток, выстилающих маточные люмена и основной стромы, который изменяется по толщине в зависимости от колебаний гормонов яичника эстрогена и прогестерона. Во время лютеиновой фазы, постовуляторной прогестерон всплеск будет индукции дифференцировки клеток эндометрия стромальных в более крупные, круглые децидуальных клеток, процесс , называемый decidualization ^{1, 2.} У человека, это явление происходит спонтанно формировать predecidua, но становится более выраженным при имплантации эмбриона. Функциональная следствием decidualization является то, что матка скоротечно становится восприимчивым к имплантации эмбриона. Этот интервал обозначен как «окна имплантации». В ранний период имплантации эмбриона, тем decidualized еndometrial стромальные клетки , окружающие имплантацию эмбриона обеспечит барьер для предотвращения прохождения вредных веществ к зародышу ^3. Во время беременности, это децидуальная обеспечит питательные вещества для развивающегося плода , прежде чем плацентацией произошло, и позже образуют материнскую часть плаценты ^4.

Этические и практические соображения ограничивают конструкцию человеческих исследований, чтобы исследовать процесс decidualization и побудили использование животных моделей. Будучи членом hemochorial плацентацией группы, эндометрий грызунов также претерпит decidualization до начала плацентацией ^5. У грызунов, тем не менее, начало процесса decidualization зависит от наличия бластоцист в маточной полости, что свидетельствует о том , что дополнительный стимул необходимо вызвать децидуальной реакции ^6. Это предполагает сложную связь между гое внутриматочные эпителиальные клетки, которые имеют непосредственный контакт с бластоцисты, а также лежащие в их основе стромальных клеток. Тем не менее, decidualization может быть искусственно с помощью стимулов, как механического натирания или закапывания масла в гормонально загрунтованную матки. Хотя исследования в естественных условиях с использованием искусственных моделей decidualization позволили нам улучшить наши идеи в сложном процессе сигнализации decidualization, механистической углубленных исследований, например, исследование непременном связи между эпителиальных и стромальных клеток, ограничены. Таким образом, в пробирке исследования decidualization могут быть использованы для манипулирования важных путей и изучать фундаментальные процессы. С этой целью, первичные внутриматочные культуры стромальных клеток могут быть созданы из человека или грызуна эндометрии. Использование грызунами соглашается с использованием генетически модифицированных животных с целью изучения роли конкретного интересующего белка в процессе decidualization. Тем не менее, незрелые, prepuberти мышей часто используются для того, чтобы избежать осложнений эстрального цикла, в то время как в других случаях Матки собраны из всех фаз эстрального цикла, что приводит к неоднородности в культурах. Кроме того, процесс decidualization был изучен в различных протоколах, например, по формуле (I) , дополняющих гормоны (эстроген, прогестерон или циклического аденозинмонофосфата (цАМФ)) в культуральной среде, либо (II) выделение децидуальными клеток от мышей в день 4.5 (псевдо) беременности, которые требуют дополнительной необходимости проверки зажигания и вазэктомии мужчин. Эти ограничения показывают необходимость стандартизированного метода для изучения в лабораторных условиях decidualization. В этом исследовании, физиологическая модель для изучения decidualization в пробирке , начиная с взрослого, будут представлены не являющиеся (псевдо) беременных мышей. В этом методе в день инъекции 17 & beta; эстрадиола (Е2) будет индуцировать пролиферацию клеток эндометрия, что приводит к увеличению выхода гомогенной и рпопуляции клеток Юр. Кроме того, использование системы сокультивировани позволяет изучение эпителиального-стромальных перекрестных помех и способность манипулировать процесс decidualization на разных уровнях.

протокол

AlexaFluor

Все эксперименты на животных для этого исследования были одобрены этическим комитетом по рассмотрению действия KU Leuven (Бельгия) (Проект Р174 / 2013). Мышей содержали в стандартных условиях, при свободном доступе к пищевым гранулах и водопроводной воды, и выдерживают в контролируемых условиях (23 ± 1,5 ° С, относительная влажность 40 - 60%, 12/12 цикл свет / темнота).

1. Мыши

1. Используйте имеющийся в продаже штамм мыши (т.е. C57BL / 6, женщина 8 - 12 недель). Как правило, 4 - 5 мышей даст соответствующее количество клеток для дальнейших экспериментов.
2. Вводят интактных мышей подкожно 100 мкл 17 & beta-эстрадиола (Е2) раствора (100 нг / 100 мкл) в течение 3 последовательных г до выделения для того, чтобы стандартизировать фазы эстрального цикла животных и индуцировать пролиферации внутриматочной клетки. Необходимость проверки фазы цикла мышей перед запуском протокола преодолимо BeПричина 3 D 'лечения эстрадиола.

2. Подготовка

1. Приготовьте раствор 100 нг / 100 мкл E2 в арахисовом масле. Для инъекций пяти мышей (как описано в разделе 1.2), количестве 1,5 мл требуется.
   1. Растворите 1 мг E2 в 1 мл этанола, чтобы иметь исходного раствора 1 мг / мл.
   2. Развести этот маточный раствор 1: 1000 в арахисовом масле.
2. Сделать 500 мл Хэнкса сбалансированный солевой раствор (HBBS) 1x, дополненных 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (далее упоминается как HBSS +).
3. Сделать 500 мл отфильтрованной мыши Эндометриальный стромальных клеток (МЕСК) среда для культивирования МЕСК: среда Игла в модификации Дульбекко / питательной смеси F12 (DMEM / F12) с фенолом красным, L-глютамин и 4- (2-гидроксиэтил) пиперазин-1-этансульфоновой кислоты, N - (2-гидроксиэтил) пиперазин - N '- (2-этансульфоновой кислоты) (HEPES) , содержащей 10% FBS, 0,5 мкг / мл амфотерицина В, и 100 мкг / мл гентамицина (фуrther называют MESC среды).
4. Сделать 500 мл фильтрованной 2% МЕСК среды к культуре МЕСК во время decidualization: DMEM / F12 с фенолом красным, L-глютамина и HEPES, содержащим 2% FBS, 0,5 мкг / мл амфотерицина В, и 100 мкг / мл гентамицина.
5. Приготовьте 500 мл отфильтрованной мыши Эндометриальный эпителиальные клетки (MEEC) среда: DMEM, содержащей 10% FBS, 0,5 мкг / мл амфотерицина В, 100 мкг / мл гентамицина, 25% MCDB-105 среде и 5 мкг / мл инсулина (далее в качестве MEEC среды).
6. Подготовка покровные поли-L-лизином (ФАПЧ) покрытие для МЕСК культуры.
   1. Растворите 25 мг ФАПЧ в 250 мл дистиллированной воды. Фильтр раствора с использованием фильтра 0,22 мкм.
   2. Добавить стерильные покровные в 12-луночный планшет. Добавить 300 мкл растворенного ФАПЧ на покровные.
   3. Удалите раствор через 30 мин инкубации. Пластины можно хранить при температуре 4 ° С до дальнейшего использования (до 1 - 2 месяца).
7. Приготовьте 10 мг / мл маточного раствора OF коллагеназы типа IA и хранить аликвоты 300 мкл при -20 ° С. Фильтр перед использованием.

3. Подготовка Требуемые 24 ч до изоляции

1. Подготовка коллагена покровные покрытием для MEEC культуры.
   1. Готовят раствор кислоты 0,02 М уксусной в дистиллированной воде (1 мл на покровное).
   2. Добавьте 150 мкл коллагена в 12 мл 0,02 М уксусной кислоты с получением конечной концентрации 50 мкг / мл.
   3. Добавить стерильные покровные в 12-луночный планшет.
   4. Добавить 1 мл раствора коллагена (см 3.1.2).
   5. Выдержите O / N (минимум 12 ч) при 37 ° С.
      Во время изоляции:
   6. Удалите раствора коллагена выключения покровные путем всасывания и дайте ему воздушно-сухой в стерильной среде (в шкафу ламинарного потока).
   7. Промыть покровные дважды фосфатно-буферном солевом растворе (PBS).
2. Готовят 2,5% раствор панкреатина путем добавления 0,25 г панкреатина в 15 мл каноническому пробирку, содержащую 10 млHBSS +. Взболтать (200 оборотов в минуту) раствора при температуре 37 ° С в течение 1 ч для увеличения растворимости. Хранить при температуре 4 ° С.

4. Выделение и культивирование мыши Эндометриальный эпителиальных клеток (MEEC) и мышь Эндометриальный Стромальные клетки (MESC)

1. Добавьте 25 мг трипсина в пробирку 15 мл, содержащего 2,5% раствор панкреатина (см 3.2), чтобы в конечном итоге с окончательным раствором, содержащим 0,25% трипсина (далее, как MESC переваривания смеси).
2. Выделение маток
   1. Проверьте фазу цикла животных с вагинального мазка.
      1. Задержите животное и промойте влагалище осторожно с помощью 50 мкл PBS 3 - 5 раз.
      2. Собирают окончательный флеш на предметном стекле.
      3. Осмотрите материал под ярким поле микроскопа с использованием объектива 10X или 20X.
      4. Используйте только мышей, которые находятся в фазе течки. Эта стадия характеризуется наличием ороговевших эпителиальных клеток в вагинальных лаважа (рис 1 ).
   2. Эвтаназии животных с помощью соответствующего метода , такие как цервикальной дислокации или СО ₂ наркоза индуцированного.
   3. Спрей туш с 70% этанола с целью получения стерильной среде.
   4. Использование стерильных хирургических инструментов, откройте живот и раздвинуть кишечник в сторону, чтобы визуализировать оба рога матки.
   5. Захватите рог матки на самом дальнем конце под маточной трубе. Рассеките рога матки из фаллопиевых труб и удаления жировой и соединительной ткани. Вырежьте рог на дальнем конце над телом матки и поместить его в 35 мм чашки Петри с 3 мл HBSS +.
      1. Повторите этот шаг для другого рога и для других животных, пока все рога матки не собираются.
   6. Очистите рога матки (в HBSS +) далее под стереоскоп и удалить все остатки жировой или соединительной ткани.
   7. Вырезать рога матки открытые в продольном направлении, чтобы разоблачить просвет матки и заменить тысе рог в новой чашки Петри со свежим HBSS +.
   8. Перенесите все рога матки к 15 мл пробирку, содержащую панкреатин и трипсин.
   9. Выдержите в горизонтальном положении в течение 60 мин при температуре 4 ° С на орбитальном шейкере (50 оборотов в минуту).
   10. Выдержите в горизонтальном положении в течение 45 мин при 23 ° C (RT), без встряхивания.
   11. Выдержите в горизонтальном направлении в течение 15 мин при 37 ° С (водяная баня), без тряски.
   12. В то же время сделать Переваривание смеси МЕСК путем растворения 300 мкл 1 мг / мл коллагеназы запаса в 2,7 мл 0,05% раствора трипсина-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
       Примечание: С этого момента, дальнейшие шаги изоляции выполняются в стерильной среде под шкафом ламинарного потока.
3. Mouse Эндометриальный эпителиальной клетки (MEEC) Культура
   1. Через 2 ч инкубации, осторожно вылить раствор супернатанта.
   2. Передача матках в чашку Петри, содержащую холодную MEEC среду и инкубируют в течение 5 мин для того, чтобы инактивировать трипсинМероприятия.
   3. Передача матках в пробирку 15 мл раствора, содержащего 3 мл холодного HBSS +.
   4. Vortex в течение 10 секунд, чтобы освободить эпителиальные листов.
   5. Промыть матках в чистую чашку Петри с 3 мл HBSS +.
   6. Повторите шаг 4.3.2 - 4.3.4, чтобы получить в общей сложности три суспензий, содержащих эпителиальные листов.
   7. Передача матках в MESC переваривания смеси и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при встряхивании (200 оборотов в минуту) (перейти к шагу 4.4 для дальнейшей изоляции MESC).
   8. Восстановление эпителиальные листов с помощью пипетки три клеточные суспензии осторожно на нейлоновую сетку 100 мкм для того, чтобы удалить остатки ткани.
   9. Центрифуга собранной клеточной суспензии при 500 мкг в течение 5 мин.
   10. Ресуспендируют осадок в 12 мл MEEC среды и хорошо перемешать.
   11. Settle раствор в течение 5 мин, чтобы отделить оставшиеся MESC с помощью гравитационного оседания.
   12. Осторожно снять верхние 2 мл с использованием 5 мл пипетки.
   13. Центрифуга suspensio клетокп при 500 мкг в течение 5 мин.
   14. Ресуспендируют в MEEC среде, осторожно пипеткой вверх и вниз.
   15. Пластина клеток на коллагене покрытием покровные в желаемой плотности для дальнейших экспериментов (фиг.2А).
   16. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ инкубаторе в течение минимум 12 часов.
       Примечание: Для получения иммунным окрашиванием или функциональных экспериментов, таких как флуоресцентных изображений кальция, рекомендуется для высевания клетки непосредственно на покровных стеклах, в то время как затравки в 6-луночный планшет, рекомендуется, когда РНК или белка изоляции желательно. Выделение мышиных эндометриальных стромальных клеток делится на два этапа, как чистота клеток после только одного переваривания может быть недостаточным. Матки переваривается дважды для оптимального восстановления сил клеток и чистоты. В обоих раундах технические мероприятия идентичны. Клетки, собранные в обоих раундах могут быть сохранены для дальнейших экспериментов, по желанию исследователя.
4. Эндометриальный ул мышиOMAL Cell (MESC) Культура: 1 - ^й тур
   1. Перед началом первого раунда переваривания, подготовить второй переваривания смеси путем растворения 300 мкл 1 мг / мл коллагеназы складе в 2,7 мл 0,05% раствора трипсина-ЭДТА. Эта смесь необходимо на этапе 4.4.8.
   2. Готовят три небольшие чашки Петри с холодной (4 & deg; С) HBSS + и 3 × 15 мл пробирки с 3 мл МЕСК среды (трубка X1, X2 и X3).
   3. Через 30 мин инкубации, трясти матках раствор, содержащий трипсин медленном огне в течение 10 сек. MESC клетки будут отделяться от ткани матки и будет оставаться в растворе трипсина.
   4. Передача матках на первую чашку Петри, содержащую 3 мл холодного (4 ° С) HBSS + и хорошо промыть.
   5. Добавьте 3 мл МЕСК среды в трубе, первоначально содержащей рога матки (труба на этапе 4.4.3), чтобы ингибировать активность трипсина.
   6. Передача маток из чашки Петри с холодным (4 ° С) HBSS + к трубке X1, содержащую 3 мл мЭСК среды и слегка встряхнуть в течение 10 секунд.
   7. Повторите шаги 4.4.4 (перевод на чашку Петри с холодным (4 ° С) HBSS +) и 4.4.6 (переход к трубки X2 и X3) дважды.
      Примечание: В конце концов, этот протокол приведет к 4 суспензии клеток: одна трубка, содержащая раствор трипсина и 3 пробирки с средой, содержащей MESC MESC (трубки X1, X2 и X3).
   8. Передача Матки в новом МЕСК пищеварения, как описано на стадии 4.4.1 и инкубировать в течение 30 мин при температуре 37 ° С, в вертикальном положении.
   9. Сбор стромальных клеток путем пропускания четыре клеточные суспензии через нейлоновую сетку 40 мкм. Ополосните сетку с дополнительными 5 мл МЕСК.
   10. Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 7 мин.
   11. Ресуспендируют осадок в MESC и пластины на покровные ФАПЧ покрытием для дальнейших экспериментов с желаемой плотности.
   12. Выдержите в течение как минимум 4 - 6 ч или O / N при 37 ° С в 5% CO ₂ инкубаторе.
5. Mouse Эндометриальный стромальных клеток (MESC) Культура: 2 - ^й раунд <ол>
6. Готовят три небольшие чашки Петри с холодной (4 & deg; С) HBSS + и 3 × 15 мл пробирки с 3 мл среды МЕСК (трубки y1, y2 и y3).
7. Повторите шаги 4.4.3 - 4.4.7.
8. Перенести последнюю клеточную суспензию вместе с маток к нейлоновой сеткой 40 мкм.
9. Сбор стромальных клеток, передавая содержание трубки Y1, Y2 и Y3 через нейлоновую сетку. Ополосните сетку с дополнительными 5 мл МЕСК.
10. Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 7 мин.
11. Ресуспендируют осадок в среде MESC и пластины на покровные ФАПЧ покрытием для дальнейших экспериментов (рис 2b).
12. Инкубируют в течение как минимум 4 - 6 ч при температуре 37 ° С с 5% CO _2.
    Примечание: Для получения иммунным окрашиванием или функциональных экспериментов, таких как флуоресцентных изображений кальция, рекомендуется для высевания клеток на покровных стеклах, в то время как затравки в 6-луночный планшет, рекомендуется, когда РНК или белка изоляции желательно.

5. Виментин/ Цитокератин Двойной Окрашивание для проверки Pure MEEC и MESC культур

1. Семенной клеток на покровные.
2. Промыть 3 х 5 мин с ФБС, содержащим кальций и магний на орбитальном шейкере (50 оборотов в минуту).
3. Зафиксировать клетки , 4% параформальдегида (PFA) (Внимание!) В течение 10 мин, а не на шейкере.
4. Промыть 3 раза с PBS без кальция и магния на качалке (50 оборотов в минуту).
5. Клетки проницаемыми с 0,2% Triton X-100 в течение 10 мин на качалке (50 оборотов в минуту).
6. Промыть 3 раза с PBS на шейкере.
7. Блок с 5% сыворотки козьего (GS) в PBS в течение 2 ч на качалке (50 оборотов в минуту)
8. Инкубируйте клетки с моноклональными кроличьей античеловеческой виментину (1: 500) и мышиных моноклональных антител против человеческого pancytokeratin (1: 1000) при 4 ° С на качалке (50 оборотов в минуту). Антитела разводили в PBS с 0,5% GS.
9. Вымойте 3x с PBS на качалке (50 оборотов в минуту).
10. Инкубируйте клетки с вторичными антителами (1: 1000 в 0,5% GS) Alexa Fluor 488-сопряженного анти-кроличьего IgG и Alexa Fluor 488-conjuзакрытого типа IgG анти-мыши на шейкере.
11. Промыть 3 раза с PBS на шейкере.
12. Mount сползает с водной монтажной средой, содержащей DAPI и сухой O / N.
13. Печать слайдов с лаком для ногтей и держать на 4 ° C для дальнейшего использования (рис 2а, б).

6. В Vitro Decidualization в системе сокультивирования

Примечание: От четырех до пяти животных требуется установить систему сокультивирования в 24-луночного планшета. Продолжить со следующим протоколом в стерильной среде, предпочтительно в камере с ламинарным потоком.

1. Подготовка вставок клеточных культур при центрифугировании и / или инкубационных стадий эпителиальной выделения клеток (как это описано в разделе 4.3) в качестве дополнительного 24-луночного планшета.
   1. Добавить 200 - 400 мкл МЕСК среды в желаемое количество лунок в 24-луночный планшет.
   2. Поместите вставки в укажи 24 скважин с использованием стерильного пинцета.
2. Ресуспендируют осадок MEEC(Этап 4.3.14) в MEEC среде и разделите над вставками (рабочий объем: 150 - 300 мкл на вставке). Культуры клеток при 37 ° С в 5% CO ₂ инкубаторе.
3. Семенной стромальных клеток в другой 24-луночный планшет (совместим со вставками клеточных культур) после второго раунда выделения стромальных клеток (этап 4.5.6). Используйте рабочий объем 400 мкл суспензии клеток на лунку.
4. Разрешить стромальные клетки приложить на минимум 4 - 6 ч при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ инкубаторе.
5. Перенесите вставки клеточных культур, покрытые эпителиальными клетками из первого 24-луночного планшета, во вторую 24-луночного планшета, охватываемого клетками стромы. Используйте стерилизованные пинцет или коснуться вставки только при их висящей ноги.
6. Культуры клеток при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ инкубаторе в течение 3 - 5 дней до тех пор пока эпителиальные клетки образуют монослой и стромальные клетки достигать 80 - 90% сплошности. Кроме того, используйте трансэпителиальная Электрическое сопротивление (TEER)следить за эпителиальный монослой путем использования эпителиальной вольтметр / Ом , как описано грантом и др. ^7. Значения 800-1000 / лунку были достаточны, чтобы рассмотреть вопрос о эпителиального монослоя сливающиеся.
7. При необходимости, замените носитель каждые 2 - 3 D с использованием стеклянных пипеток или тонкие кончики пипеткой. Начнем с заменой среды стромальных клеток (высевают в нижней части), перед заменой среды в вкладышами. Рекомендуется использовать предварительно нагретую среду для культивирования клеток при 37 ° С.
8. Подготовьте decidualization среду , чтобы вызвать в пробирке decidualization перед началом эксперимента. Используйте рабочий объем 400 мкл на лунку стромальных клеток.
   1. Приготовьте следующие растворы и хранить аликвоты при -20 ° С.
      1. Готовят 250 мкМ медроксипрогестерона 17-ацетата (MPA) в этаноле.
      2. Подготовьте 100 мМ маточного раствора 8-Bromoadenosine 3 ', 5'- цАМФ в сверхчистой воде.
   2. Сделать децидуальной среду, содержащую 1 мкМ Мпа и 0,5 мМ цАМФ в MESC среде, содержащей 2% FBS.
9. Осторожно удалите среду из лунок и добавить децидуальной среды на стромальных клетках. Если условие управления необходимо использовать среду МЕСК, содержащей 2% FBS.
10. Извлеките носитель из вставок для культивирования клеток и добавляют 300 мкл MEEC среды на клетки.
11. Инкубируйте клетки в течение 5 дней в инкубаторе при температуре 37 ° С в 5% CO _2.
12. После пятого дня, оценить степень decidualization в стромальных клеток с помощью RT-КПЦР (смотри ниже).
13. Проверка жизнеспособности эпителиальных клеток с использованием реагента жизнеспособность ресазурина основе.
    1. Приготовьте раствор в соотношении 1:10 реагента жизнеспособности в MEEC среде.
    2. Перенесите вставки культуры клеток в новый 24-луночный планшет.
    3. Добавить 150 - 300 мкл Жизнеспособность реагента - MEEC раствора на клетки.
    4. Инкубировать при 37 ° С в 5% CO ₂ в течениене менее 4 - 5 ч или в течение ночи и оценить жизнеспособность клеток, наблюдая изменение цвета (синего до фиолетового / розовый).
       Примечание: Decidualization также может быть оценена с помощью мыши пролактин-специфической ELISA, как предпочтительный исследователем.

7.Validation из Decidualization по QRT-PCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Для валидации decidualization по QRT-PCR, рекомендуется выполнять все тест-условий в двух экземплярах, чтобы получить достаточное количество клеток для анализа РНК.
Количественный ОТ-ПЦР проводят , как описано ранее в Де Клерк и соавт. ^8.
Вкратце:

1. Изолируйте тотальной РНК с использованием набора для выделения РНК коммерческой.
   1. Оценка количества и качества РНК с использованием коммерческих методов в соответствии с протоколом производителя, соответственно.
2. Синтеза кДНК, в соответствии с протоколом производителя, начиная с 1 мкг общей РНК.
3. С помощью коммерческого набора в соответствии с протоколом производителя для проведения реакции QRT-PCR.
   1. Выполнить все образцы в трех экземплярах.
   2. Используйте коммерческий TaqMan Master Mix и конкретных TaqMan зондов для желательных генов домашнего хозяйства и пролактина (prl8a2) для проведения реакции.

Результаты

Общий обзор протокола

Фигура 1А иллюстрирует общий обзор протокола. Ежедневная инъекция E2 (100 нг) в течение трех последовательных дней, был использован для синхронизации животных и стандартизировать фазы эстрального цикла. Цикл течки может быть оценена с помощью вагинальных промываний и делится на проэструса течки, диэструсе и фазы metestrus. Фазовый цикл может быть определен в соответствии с соотношением десквамированных клеток в промывании, которые подвержены гормональным изменениям. Повышение уровня эстрогена заставит животных развиться до течки фазы. Эта фаза может быть легко обнаружена в присутствии исключительно ороговевших эпителиальных клеток и отсутствие лейкоцитов (рис 1б). На 4 -й день, матках животных , которые находятся в фазе течки собирают и MEEC и МЕСК изолированы (рис 1C). Decidualization грап индуцировали добавлением 0,5 мМ цАМФ и 1 мкМ MPA до 2% FBS среды в течение инкубационного периода в 5 дней.

Контроль качества MEEC и MESC культур

Чистота первичных клеточных культур может быть оценена с помощью разницы в выражении виментина и цитокератин. Виментин является промежуточным нить, которая выражается в мезенхимальных клеток, следовательно, в эндометриоидных стромальных клетках. Цитокератин является промежуточным нить найдено в цитоскелета эпителиальной ткани. На фиг.2А показан уровень экспрессии мРНК виментину и цитокератином в MEEC и MESC оценивали с использованием QRT-PCR. Уровни Виментин высоки в MESC и низко в MEEC (2.2x выше, р <0,001), в то время как Цитокератин уровни высоки в MEEC и низко в MESC (36x выше, р <0,001). Виментин / цитокератин двойное окрашивание проводили и показали, что стромальные клетки экспрессируют виментин, тогда как epithelial клетки экспрессируют цитокератин (рис 2B, C). Отсутствие первичных антител использовали в качестве отрицательного контроля для иммунным (рис 2D, Е). Эти иммуногистологические окрашивания показывают, что оба внутриматочные клеточные культуры (MEEC и МЕСК) имеет чистоту до 90%.

Decidualization в MEEC / MESC совместных культурах

После выделения, внутриматочные мыши и стромальные клетки были высеяны в системе сокультуры, чтобы имитировать внутриматочную среду. Клетки культивировали до тех пор, пока эпителиальные клетки образовали монослой во вставке клеточной культуры (значения Teer 800 - 1000 / лунку), и стромальные клетки достигли суб-сливающийся состояние. Decidualization индуцировали в стромальных клеток с применением 0,5 мМ цАМФ и 1 мкМ MPA. После пяти дней инкубации, пролактина уровни мРНК были оценены в стромальных клетках QRT-PCR в качестве показателя для decidualization (Фиг.3А). Уровни пролактина были высоко экспрессируется в клетках, подвергнутых гормонами и невыявляемый в клетках, инкубированных с контрольной средой (р <0,01).

Так как эпителиальные клетки трудно визуализировать внутри вставок клеточных культур, пробирного жизнеспособность проводили сразу после пятидневного инкубационного периода (рис 3B). Сочетание нормальной ростовой среды и реагента жизнеспособность добавляли в лунки и инкубировали в течение периода минимального 8 - 12 ч. Сдвиг цвета от синего до ярко-розового указывает на присутствие жизнеспособных клеток эпителия. Следует отметить, что изменение цвета будет происходить только тогда, когда жизнеспособные клетки присутствуют.

Рисунок 1: Общий обзор Протокола. (А) Схема протокола изоляции , начиная с трехдней подряд эстрогена инъекций. На 3-й день, необходимые препараты должны быть приготовлены. На 4-й день, течка фаза вычисляется (обозначается звездой), выполняя промывание влагалища. MESC и MEEC выделяют с использованием различных стадий пищеварения. На 6-й день, или когда клетки сливающийся, decidualization могут быть вызваны в системе совместного культивирования путем добавления цАМФ и MPA к среде и инкубационный период в пять дней (день 6 - 11). (Б) репрезентативную картину течки фазы , характеризующейся наличием ороговевших эпителиальных клеток в вагинальных лаважа (увеличение 10х). (C) представитель картина MESC и MEEC (увеличение 20x, масштаб бар: 100 мкм). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Иммунологическое и количественный RT-PCR для Виментин и цитокератину в MEEC и MESC. (A) уровни РНК посыльного экспрессии виментина и цитокератин указать чистоту культур. уровни РНК были относительно количественно среднего геометрического генов домашнего хозяйства ACTB и ТБФ. Данные представлены как средние значения ± SEM. Виментин / цитокератин двойное окрашивание на MESC культур (Б) и MEEC культур (C). Вставить в левой показывает вид увеличения 63X. Отрицательный контроль с первичным антителом , исключенных для MESC (D) и MEEC (E) (Масштаб бар: 50 мкм). ***: Р <0,001 с двухсторонним ANOVA с коррекцией Бонферрони для множественного тестирования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Проверка Decidualization с помощью RT-PCR. Уровни (А) мРНК пролактина экспрессии в стромальных клетках , чтобы оценить decidualization. уровни РНК были относительно количественно среднего геометрического генов домашнего хозяйства PGK1 и ТБФ. Складка изменения в клетках, культивируемых в контроле или децидуальной среде показан в виде среднего значения ± SEM. (Б) Наглядные фотографии стромальных клеток до (вверху) и после (внизу) decidualization раздражитель. Вставка на справа показывает увеличение в более decidualized стромальной клетки. Decidualization характеризуется наличием многоядерные клетки, показано черными стрелками. (С) Типичные изображения оценки жизнеспособности клеток эпителиальной во вставке после анализа. Фотографии были сделаны сразу же после введения реагента жизнеспособности (Prestoblue) (0 ч) и Following утро (ON). **: Р <0,01 с помощью теста Манна-Уитни U. ON: в течение ночи. Шкала бар: 100 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Decidualization является прогестерон-зависимой дифференцировки эндометриальных стромальных клеток в круглые секретирующие децидуальных клеток. У человека этот процесс происходит спонтанно в течение лютеиновой фазы менструального цикла и инициируют в стромальных клетках, окружающих клетки сосудов с образованием predecidua. Тем не менее, у грызунов, наличие бластоцисты крайне важно, чтобы побудить decidualization. Тот факт, что decidualization происходит только после контакта с эндометриальных эпителиальных клеток подразумевает, что важные факторы, которые секретируются эпителиальными клетками, чтобы вызвать decidualization в нижележащей стромой. Хотя эта разница в начале процесса decidualization следует признать тот факт, что человек decidualization становится более устойчивым при имплантации эмбриона позволяет предположить, что подобные механизмы могут быть вовлечены. В пробирке клеточных культур часто используются для изучения влияния специфических молекул в процессе decidualization.Тем не менее, наличие и количество человеческих тканей , которые могут быть собраны часто ограничено и сопровождается изменениями, например, фазы цикла, количество беременностей и наличие гинекологических заболеваний , как эндометриоз или аденомиоз. Многие из этих проблем могут быть предотвращены использованием мышиной ткани, который легко доступен и фазы цикла независимы. Другим сильным преимуществом использования мышиной ткани является возможность использовать генетически модифицированные грызуны и возможность установки большого количества экспериментов. На данный момент, множество различных протоколов изоляции, были описаны в литературе, с высокой изменчивостью в возрасте животных и период течки в фазе в момент использования.

Это исследование представляет новый метод первичного эндометрия сопутствующих культур стромальных и эпителиальных клеток, в которых преимущество было принято стандартизированного эстрального цикла путем ежедневной инъекции эстрогена предварительного выделения. Кроме того, эстроген кNown индуцировать пролиферацию эпителиальных и стромальных клеток, которые дополнительно увеличивает выход за изоляцию. Протокол изолирования , описанный в этой статье , был основан на Грант и др. ^7, тем не менее, были включены дополнительные шаги по оптимизации , чтобы увеличить выход, чистота и жизнеспособности различных клеточных культур. Во-первых, HBSS всегда была дополнена с антибиотиками, чтобы избежать загрязнения первичной культуры. Во время выделения MEEC, адаптация температуры было сделано (15 мин при 37 ° С), чтобы увеличить урожай эпителиальных клеток в течение первого пищеварения. Далее, дополнительный шаг был включен к отпускной ферментативную активность после того, как трипсин-переваривание добавлением среды, содержащей FBS, чтобы ингибировать его активность. Кроме того, MEECs пропускали через фильтр из которых сетка была больше, чем то, что обычно описывается (100 мкм), так как они часто приходят в кластерах и клеточных листов. Кроме того, загрязнение стромальных клеток была уменьшена путем выполнения надстройкиitional этап, на котором MEECs и MESCs были отделены друг от друга на основе гравитационного осаждения. И, наконец, MEECs высевали на коллаген покрытием покровные увеличить присоединение клеток к покровные стекла, как стало ясно, что привязанность к непокрытыми или ФАПЧ покрытием покровные стекла была недостаточной. Во время изоляции MESCs, коллагеназы (1 мг / мл), дополненной для улучшения пищеварения. Кроме того, этот шаг ферментацию проводили в двух экземплярах, чтобы избежать загрязнения оставшихся MEECs. Все эти дополнительные шаги привели в чистых и жизнеспособных культур популяций однородных клеток.

Чистота популяции клеток оценивали с иммунное и QRT-ПЦР с использованием в качестве виментин стромы маркера и цитокератином как эпителиальный маркера. Очевидно, что наблюдалась противоположная картина экспрессии виментину и цитокератином в MEEC и MESC. Тем не менее, можно заметить, что относительное экспрессии мРНК виментину и цитокератином похож на MEEC культурах. SimilРезультаты А.Р. публикуются другими исследовательскими группами, в которых эпителиальные клетки в выражении виментина культуры приобретают ^9. Более важным является различие в экспрессии белка между виментину и цитокератином, как наблюдалось в иммуногистологических окрашиванием различных клеточных популяций. Двойной иммунное показал, что ОЦОД были положительными для цитокератином и ESC были положительными для виментину. Использование этих маркеров в иммунное окрашивание является признанным методом и Стандартно используется для указания типов элементов ^10.

Хотя много исследований было выполнено на decidualization мЭСК, остается возможным, что присутствие эпителиальных клеток в этой модели может изменить результаты decidualization. Во-первых, было показано, что если MEEC растут на монослой в присутствии МЕСК-кондиционированной среды или в условиях совместного культивирования монослой имеет улучшенную эпителиальные клетки трансэпителиального электрического сопротивления (TEER), в результате чего из факторов , секретируемых MESC ^7. К тому же , Пьерро и др. ¹¹ при условии доказательства того, что эпителиальной пролиферации, под влиянием эстрадиола-17 & beta ; , возможно , опосредована факторами , секретируемыми из стромальных клеток, а также в качестве альтернативы, эпителиальные клетки могут выделять факторы , которые модулируют стромы decidualization ^{12, 13.} В целом, очевидно, что окружающая среда сокультуры эпителиально-стромальных обеспечивает более физиологическую ситуацию, которая позволяет паракринной взаимодействия и коммуникации. Способ культивирования двух различных типов клеток с использованием системы сокультивирования вставки была описана ранее ^{14, 15} и был адаптирован для использования мышиных первичных клеток. Путем выявления уровня мРНК пролактина как считыванием для decidualization, описанный метод имеет очень воспроизводимые считывание для decidualization доступны и позволяютS, таким образом, изучение эпителиально-стромальных взаимоотношений во время decidualization. ПАРАКРИННОЙ сигналы, опосредованные от MEEC может изменить степень decidualization в стромальных клетках. Кроме того, модель позволяет специфической модуляции эпителиальной стороне, не влияя непосредственно стромальных клеток. Поэтому, это совместное культивирование MEEC и MESC предлагает идеальный инструмент для оценки влияния гормонов, цитокинов и т.д. на эпителиальных клетках с считыванием на стромальных decidualization. Другим преимуществом этой системы сокультуры является то, что она позволяет ученым исследовать причастность конкретного белка в decidualization-процесса либо в эпителиальные или стромы отсека с использованием клеток, выделенных из трансгенных животных. Кроме того, этот метод будет очень полезным для изучения адгезии бластоцисты, чтобы оценить ли факторы паракринные секретируемые эпителиальными клетками в присутствии бластоцисты достаточны, чтобы вызвать decidualization нижележащего стромальныхклетки. Важным шагом в трофобласта вторжения коррелирует с внеклеточной деградации матрицы, которая опосредуется действием протеолитических ферментов. Предложенный метод может быть применен в качестве модели в пробирке для исследования перекрестных помех между бластоцисты, эпителиальных клеток и поддерживающей стромы.

Тем не менее, на данный момент мало известно о происхождении эпителиальных клеток, которые могут быть так же, как просветная железистые. Таким образом, дальнейшая характеристика генетического и молекулярного профиля эпителиальных клеток требуется. Кроме того, описанный способ ограничен в имеющихся знаний о поляризации эпителиальных клеток. На данный момент, поляризация эпителиальных клеток не было принято во внимание. Тем не менее, различия в экспрессии мембранных белков описаны в апикальных и базальных мембран. Неуместный поляризация эпителиального слоя может оказать влияние на паракринной взаимодействия между epitheliи др клетки стромы. Тем не менее, способы получения поляризованных эпителиальных клеток было описано и могут быть включены в описанной методике ^{15, 16.}

В целом, описанный протокол предлагает технологию для успешного создания первичных культур клеток мышиного внутриматочной эпителиальные и стромальные клетки. Этот метод приводит в чистых культурах клеток, что подтверждается QRT-PCR и иммунное виментину и цитокератином. В конечном счете, эпителиальной и стромальных совместно культуры была введена, что позволяет для исследования паракриновых сигналов, опосредованных либо MEEC и / или MESC в процессе decidualization.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant	Greiner Bio-one	662610	Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/
Nunc Cell culture treated 24 well plates	Thermo Scientific	142475	http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma Aldrich	B7880	Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE
Medroxyprogesterone 17-acetate	Sigma Aldrich	M1629	Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE
Arachis oil	Supermarket		Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent	Thermo Scientific	A13261	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175-046	Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046
17-β Estradiol	Sigma Aldrich	E8875	Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized	Merck Millipore	SCGPU05RE	http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL)	Gibco	15070-063	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES	Gibco	11330-032	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin	Gibco	10500-056	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B	Gibco	15290-018	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL)	Gibco	15750-037	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Sigma Aldrich	D5921	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105	Sigma Aldrich	M6395	Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE
Insulin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	I1882	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø	Glaswarenfabrik Karl Hecht	1001/18	http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 &tx_rmproducts_pi1[p]=3504 &tx_rmproducts_pi1[v]=20088 &cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06
Poly-L-lysine	Sigma Aldrich	P2636	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum	Sigma Aldrich	C2674	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190-094	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas	Sigma Aldrich	T7409	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300-054	Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable	BD Falcon	352340	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable	BD Falcon	352360	https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized	Merck Millipore	SLGP033RS	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100%	Merck Millipore	1.00063	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I	Corning	354236	From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=& productid=354236%28 Lifesciences%29#
Pancreatin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	P3292	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile	BD Falcon	353001	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent	VWR Chemicals	20821296	https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)	Cell Signalling Tech	#5741	Use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin	Sigma Aldrich	C2562	Use 1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS	Affymetrix	19943	http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ
Goat serum	Sigma Aldrich	G9023	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488	Thermo Scientific	A-11034	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;;conjugates:^\%22Alexa%20Fluor®%20488\%22$;;
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594	Thermo Scientific	A-11032	http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594& resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium	Gibco	14040174	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133