לא פולשני<em&gt; בויבו</em&gt; פלואורסצנטי הדמיה אופטית של פעילות MMP דלקתית באמצעות Activatable פלואורסצנטי סוכן הדמיה

Summary

מאמר זה מסביר את היישום של הדמיה פלואורסצנטי באמצעות בדיקת הדמיה אופטית activatable לדמיין את הפעילות vivo של metalloproteinases מטריצה ​​מפתח בשני מודלים ניסיוניים שונים של דלקת.

Abstract

מאמר זה מתאר שיטה לא פולשנית metalloproteinases מטריצה ​​הדמיה (MMP) - פעילות על ידי בדיקה פלואורסצנטי activatable, באמצעות in vivo פלואורסצנטי הדמיה אופטית (OI), בשני מודלים עכבר שונים של דלקת: דלקת מפרקים שגרונית (RA) ואיש קשר מודל תגובה רגישות (CHR). אור עם אורך גל בחלון אינפרא אדום הקרוב (NIR) 650 - 950 ננומטר) מאפשר חדירת רקמה עמוקה יותר וקליטה אות מינימלית לעומת אורכי גל מתחת 650 ננומטר. היתרונות העיקריים באמצעות פלואורסצנטי OI היא שזה זול, מהיר וקל ליישם דגמים שונים של בעלי חיים.

בדיקות ניטור Activatable הם שתיקה אופטית במדינות שלהם מומת, אבל להיות מאוד פלורסנט כאשר מופעל על ידי פרוטאז. הופעל MMPs להוביל להרס רקמות לשחק תפקיד חשוב להתקדמות המחלה בתגובות hyperersensitivity סוג מתעכב (DTHRs) כגון RA ו CHR. יתר על כן, MMPs הםאת פרוטאזות מפתח עבור סחוס העצם השפלה והם המושרה על ידי מקרופאגים, fibroblasts ו chondrocytes בתגובה לציטוקינים פרו דלקתיים. כאן אנו משתמשים בדיקה כי הוא מופעל על ידי MMPs מפתח כמו MMP-2, -3, -9 ו -13 ו לתאר פרוטוקול הדמיה עבור קרוב הקרינה אינפרא אדום OI של פעילות MMP ב RA ו עכברים שליטה 6 ימים לאחר אינדוקציה המחלה גם כן כמו בעכברים עם אקוטי (1x אתגר) וכרוני (5x אתגר) CHR על האוזן הימנית לעומת האוזניים בריא.

Introduction

מחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים שגרונית (RA) או vulgaris פסוריאזיס מדורגות כמו תגובות של רגישות יתר מסוג מתעכב (DTHRs). RA ¹ היא מחלה אוטואימונית נפוצה המאופיינת סינוביטיס מכרסמת והרס המפרק. ² דלקת מפרקים מוסתים להפגין חדירה והתפשטות של תאי דלקת, ביטוי מוגבר של תאי פרו-דלקתיים מובילים להיווצרות pannus, סחוס והרס עצם. מחשוף ^{3, 4} של מולקולות תא מטריקס, כגון קולגן על ידי metalloproteinases מטריצה (MMPs), הוא חיוני עבור המרת רקמות אנגיוגנזה וגורם הרס רקמות. ^{5, 6} תגובות רגישות-יתר לתקשר (CHR) מאופיין צבירה של נויטרופילים שמובילים פרץ חמצונים. ⁷ בדומה RA, MMPs ב CHR הם involVed ב המרה רקמות, הגירה תא אנגיוגנזה על מנת ליצור דלקת כרונית.

כדי לחקור RA, גלוקוז 6-פוספט איזומראז (GPI) - סרום מזרק עכבר המודל שימש. ⁸ סרום מעכברים K / BxN מהונדס המכיל נוגדנים נגד GPI, הוזרק לתוך BALB / עכברים c נאיבי לאחר מכן דלקת ראומטית החלה להתפתח בתוך 24 שעות עם מקסימום של נפיחות בקרסול ביום 6 לאחר הזרקה בסרום GPI (ראה 1.1). כדי לנתח CHR כרונית, C57BL / 6 עכברים היו רגיש עם trinitrochlorobenzene (TNCB) על הבטן. האוזן הימנית נתגלתה עד 5 פעמים החל משבוע לאחר הרגישות (ראה גם 1.1 ו -1.2).

Noninvasive חיה קטנה OI היא טכניקה המבוססת על in vivo החקירה של אותות ניאון, chemiluminescent ו- bioluminescent, אשר משמשים בעיקר במחקר פרה קליני. הנתונים הכמותיים הנרכשים מספקים תובנות למולקמנגנוני ular באיברים ורקמות של בריא כמו גם במודלים של בעלי חיים חולים ניסיוני, ומאפשר האורך מעקב מדידות (למשל להעריך פרופילים בתגובה טיפוליים in vivo). יתרון גדול של מחקרים ארוכים טווח הוא ההפחתה של מספרי בעלי חיים, כמו באותן החיות ניתן למדוד במחקרי מעקב במספר נקודות זמן במקום להשתמש בעכברים שונים לכל נקודת זמן. הרזולוציה של OI מאפשרת הדמיה תפקודית מפורטת של איברים ואף מבני רקמות קטנים יותר בחיות מעבדה.

השימוש מסנן עירור ופליטה ספציפי עם ספקטרום שידור צר, הגנה נגד אור מפוזר על ידי lightproof "תיבה כהה" ואת מכשיר טעון מצמידים רגיש (CCD) מצלמה, אשר מקורר במכשירים רבים עד -70 ° C , מאפשר מאוד מדידות ספציפיות ורגישות של אותות הקרינה.

באמצעות סוכני ניאון עם excitation- ופליטה-ספקטרה בחלון הקרינה האינפרה-אדום הקרוב (650 - 950 ננומטר), אות-לרעש ניתן לשפר יחסים משמעותיים. חלון הקרינה האינפרה-אדום הקרוב מתאפיין קליטה נמוכה יחסית של האות על ידי ההמוגלובין ומים וכן קרינה אוטומטית רקע נמוך. ⁹ זה מאפשר עומק החדירה של עד 2 ס"מ רקמות של חיות קטנות. OI-בדיקות יכולות לטפל יעד ישירות (למשל על ידי נוגדן הנקרא קרינה) או יכולות להיות מופעלת ברקמת היעד (למשל על ידי פרוטאזות). בדיקות OI Activatable שותקים אופטיים בצורתם המומתת בשל העברת אנרגית תהודת פורסטר (סריג) כדי מחצית מרווה, אשר מעבירה את אנרגית העירור בתוך מולקולת לתחום אחר. אם הצבע הוא ביקע (על ידי הפרוטאז למשל) האנרגיה כבר לא יועברו בתוך המולקולה אות ניאון יכול להיות מזוהים על ידי OI. זה מאפשר תכנון של בדיקות OI עם specificit גבוההy עבור תהליכים ביולוגיים ברורים אות לרעש-יחסים מעולים.

הפרוטוקול הבא מסביר בפירוט על הכנת החיות, מדידות OI באמצעות בדיקת OI Activatable לתמונת MMP-2, -3, -9 ו -13 פעילות in vivo ושני דגמים ניסיוניים של דלקת (RA, CHR).

Protocol

כל ההליכים המתוארים במאמר זה, בעקבות הקווים המנחים והסטנדרטים הבינלאומיים של טיפול ושימוש בבעלי מעבדה, אושרו על ידי הוועדה המקומית לרווחת בעלי חיים ואתיקה של ועדת המדינה Tuebingen, גרמניה. 8 - 12 שבועות BALB / C ו C57BL / 6 עכברים נשמרו על 12 שעות: 12 שעות אור: מחזור כהה היו שוכנו IVCs ותנאים סביבתיים סטנדרטיים ב 22 ± 1 מעלות צלזיוס בקבוצות של 2 - 5 עם מים גישה למודעה .

1. הכנה חומרית

1. לדלל את צבע OI עבור קרוב אינפרא אדום הדמיה פלואורסצנטי על פי גיליון הנתונים בהתאמה ישירות לפני ההזרקה. צבע oi activatable (בדיקה מסחרית עם עירור ב 680 ננומטר) כדי למדוד MMPs ב vivo מוכן להשתמש בריכוז של 20 nmol ב 1.5 מ"ל 1x PBS. נער בעדינות או מערבולת את הפתרון לפני השימוש. OI צבע ניתן לאחסן 2 - 8 מעלות צלזיוס למשך עד 6 חודשים כאשר מוגן מפני האור.
2. לקבלת תוך ורידי (IV) זריקות להכין צנתר ורידי. השתמש 20 U (0.5 מ"ל) מזרק אינסולין מלאים תמיסת מלח 0.9% (המכיל 10 יחידות הזרקה של הפרין 50 מ"ל), ו מחט 30-מד מחובר קטטר פוליאתילן. להזריק את המינון המומלץ של 2 nmol לכל עכבר של צבע OI.

אינדוקציה 2. של דלקת מפרקים שגרונית לבין התגובה לתקשר רגישות יתר כרונית

1. דלקת מפרקים שגרונית:
   1. לדלל 100 μL של בסרום (שנצבר K / BxN עכברים ¹⁰⁾ נוגדנים המכיל (AB) נגד איזומראז גלוקוז-6-פוספט (GPI) 1: 1 עם PBS 1x (200 μL) כדי לגרום RA. אחסן את הסרום המדולל ב -80 מעלות צלזיוס. נהלים מפורטים אינדוקציה של RA מתוארים על ידי ואח Monach. ^8.
   2. כדי לגרום RA, להרים כל עכבר בעדינות בזנב להזריק 200 μL של intraperitoneal בסרום מדולל (IP) ביום 0 של tהוא הניסוי. לאחר הזריקה במקום העכבר ישירות לתוך הכלוב שלה.
   3. לחלופין, למדוד את קוטר הקרסול של כל הקרסול, לפני זריקות א.ב. ולהגדיר "ניקוד מפרקי" ( איור 1 א ). המשך המדידה של נפיחות בקרסול יומי עד יום 6 לאחר הסרום GPI באמצעות מכשיר מדידה מכני (מיקרומטר).
   4. להזריק את הצבע oi activatable (שלב 1.1 - 1.2), כדי למדוד vivo MMP פעילות IV לתוך הווריד הזנב של עכברים RA ביום 5 לאחר הזרקת GPI-serum לתוך וריד הזנב של עכברים שליטה. בצע ניסויים הדמיה אופטי 24 שעות לאחר הזרקת הווריד הזנב.
2. תגובה רגישות תגובה:
   1. עבור רגישות של C57BL / 6 עכברים, להכין פתרון TNCB 5% מומס תערובת של 4: 1 של אצטון / שמן.
   2. להרדים C57BL / 6 עכברים באמצעות 1.5% isoflurane vaporized ב 100% חמצן (1.5 L / min). לאחר עכברים מורדמים, למקם אותו עצמית מטורף חרוט האף (חתך 5 מ"ל פוליאתילן מזרק, המחובר צינור 1.5% isoflurane%) ולשמור על הרדמה. החל משחת עיניים וטרינר על בעלי חיים הרדים כדי למנוע יובש בעיניים בזמן הרדים.
   3. לגלח את הבטן בזהירות (2 x 2 ס"מ) באמצעות גוזם שיער קטן חיה. הימנע מפגיעה בעור, שכן זה יכול להוביל אותות ניאון ספציפיים בתוך החיה והוא יכול להשפיע על תוצאות המחקר.
   4. החל 80 μL של פתרון TNCB 5% באיטיות באזור הבטן מגולח באמצעות פיפטה 100 μL כדי לרגש את החיה. מניחים את העכבר בעדינות בחזרה לתוך הכלוב שלה דואג להבטיח כי העיניים של העכבר לא באים במגע עם מצעים כדי למנוע פגיעה בקרנית ולהימנע טמפרטורות גוף נמוך במהלך שלב ההחלמה.
   5. שישה ימים לאחר רגישות, להכין פתרון TNCB 1% (מומס בתערובת של 9: 1 של אצטון / שמן) ולהחיל 20 μL באוזן ימין באמצעות פיפטה כדי לעורר CHSR חריפה כרונית."> 1
      1. התחל עם האתגר 1 ^st משני צידי האוזן הימנית עם 20 μL של פתרון 1% TNCB בעזרת פיפטה 100 μL וחזור האתגר מדי יום שני עד חמש פעמים (יום 15 לאחר סנסיטיזציה) כדי לעורר CHR (איור 1B) . למדוד עובי האוזן יומי, באמצעות מכשיר מדידה מיקרומטר.
   6. להזריק את צבע OI activatable (בדיקה מסחרית עם עירור ב 680 ננומטר) (שלב 1.1-1.2) כדי למדוד את פעילות MMP in vivo בעכברי CHR 12 שעות לאחר האתגר. בצע ניסויי הדמיה אופטית 24 שעות לאחר זנב וריד להזרקה (iv).

3. הכנת בעלי חיים עבור דימות אופטי

1. עכבר חלף צ'או (לפחות הדמית 3 ימים לפני כן) צ'או נמוכה או שאינו פלואורסצנטי (למשל, מנגן חינם) כדי למנוע את ההפרעה של קרינה אוטומטית (סביב 700 ננומטר) עם אות הקרינה של סוכני OI בשימוש.
2. מניח את החיהכדי הרדמה תיבת להרדים באמצעות 1.5% ISO% isoflurane vaporized עם חמצן (1.5 L / min) (חמצן יכול להיות מוחלף על ידי אוויר אבל צריך להיות סטנדרטי בתוך ניסוי אחד).
3. כאשר העכבר הוא הרדים בעליל, למקם אותו חרוט האף עצמו (לבנות על ידי לחתוך 5 מזרק פוליאתילן מ"ל, מחובר צינור 1.5% isoflurane%) ולשמור על הרדמה.
4. לגלח את החיה בזהירות באתר היעד (2 ס"מ x 2 ס"מ) באמצעות גוזם שיער קטן חיה. הימנע מפגיעה בעור, שכן זה יכול להוביל אותות ניאון ספציפיים בתוך החיה והוא יכול להשפיע על תוצאות המחקר.
   הערה: השיער יכול לספוג את האות הקרינה במהלך OI (תלוי בלחץ העכבר, ספיגה פחות או יותר הוא ציין) בהתאם לאזור של ריבית (החזר ROI).
5. עבור הזרקת iv , מניחים את זנב העכבר במים מחוממים, כדי לעורר vasodilation, בעדינות לטהר את העור באתר ההזרקה עם אלכוהול, ולהתחיל על ידי הצבת catheter בבאתר הדיסטלי של הזנב. מניח את "לחתוך" קצה המחט, בזווית של 20 מעלות לתוך וריד הזנב ולבדוק את הנחת הנכון של הקטטר על ידי מחדש השעיית המזרק.
6. אם את הקטטר ממוקם כראוי, להחליף את המזרק ולהזריק את החללית OI (2 ננומול). לאחר הזרקה, להחליף את המזרק להזריק 25 μL של תמיסת מלח 0.9% ל מלא ברור הנפח המת של צינור פוליאתילן.
   הערה: בפעם מחצית חי הרקמות של צבע OI בשימוש (בדיקה מסחרית עם עירור ב 680 ננומטר) למדידת פעילות MMP in vivo היא 72 h. כדי להבטיח אישור מלא, מחדש הזרקה של הצבע אינה מומלצת לפני 7 ימים לאחר הזרקה מוקדמת.

4. דימות אופטי

1. מניחים פלסטיק שחור או גיליון נייר את הקופסה השחורה של הסורק-OI במרכז שדה הראייה (FOV).
2. הגדרת פרוטוקול מדידה ולבחור את הגל הנכון (עירור: 680 ± 10 ננומטר ו eמשימה: 700 ± 10 ננומטר) ופרמטרים הדמיה.
   הערה: במערכות OI מסוימות, ההגדרה עבור מספר צבעי הדמיה מוגדרת מראש.
3. כדי לבחור את הפרוטוקול הנכון עבור הדמיה פלואורסצנטי, לפתוח את תוכנת הדמיה (המסופקים על ידי היצרן) ולאתחל את המערכת. רוב מצלמות CCD צריך להתקרר לטמפרטורת העבודה שלהם, וזה יכול לקחת 10 דקות. לקבלת תוצאות אמינות, המתן עד שהמערכת תהיה מוכנה.
4. שים לב ב vivo מערכת הדמיה רכישת לוח הבקרה צצים למעלה וכל זוג מסנן נבחר ייצג תמונה אחת ברצף. במקרה זה, לרכוש תמונה אחת עם זוגות המסנן עבור צבע מסחרי עם גירוי ואת פליטת אורך גל של 680 ± 10 ננומטר ו 700 ± 10 ננומטר, בהתאמה, ולהתחיל את המדידה (לחץ על "רצף רכישת"). לקבלת הוראות מפורטות יותר, עיין במדריך של היצרן.
5. לייבל את התמונות כראוי ולשמור את המידע "ערוך תמונהתוויות "חלון, אשר יהיה לצוץ בעקבות" רצף לרכוש ".
6. קח סריקה בסיסית של כל חיה לפני ההזרקה של צבע OI, או להשתמש בחיות שליטה נאיבי כדי להבדיל את הרקע האות.
7. H לאחר הזרקת הווריד הזנב של צבע OI, במקום החיות במרכז של FOV, בעמדה כדי למדוד את האות הגבוהה ביותר במערכת OI, ולהתחיל את המדידות.
   הערה: חשוב: היפותרמיה יכולה להשפיע באופן משמעותי על התפלגות חומרי ההדמיה. ודא כי הבמה מחומם עד 37 ° C, כדי למנוע היפותרמיה של החיה. הדמיה יכולה להתבצע בו זמנית עם בעלי חיים בקבוצות של 1 עד 5 עכברים. בחר את הגודל של FOV בהתאם למספר בעלי חיים למדוד בו זמנית. באפשרותך לצלם תמונת שדה בהירה כדי לבדוק אם כל עכבר גלוי.

5. ניתוח נתונים

הערה: בצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנת התמונה הבאההפרוטוקול של היצרן.

1. עבור מדידות של RA, השתמש יחידת מכויל של פליטת הפוטון כפי שמוצג באיור 2 , בעוד CHSR כרונית הם בתמונה כמו עוצמת האות באחוזים (יעילות).
2. כדי לצייר ROIs באופן ידני, השתמש בצלחת הכלי. לניתוח של תמונות RA להשתמש במעגל סטנדרטי, ממוקם סביב האות הגבוהה ביותר בכל הקרסוליים וכפות של כל חיה. כדי לנתח את CHSR, מניחים את החזרים ROI סביב האוזן הימנית והשמאלית בהתאם לתמונת השדה הבהיר.
3. כדי למדוד את פליטת הפוטון או ערכי עוצמת האות בהחזר ROI המסוים, לחץ על "מדידה". המערכת תספק ערכים בהחזר על ההשקעה המתואר לניתוח סטטיסטי תיאורתי.

תוצאות

כדי לגרום דלקת מפרקים שגרונית (RA) בעכברים BALB / ג נאיבי, חיות הוזרקו IP עם נוגדנים עצמיים (1: 1 דילול עם PBS 1x) נגד GPI ביום 0. הדלקת המרבי (הקרסול ונפיחות) ב GPI-סרום זה המושרה דגם RA הוא על הזרקה פוסט יום 6 ^11. לכן, 2 ננומול של צבע OI activatable הוכן והזרי?...

Discussion

OI הוא כלי מאוד שימושי, מהיר ולא יקר עבור פולשני בתחום ההדמיה המולקולרית vivo במחקר פרה-קליניים. חוסנה החברתי בפרט של OI הוא היכולת לנטר תהליכים דינמיים מאוד כמו תגובות דלקתיות. יתר על כן, OI מאפשר לעקוב אחר מהלך מחלה במשך תקופה ארוכה של זמן, החל מספר ימים עד שבועו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cornergel	Gerhard Mann GmbH	1224635	ophthalmic ointment
Forene	Abbott GmbH	4831850	isoflurane
U40 insulin syringe	Becton Dickinson and Company	324876
Heparin	Sintetica	6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm	Reichelt Chemietechnik GmbH+Co	28460	polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm
BD Regular Bevel Needles, 30 G	Becton Dickinson & Co. Ltd.	305106	30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer	Vetland Medical Sales and Services LLC	-
Artagain drawing paper	Strathmore Artist Paper	446-8	coal black
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G	Becton Dickinson and Company	305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene	Sigma Aldrich GmbH	7987456F	TNCB
MMPSense 680	Perkin Elmer	NEV10126	fluorescent imaging dye
Oditest	Koreplin GmbH	C1X018	mechanical measurment
Miglyol 812	SASOL	-	Oil
BALB/C, C57BL/6	Charles River Laboratories	-	Mice used for experiements
PBS	Sigma Aldrich GmbH		For dilution of the RA serum
Pipette (100 µL)	Eppendorf		Used for TNCB application
shaver	Wahl	9962	Animal hair trimmer
Living Image	Perkin Elmer		Imaging software to measure OI