无创<em&gt;体内</em炎性MMP活性的使用可激活荧光成像剂&gt;荧光光学成像

摘要

本文阐述了荧光成像的使用可活化的光学成像探针可视化键基质金属蛋白酶的体内活性在炎症的两个不同的实验模型中的应用。

摘要

本文介绍了一种非侵入性的方法，用于成像基质金属蛋白酶（MMP）由活化的荧光探针-activity， 通过 体内荧光光学成像（OI），在炎症的两个不同的小鼠模型:类风湿关节炎（RA）和接触超敏反应（CHR）模型。在近红外（NIR）窗口的波长的光（650 - 950 nm）的允许更深的组织穿透和最小的信号的吸收相比，低于650纳米的波长。使用荧光OI的主要优点是，它是便宜，快速，易于在不同的动物模型来实现。

活化的荧光探针在它们的失活状态的光学沉默，但通过蛋白酶激活时变得高度荧光的。活化蛋白酶引起组织破坏并播放在迟发型超敏反应（DTHRs）如RA和CHR疾病进展中起重要作用。此外，MMP是对于软骨和骨降解和键的蛋白酶是由巨噬细胞，成纤维细胞和软骨细胞响应于促炎细胞因子引起的。在这里，我们使用由密钥的MMP活化等MMP-2，-3探针，-9和-13和描述的成像协议用于RA MMP活性的近红外荧光的OI和对照小鼠6天疾病诱导后以及如急性（1X挑战）和慢性（5次挑战）在右耳CHR比健康耳朵的小鼠。

引言

自身免疫疾病如类风湿关节炎（RA）或牛皮癣被分级为延迟型超敏反应（DTHR）。 ¹ RA是以侵蚀性滑膜炎和关节破坏为特征的常见自身免疫性疾病。 ²炎性关节炎关节表现出炎症细胞的浸润和增殖，增加炎症细胞的表达，导致血管us形成，软骨和骨破坏。 ^3，4细胞外基质分子如基质金属蛋白酶（MMPs）的胶原蛋白的切割对组织转化和血管生成至关重要，并导致组织破坏。 ^5，6接触超敏反应（CHR）的特征是中性粒细胞的聚集，导致氧化爆发。 ⁷与RA相似，CHR中的MMPs是不同的粘弹性阻尼器在组织转化，细胞迁移和血管生成，以便建立慢性炎症。

为了研究RA，使用了葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI） - 血清注射小鼠模型。从含有抗GPI抗体的转基因K / BxN小鼠⁸血清，注入幼稚BALB / c小鼠后，其风湿性炎症开始与GPI-血清注射后第6天溶胀最大脚踝的24个小时（参见1.1）中培养。为了分析慢性CHR，C57BL / 6小鼠用在腹部trinitrochlorobenzene（TNCB）致敏。右耳被质疑到开始致敏1周后5次（也参见1.1和1.2）。

非侵入性的小动物OI是基于荧光基团，chemiluminescent-和生物发光-信号，这些信号主要用于在临床前研究的体内研究的技术。所获得的半定量的数据给出了分析上市公司molec在机关ular机制和健康组织以及患病实验动物模型，并且使得纵向后续测量（ 例如 ，以评估在体内治疗响应简档）。纵向研究的一大优势是动物数量的减少，因为相同的动物可以在后续的研究在几个时间点，而不是每个时间点使用不同的小鼠中测得的。 OI的分辨率允许器官的详细的功能成像和在实验动物中甚至更小的组织结构。

的特定激发和发射滤光片具有窄透射光谱，由遮光对散射光保护"暗盒"和一个敏感的电荷耦合器件（CCD）相机，其在许多设备冷却到-70℃，使用允许高度特异性和荧光信号的敏感测量。

通过使用荧光剂与excitation-和近红外荧光窗（650 - 950 nm）的发射光谱可以显着提高信噪比。近红外荧光窗的特征在于通过血红蛋白和水对信号的相对较低的吸收以及低的背景自动荧光。 ⁹允许小动物组织中的穿透深度达2厘米。 OI探针可以直接（ 例如通过荧光标记的抗体）靶向靶标，或者可以在靶组织中（ 例如通过蛋白酶）活化。由于Förster共振能量转移（FRET）到淬灭部分，活化的OI探针以其失活形式光学沉默，其将分子内的激发能转移到另一个结构域。如果染料被切割（例如通过蛋白酶），则能量不再在分子内转移，并且可以通过OI检测荧光信号。这允许设计具有高特异性的OI探针y用于不同的生物过程和优异的信噪比。

以下协议详细说明了动物的制备，使用可活化OI探针在体内成像MMP-2，-3，-9和-13活性的OI测量和两个炎症实验模型（RA，CHR）。

研究方案

本文中描述的所有程序都遵循实验动物护理和使用的指导方针和国际标准，并得到了德国Tuebingen国家委员会动物福利与道德委员会的批准。 8-12周龄的BALB / c和C57BL / 6小鼠保持12小时12小时光线:黑暗循环，并以22±1℃的标准化环境条件容纳在IVC中，用水和2〜5组，食物随意获取。

材料准备

1. 根据注射前直接的数据表稀释OI染料进行近红外荧光成像。可活化的OI染料（680nm激发的商业探针） 在体内测量MMPs可以在1.5mL 1x PBS中以20nmol的浓度使用。使用前请轻轻晃动或旋转溶液。 OI染料可以在2 - 8°C下保存长达6个月，防止光照。
2. 静脉注射 （ iv ）制备静脉导管。使用填充有0.9％盐水溶液（含有10μl注射单位的肝素在50mL中）的20U（0.5mL）胰岛素注射器，以及连接到聚乙烯导管的30号针头。注射OI染料每只小鼠推荐剂量2 nmol。

2.诱发类风湿关节炎和慢性接触性超敏反应

1. 类风湿关节炎:
   1. 用1x PBS（200μL）稀释100μL含有针对葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）1:1的抗体（AB）的血清（从K / BxN小鼠¹⁰获得）以诱导RA。将稀释的血清储存在-80℃。诱导RA的详细程序由Monach 等人描述 ⁸ 。
   2. 为了诱导RA，通过尾巴轻轻地抬起每只小鼠，并在t的第0天腹膜内（ ip ）注射200μL稀释的血清他实验注射后将鼠标直接放回笼中。
   3. 可选地，在AB注射之前测量每个踝关节的踝直径并定义"关节炎评分"（ 图1A ）。使用机械测量装置（千分尺）在GPI血清后继续测量踝部肿胀直到第6天。
   4. 注射可激活的OI染料（步骤1.1-1.2），以测量RA小鼠尾静脉内的体内 MMP活性 在GPI-血清注射后第5天进入对照小鼠的尾静脉。尾静脉注射24 h后进行光学成像实验。
2. 接触超敏反应:
   1. 为了敏化C57BL / 6小鼠，制备溶解在4:1丙酮/油混合物中的5％TNCB溶液。
   2. 麻醉C57BL / 6小鼠，使用1.5％异氟醚在100％氧气（1.5升/分钟）内蒸发。一旦将小鼠麻醉，就将其置于自发之中 È鼻锥（切口5毫升聚乙烯注射器中，连接到1.5体积％的异氟烷​​管）和维持麻醉。对麻醉动物兽医应用眼膏，以防止眼睛干涩，而麻醉。
   3. 剃使用小动物毛发修剪器仔细腹部（2×2cm）上。避免伤及皮肤，因为这可能会导致动物体内非特异性荧光信号，并能影响研究结果。
   4. 使用100微升移液管致敏动物申请80μL的5％TNCB溶液慢慢在剃毛的腹部区域。将鼠标轻轻放回笼子照顾，以确保鼠标的眼睛不来与床上用品的接触，避免角膜损伤，并在恢复阶段避免低体温。
   5. 致敏后6天，制备1％TNCB溶液（溶解在9:1的丙酮/油的1:1混合物），并使用移液管以引起急性和慢性CHSR在右耳处应用20μL。"> 1
      1. 开始与在右耳两侧的1 ^个挑战与用100μL移液管1％TNCB溶液20μL，并重复挑战每隔一天最多五次（致敏后第15天）以引发CHR（ 图1B） 。每日测量耳朵的厚度，使用测微计测量装置。
   6. 注入可活化OI染料（步骤1.1-1.2），以测量在攻击后12个小时的小鼠CHR 体内 MMP活性（具有在680 nm激发商业探针）。进行光学成像实验24小时后尾静脉注射（IV）。

3.动物的制备用于光学成像

1. 开关小鼠食物到低或非荧光食物（ 例如 ，无锰），以避免自发荧光的干扰（约700纳米）与所使用的OI剂的荧光信号（在成像前至少3天）。
2. 放置动物到麻醉箱和麻醉使用具有氧（1.5L /分钟）蒸发的1.5体积％的异氟烷​​（氧气可以由空气置换，但需要一个实验中标准化的）。
3. 当鼠标被可见麻醉，将其放置在一个自制鼻锥（由切口5毫升聚乙烯注射器中，连接到1.5体积％的异氟烷​​管建立）和维持麻醉。
4. 仔细剃使用小动物毛发修剪器的目标部位（2厘米×2cm）上对动物。避免伤及皮肤，因为这可能会导致动物体内非特异性荧光信号，并能影响研究结果。
   注:毛发可以吸收OI中的荧光信号（依赖于小鼠品系，更多或观察到较少的吸收），这取决于所关注（ROI）的区域。
5. 对于静脉内注射，将小鼠尾中温热水，以诱导血管舒张，温和地清洁注射部位用酒精皮肤，并且通过将导管在开始尾部的远端位置。将针的"切割"边缘以20°的角度放入尾静脉，并通过重新悬挂注射器来测试导管的正确放置。
6. 如果导管放置正确，请更换注射器并注入OI探针（2 nmol）。注射后，更换注射器并注入25μL的0.9％盐水溶液以完全清除聚乙烯管的死体积。
   注意:用于测量体内 MMP活性的所用OI染料（680nm激发的商业探针）的组织半衰期为72小时。为了确保完全清除，在先前注射后7天内不推荐重新注射染料。

光学成像

1. 将黑色塑料或纸张放置在视野（FOV）中心的OI扫描仪的黑盒中。
2. 设置测量协议并选择合适的波长（激发:680±10 nm，任务:700±10nm）的成像和参数。
   注意:在某些OI系统中，几个成像染料的设置是预先定义的。
3. 要选择用于荧光成像的正确的协议，打开成像软件（由制造商提供的）和初始化系统。大多数CCD摄像机需要冷却到其工作温度，而这可能需要10分钟。对于可靠的结果，等到系统已准备就绪。
4. 观察体内成像系统获取控制面板弹出，并选择的每个过滤器对将所述序列中代表一个图像。在这种情况下，获得一个图像具有用于分别与所述的商业染料和680±10nm的激发和发射波长和700±10nm，则过滤器对，并且开始测量（按"获取序列"）。有关详细说明，请参阅制造商的说明书。
5. 合适的标签图像并保存信息中的"编辑图像标签"窗口，其将在"获取序列"之后弹出。
6. 在注射OI染料之前对每只动物进行基线扫描，或使用幼稚的对照动物来区分背景信号。
7. 在尾静脉注射OI染料之后，将动物置于FOV的中心，以测量OI系统中最高的信号，并开始测量。
   注意:重要:低体温可以显着影响成像剂的分布。确保将舞台加热至37°C以避免动物体温过低。成像可以与1至5只小鼠的动物同时进行。根据同时测量的动物数量选择FOV的大小。您可以拍摄明亮的场景图像来检查每个鼠标是否可见。

数据分析

注意:使用以下图像软件执行数据分析制造商的协议。

1. 对于RA的测量，使用光子发射的校准单元， 如图2，而慢性CHSR以百分比（效率）描绘为信号强度。
2. 手动绘制的ROI，使用工具板。用于RA图像的分析使用标准化的圆，在每个动物的所有脚踝和爪子周围放置最高信号。为了分析CHSR，将投资回报围绕整个权，并根据明视场像左耳。
3. 为了测量光子发射或在所述特定绘制ROI，按"测量"信号强度值。该系统将提供用于描述性统计分析绘制的ROI值。

结果

为了在初始的BALB / c小鼠中诱导类风湿性关节炎（RA），在第0天将动物与GPI自动抗体（1×1稀释，1x PBS）腹腔注射。该GPI-血清诱导的最大炎症（踝肿胀） RA模型是在第6天后注射¹¹ 。因此，制备2nmol的可激活的OI染料，并在注射后第24天（第6天）将iv注射到关节炎小鼠和健康对照动物的尾静脉中，小鼠被麻醉并按照第3节（ 图1A ）。

讨论

OI是临床前研究中非侵入性体内分子成像的非常有用，快速和便宜的工具。 OI的特殊优势是监测高度动态过程（如炎症反应）的能力。此外，OI允许人们在一段时间内跟踪疾病进程，时间范围从几天到几周。

OI具有优于其他体内成像模式（如正电子发射断层扫描（PET）或磁共振成像（MRI））的优点，因为它是非常时间和成本有效的。每次采集多达5只动物的高通?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cornergel	Gerhard Mann GmbH	1224635	ophthalmic ointment
Forene	Abbott GmbH	4831850	isoflurane
U40 insulin syringe	Becton Dickinson and Company	324876
Heparin	Sintetica	6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm	Reichelt Chemietechnik GmbH+Co	28460	polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm
BD Regular Bevel Needles, 30 G	Becton Dickinson & Co. Ltd.	305106	30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer	Vetland Medical Sales and Services LLC	-
Artagain drawing paper	Strathmore Artist Paper	446-8	coal black
IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G	Becton Dickinson and Company	305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene	Sigma Aldrich GmbH	7987456F	TNCB
MMPSense 680	Perkin Elmer	NEV10126	fluorescent imaging dye
Oditest	Koreplin GmbH	C1X018	mechanical measurment
Miglyol 812	SASOL	-	Oil
BALB/C, C57BL/6	Charles River Laboratories	-	Mice used for experiements
PBS	Sigma Aldrich GmbH		For dilution of the RA serum
Pipette (100 µL)	Eppendorf		Used for TNCB application
shaver	Wahl	9962	Animal hair trimmer
Living Image	Perkin Elmer		Imaging software to measure OI