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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cet article explique l'application de l'imagerie fluorescente à l'aide d'une sonde d'imagerie optique activable pour visualiser l'activité in vivo des métalloprotéinases matricielles clés dans deux modèles expérimentaux différents d'inflammation.

Résumé

Cet article décrit une méthode non invasive pour imager l'activité de la métalloproteinases matricielles (MMP) par une sonde fluorescente activable, via l' imagerie optique fluorescente in vivo (OI), dans deux modèles d'inflammation de souris: une polyarthrite rhumatoïde (RA) et un contact Modèle de réaction d'hypersensibilité (CHR). La lumière avec une longueur d'onde dans la fenêtre infrarouge proche (NIR) (650 - 950 nm) permet une pénétration plus profonde des tissus et une absorption minimale du signal par rapport aux longueurs d'onde inférieures à 650 nm. Les principaux avantages de l'OI de fluorescence sont qu'il est bon marché, rapide et facile à mettre en œuvre dans différents modèles animaux.

Les sondes fluorescentes activables sont silencieuses optiquement dans leurs états inactivés, mais deviennent très fluorescentes lorsqu'elles sont activées par une protéase. Les MMP activées conduisent à la destruction des tissus et jouent un rôle important pour la progression de la maladie dans des réactions d'hypersensibilité à retard de type (DTHR) telles que la PR et la CHR. En outre, les MMP sontles protéases essentielles pour le cartilage et la dégradation des os et sont induites par les macrophages, les fibroblastes et les chondrocytes en réponse à des cytokines pro-inflammatoires. Ici, nous utilisons une sonde qui est activé par les MMPs clés comme la MMP-2, -3, -9 et -13 et décrivons un protocole d'imagerie à fluorescence infrarouge proche OI de l'activité de MMP dans la polyarthrite rhumatoïde et les souris témoins 6 jours après l'induction de la maladie ainsi comme chez la souris avec aiguë (1x challenge) et chroniques (5x challenge) CHR sur l'oreille droite par rapport à l'oreille en bonne santé.

Introduction

Les maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde (RA) ou le psoriasis vulgaire sont classées comme des réactions d'hypersensibilité de type retardé (DTHR). 1 La PR est une maladie auto-immune commune caractérisée par une synovite érosive et une destruction articulaire. 2 Les articulations arthritiques inflammées démontrent l'infiltration et la prolifération de cellules inflammatoires, une expression accrue de cellules pro-inflammatoires conduisant à la formation de pannus, au cartilage et aux destructions osseuses. 3 , 4 Le clivage de molécules de matrice extracellulaire, comme le collagène par métalloproteinases matricielles (MMP), est essentiel pour la conversion tissulaire et l'angiogenèse et provoque des destructions tissulaires. 5 , 6 Les réactions d'hypersensibilité au contact (CHR) sont caractérisées par l'agrégation des neutrophiles conduisant à un éclatement oxydatif. 7 Similaires à la RA, les MMP en CHR sont involontairesDans la conversion des tissus, la migration cellulaire et l'angiogenèse afin d'établir une inflammation chronique.

Pour étudier la PR, on a utilisé le modèle de souris à injection injectable de glucose-6-phosphate isomérase (GPI) -serum. 8 Le sérum provenant de souris K / BxN transgéniques contenant des anticorps contre GPI a été injecté dans des souris BALB / c naïves après quoi une inflammation rhumatismale a commencé à se développer dans les 24 h avec un gonflement maximal de la cheville au jour 6 après une injection de GPI-sérum (voir 1.1). Pour analyser la CHR chronique, les souris C57BL / 6 ont été sensibilisées avec du trinitrochlorobenzène (TNCB) sur l'abdomen. L'oreille droite a été remise en question jusqu'à 5 fois, commençant 1 semaine après la sensibilisation (voir aussi 1.1 et 1.2).

L'OI de petit animal non invasif est une technique basée sur l'étude in vivo des signaux fluorescents, chimioluminescents et bioluminescents, qui sont principalement utilisés dans la recherche préclinique. Les données semi-quantitatives acquises donnent des indications sur la moléculeDans les organes et les tissus des modèles animaux expérimentaux sains et malades, et permet des mesures longitudinales de suivi ( par exemple pour évaluer les profils de réponses thérapeutiques in vivo ). Un grand avantage des études longitudinales est la réduction du nombre d'animaux, car les mêmes animaux peuvent être mesurés dans des études de suivi à plusieurs moments au lieu d'utiliser différentes souris par point de temps. La résolution de l'OI permet une imagerie fonctionnelle détaillée des organes et même des structures tissulaires plus petites dans les animaux expérimentaux.

L'utilisation de filtres d'excitation et d'émission spécifiques avec un spectre de transmission étroit, une protection contre la lumière dispersée par une "boîte foncée" résistant à la lumière et une caméra de dispositif à couplage chargé (CCD) sensible qui est refroidie dans de nombreux appareils jusqu'à -70 ° C , Permet des mesures très spécifiques et sensibles des signaux de fluorescence.

En utilisant des agents fluorescents à excitation etLes spectres d'émission dans la fenêtre de fluorescence proche infrarouge (650 - 950 nm), les rapports signal sur bruit peuvent être considérablement améliorés. La fenêtre de fluorescence proche du rayon infrarouge se caractérise par une absorption relativement faible du signal par l'hémoglobine et l'eau ainsi que par une faible fluorescence d'arrière-plan. 9 Cela permet une profondeur de pénétration allant jusqu'à 2 cm dans le tissu des petits animaux. Les sondes OI peuvent traiter directement une cible ( par exemple par un anticorps marqué par fluorescence) ou peuvent être activées dans le tissu cible ( par exemple par des protéases). Les sondes OI activables sont optiquement silencieuses sous leur forme inactivée en raison du transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET) à une fraction de trempe qui transfère l'énergie d'excitation dans la molécule à un autre domaine. Si le colorant est clivé (par une protéase par exemple), l'énergie n'est plus transférée dans la molécule et un signal fluorescent peut être détecté par OI. Cela permet de concevoir des sondes OI avec une spécificité élevéeY pour des processus biologiques distincts et d'excellents rapports signal / bruit.

Le protocole suivant explique en détail la préparation des animaux, les mesures OI en utilisant une sonde activable OI pour imaginer l'activité MMP-2, -3, -9 et -13 in vivo et deux modèles expérimentaux d'inflammation (RA, CHR).

Protocole

Toutes les procédures décrites dans cet article ont suivi les lignes directrices et les normes internationales relatives aux soins et à l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité local d'éthique et d'éthique des animaux de la Commission du pays Tuebingen (Allemagne). Les souris BALB / c et C57BL / 6 de 12 à 12 semaines ont été conservées sur une lumière de 12 h: 12 h: cycle sombre et ont été logées dans des IVC et des conditions environnementales normalisées à 22 ± 1 ° C dans des groupes de 2 à 5 avec de l'eau et Accès alimentaire ad libitum .

1. Préparation du matériel

  1. Diluer le colorant OI pour l'imagerie par fluorescence proche infrarouge selon la fiche de données respective directement avant l'injection. Le colorant OI activable (sonde commerciale avec une excitation à 680 nm) pour mesurer les MMP in vivo est prêt à l'emploi à une concentration de 20 nmol dans 1,5 mL 1x PBS. Agiter doucement ou tourbillonner la solution avant utilisation. Le colorant OI peut être conservé à 2 à 8 ° C pendant jusqu'à 6 mois lorsqu'il est protégé de la lumière.
  2. Pour les injections par voie intraveineuse (iv) préparer un cathéter veineux. Utiliser un 20 U (0,5 ml) de seringue à insuline remplie de solution à 0,9% de solution saline (contenant 10 unités d'injection d'héparine dans 50 mL), et une aiguille de calibre 30 fixée à un cathéter en polyethylene. Injecter la dose recommandée de 2 nmol par souris du colorant OI.

2. L'induction de la polyarthrite rhumatoïde et chronique contact Réaction d'hypersensibilité

  1. La polyarthrite rhumatoïde:
    1. Diluer 100 ul de sérum (obtenu à partir de K / BxN souris 10) contenant des anticorps (AB) contre isomérase glucose-6-phosphate (GPI) 1: 1 avec 1 x PBS (200 ul) pour induire RA. Stocker le sérum dilué à -80 ° C. Des procédures détaillées pour l' induction de la polyarthrite rhumatoïde sont décrits par Monach et al. 8.
    2. Pour induire RA, soulever chaque souris doucement par la queue et injecter 200 ul de la intrapéritonéale de sérum dilué (ip) au jour 0 de til expérience. Après l'injection placer la souris directement dans sa cage.
    3. Eventuellement, mesurer le diamètre de la cheville de chaque cheville, avant les injections AB et définir un « score arthritique » (figure 1A). Continuer la mesure de la cheville de gonflement par jour jusqu'à ce jour 6 après GPI-sérum en utilisant un dispositif de mesure mécanique (micromètre).
    4. Injecter le colorant activable OI (étape 1.1 à 1.2), pour mesurer in vivo l' activité de MMP iv dans la veine caudale de souris RA au jour 5 après l'injection GPI-sérum et dans la veine de la queue des souris témoins. Réaliser des expériences d'imagerie optique 24 h après injection dans la veine de la queue.
  2. Contactez réaction d'hypersensibilité:
    1. Pour la sensibilisation des souris C57BL / 6, préparer une solution à 5% de TNCB dissous dans un mélange 4: 1 d'acétone / huile.
    2. Anesthésier souris C57BL / 6 en utilisant 1,5% d'isoflurane vaporisé dans 100% d'oxygène (1,5 L / min). Une fois que les souris sont anesthésiées, placez-le dans une auto-fou Le cône du nez (une seringue en polyéthylène de 5 ml, reliée au tube isoflurane à 1,5% en volume) et à maintenir l'anesthésie. Appliquer la pommade visuelle sur les animaux anesthésiés afin d'éviter la sécheresse des yeux lorsqu'ils sont anesthésiés.
    3. Raser soigneusement l'abdomen (2 x 2 cm) à l'aide d'un coupe-cheveux pour animaux. Évitez de nuire à la peau, car cela peut conduire à des signaux fluorescents non spécifiques dans l'animal et peut influencer les résultats de l'étude.
    4. Appliquer 80 μL de la solution à 5% de TNCB lentement à l'abdomen rasé en utilisant une pipette de 100 μl pour sensibiliser l'animal. Placez la souris doucement dans sa cage en prenant soin de s'assurer que les yeux de la souris ne sont pas en contact avec le lit pour éviter les lésions de la cornée et éviter les faibles températures corporelles pendant la phase de récupération.
    5. Six jours après la sensibilisation, préparer une solution de TNCB à 1% (dissous dans un mélange 9: 1 d'acétone / huile) et appliquer 20 μL à l'oreille droite en utilisant une pipette pour provoquer une CHSR aiguë et chronique."> 1
      1. Commencez par le 1 er défi des deux côtés de l'oreille droite avec 20 μL de solution à 1% de TNCB en utilisant une pipette de 100 μL et répétez le défi tous les deux jours jusqu'à cinq fois (jour 15 après sensibilisation) pour obtenir CHR ( Figure 1B ) . Mesurez l'épaisseur de l'oreille tous les jours, en utilisant un appareil de mesure micrométrique.
    6. Injecter le colorant OI activable (une sonde commerciale avec excitation à 680 nm) (étape 1.1-1.2) pour mesurer l'activité MMP in vivo dans des souris CHR 12 h après la provocation. Effectuer des expériences d'imagerie optique 24 h après injection de veine de queue ( iv ).

3. Préparation animale pour l'imagerie optique

  1. Passez la souris (au moins 3 jours avant l'imagerie) à des aliments peu ou non fluorescents ( p. Ex . Sans manganèse) pour éviter l'interférence de l'auto-fluorescence (environ 700 nm) avec le signal de fluorescence des agents OI utilisés.
  2. Placez l'animal dansÀ une boîte d'anesthésie et anesthésie en utilisant 1,5% en volume d'isoflurane vaporisé avec de l'oxygène (1,5 L / min) (l'oxygène peut être remplacé par de l'air mais doit être normalisé au cours d'une expérience).
  3. Lorsque la souris est visiblement anesthésiée, placez-la dans un cône de nez fabriqué à l'envers (construisez par une seringue en polyéthylène de 5 mL, reliée au tube isoflurane à 1,5 vol%) et maintenez l'anesthésie.
  4. Raser soigneusement l'animal sur le site cible (2 cm x 2 cm) à l'aide d'un coupe-cheveux pour animaux. Évitez de nuire à la peau, car cela peut conduire à des signaux fluorescents non spécifiques dans l'animal et peut influencer les résultats de l'étude.
    REMARQUE: Les poils peuvent absorber le signal de fluorescence pendant l'OI (en fonction de la contrainte de la souris, plus ou moins d'absorption est observée) selon la région d'intérêt (ROI).
  5. Pour une injection intraveineuse, placez la queue de la souris dans de l'eau chaude, pour induire une vasodilatation, nettoyez doucement la peau au point d'injection avec de l'alcool et commencez par placer le cathéter àLe site distal de la queue. Placez le bord "coupé" de l'aiguille dans un angle de 20 ° dans la veine de la queue et testez le bon placement du cathéter en ré-suspendre la seringue.
  6. Si le cathéter est placé correctement, remplacez la seringue et injectez la sonde OI (2 nmol). Après l'injection, remplacez la seringue et injectez 25 μL de solution saline à 0,9% pour nettoyer complètement le volume mort du tube en polyéthylène.
    NOTE: La demi-vie des tissus du colorant OI usé (une sonde commerciale avec excitation à 680 nm) pour mesurer l'activité MMP in vivo est de 72 h. Pour assurer un dégagement complet, une nouvelle injection du colorant n'est pas recommandée avant 7 jours après une injection préalable.

4. Imagerie optique

  1. Placez une feuille de plastique ou de papier noir dans la boîte noire du scanner OI au centre du champ de vision (FOV).
  2. Configurez un protocole de mesure et choisissez la longueur d'onde droite (excitation: 680 ± 10 nm et eMission: 700 ± 10 nm) et des paramètres d'imagerie.
    REMARQUE: Dans certains systèmes d'OI, la configuration de plusieurs colorants d'imagerie est pré-défini.
  3. Pour choisir le protocole approprié pour l'imagerie de fluorescence, ouvrez le logiciel d'imagerie (fourni par le fabricant) et initialiser le système. La plupart des caméras CCD doivent refroidir à leur température de fonctionnement, et cela peut prendre 10 minutes. Pour des résultats fiables, attendez que le système est prêt.
  4. Observer le panneau de commande d'acquisition de système d'imagerie in vivo sautent vers le haut , et chaque paire de filtres sélectionné représente une image de la séquence. Dans ce cas, acquérir une image avec les paires de filtres pour le colorant commercial avec et une longueur d'onde d'excitation et d'émission de 680 ± 10 nm et 700 ± 10 nm, respectivement, et commencer la mesure (Appuyez sur « Acquisition séquence »). Pour obtenir des instructions plus détaillées, s'il vous plaît consulter le manuel du fabricant.
  5. Étiqueter les images correctement et enregistrer les informations dans le « Modifier l'imageLes étiquettes » fenêtre qui apparaîtra après la « séquence Acquire ».
  6. Prenez une analyse de base de chaque animal avant l'injection du colorant OI, ou utiliser les animaux témoins naïfs pour différencier le signal d'arrière-plan.
  7. h après l'injection de la veine de la queue du colorant OI, placer les animaux dans le centre de la FOV, en mesure de mesurer le signal le plus élevé dans le système OI, et le début des mesures.
    REMARQUE: Important: Hypothermie peut influencer de manière significative la distribution des agents d'imagerie. Assurez-vous que la scène est chauffée à 37 ° C pour éviter l'hypothermie de l'animal. L'imagerie peut être effectuée en même temps que les animaux par groupes de 1 à 5 souris. Choisissez la taille du FOV en fonction du nombre d'animaux à mesurer en même temps. Vous pouvez prendre une image de champ lumineux pour vérifier si chaque souris est visible.

5. Analyse des données

REMARQUE: Effectuer une analyse des données à l'aide du logiciel d'imagele protocole du fabricant.

  1. Pour les mesures de RA, utiliser l'unité calibrée de l'émission de photons , comme indiqué sur la figure 2, alors que CHSR chronique est représenté comme l' intensité du signal en pour cent (efficacité).
  2. Pour dessiner manuellement ROI, utiliser la plaque d'outil. Pour l'analyse des images RA utiliser un cercle normalisé, placé autour du signal le plus élevé dans toutes les chevilles et les pattes de chaque animal. Pour analyser le CHSR, placez les ROIs dans toute droite et l'oreille gauche selon l'image de champ lumineux.
  3. Pour mesurer l'émission de photons ou de signaler des valeurs d'intensité dans la ROI spécifique dessinée, appuyez sur « mesure ». Le système fournira des valeurs dans le retour sur investissement pour l'analyse statistique tirée descriptive.

Résultats

Pour induire la polyarthrite rhumatoïde (RA) chez des souris naïves BALB / c, les animaux ont été injectés ip avec des auto-anticorps (dilution 1: 1 avec 1x PBS) contre GPI au jour 0. L'inflammation maximale (gonflement de la cheville) dans ce Sérum GPI induit Le modèle RA est le jour 6 après injection 11 . Par conséquent, 2 nmol du colorant OI activable ont été préparés et injectés iv dans la veine de la queue de souris arthrit...

Discussion

OI est un outil très utile, rapide et peu coûteux pour l'imagerie moléculaire in vivo non invasive dans la recherche préclinique. Une force particulière d'OI est la capacité de surveiller des processus hautement dynamiques comme les réponses inflammatoires. En outre, OI permet de suivre le cours d'une maladie pendant une période prolongée, allant de jours en semaines.

OI présente plusieurs avantages par rapport à d'autres modalités d'imagerie...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Remerciements

Nous remercions Daniel Bukala, Natalie Altmeyer et Funda Cay pour un excellent support technique. Nous remercions Jonathan Cotton, Greg Bowden et Paul Soubiran pour l'édition du manuscrit. Ce travail a été soutenu par la Fondation Werner Siemens et la Faculté de Médecine de l'Université Eberhard Karlsund Tübingen ('' Promotionskolleg '') et par le DFG par le biais du CRC 156 (projet C3).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
CornergelGerhard Mann GmbH1224635ophthalmic ointment 
ForeneAbbott GmbH4831850isoflurane
U40 insulin syringeBecton Dickinson and Company324876
HeparinSintetica6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mmReichelt Chemietechnik GmbH+Co28460polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 GBecton Dickinson & Co. Ltd.30510630 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizerVetland Medical Sales and Services LLC-
Artagain drawing paperStrathmore Artist Paper446-8coal black
IVIS SpectrumPerkin Elmer124262Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 GBecton Dickinson and Company305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzeneSigma Aldrich GmbH7987456FTNCB
MMPSense 680Perkin Elmer NEV10126fluorescent imaging dye
Oditest Koreplin GmbHC1X018mechanical measurment
Miglyol 812SASOL-Oil
 BALB/C, C57BL/6Charles River Laboratories -Mice used for experiements
PBSSigma Aldrich GmbHFor dilution of the RA serum 
Pipette (100 µL)Eppendorf Used for TNCB application 
shaver Wahl 9962Animal hair trimmer
Living Image Perkin Elmer Imaging software to measure OI

Références

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