כימות של תסיסנית התנהגות Grooming

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה assay להרחבה אישית assay בתסיסנית כי התשואות נתונים חזקים, כמותיים כדי למדוד התנהגות הטיפוח. השיטה מבוססת על השוואת ההבדל הצטברות צבע על גופים של חיות מטופחות לעומת מטופח על פני תקופה של זמן.

Abstract

תסמונת הטיפוח ההתנהגות היא מורכבת מורכבים צעד רב תוכנית הדורשת תנועה מתואמת של שתי קדמיות ו hindlegs. כאן אנו מציגים פרוטוקול assay grooming עיצוב קאמרית הרומן כי הוא חסכוני וניתן להרחבה עבור מחקרים קטנים או בקנה מידה גדול של תסיסנית תסיסנית . זבובים מאובקים בכל הגוף שלהם עם צבע צהוב מבריק ניתנה זמן כדי להסיר את הצבע מגופם בתוך החדר. זבובים מופקדים אז בנפח קבוע של אתנול כדי solubilize את הצבע. ספיגה ספקטרלית יחסית של דגימות אתנול לצבוע עבור חיות מטופחות לעומת מטומטמים נמדדים ומתועדים. פרוטוקול התשואות נתונים כמותיים של הצטברות צבע עבור זבובים בודדים, אשר ניתן בקלות ממוצעים לעומת דגימות. זה מאפשר עיצובים ניסיוניים בקלות להעריך יכולת הטיפוח עבור מחקרים בבעלי חיים מוטציה או מניפולציות מעגל. הליך זה יעיל הוא גם צדדי וניתן להרחבה. אנו מראים wזרימת אורק של הפרוטוקול ונתונים השוואתיים בין בעלי חיים WT לבין בעלי חיים מוטנטים עבור סוג תסיסנית אני דופמין קולטן ( DopR ).

Introduction

Grooming ב תסיסנית melanogaster ( ד melanogaster ) היא התנהגות מולדת חזקה הכוללת את התיאום של מספר רב של תוכניות עצמאיות המנוע ¹ . פירות זבובים לנקות את גופם של אבק, חיידקים, פתוגנים אחרים שיכולים לעכב תפקוד פיזיולוגי נורמלי כגון חזון הטיסה, או להוביל לאתגרים חיסונית משמעותית. בחישה ובמענה לפעולה מכנית ² ופעילות חיסונית ³ , זבובים משפשפים שוב ושוב את רגליהם או על אזור גוף ממוקד עד שהוא נקי מספיק והטיפוח מתקדם לחלק אחר של הגוף. זבובים לבצע תנועות grooming ב מובהק bouts כי מתרחשות בעיקר בדפוסים סטריאוטיפיים ^{1 , 4} . היררכיה התנהגותית מתבהרת כאשר אותות הטיפוח מסודרים לפי סדר עדיפויות. מעגלים ודפוסי פעילות זוהו בתמיכהFa, כי תוכניות הטיפוח בחלק העליון של ההיררכיה להתרחש הראשון לדכא אותות מקבילים מאזורים של הגוף כי הם groomed לאחר מכן ⁵ . העדיפות הגבוהה ביותר ניתנת לראש, אחר כך את הבטן, כנפיים, ולבסוף את בית החזה ⁵ .

תוכנית הטיפוח ב- D. melanogaster היא מערכת אידיאלית לחקר מעגלים עצביים, אותות מולקולריים מודולאריים ומעבירים נוירוטרנסמיטריים. לדוגמה, פשרה של תפקוד neurofibromin ⁶ , אובדן של תסיסנית X חלבונים פיגור שכלי נפשי ( dfmr1 ) ⁷ , וחשיפה bisphenol A (BPA) ⁸ כל לגרום להתנהגויות מוגזמות והתנהגויות אחרות אשר מקביל לסימפטומים אנושיים נפרדים של neurofibromatosis, שביר X תסמונת, ואת ההיבטים של הפרעות ספקטרום האוטיזם הפרעת קשב וריכוז Hyperactivity הפרעת (ADHD), בהתאמה. התנהגות Grooming יכול להיות גם הרגלטד דיפרנציאלי על פני זנים מוטציה ² , ההלוואות זו תוכנית המנוע ללימודי גמישות התנהגותית. רוחב התופעות הנוירולוגיות שניתן לדגם על ידי תסיסנית דורש גישה השוואתית חדשה למדוד את היכולת של זבובים לחתן את עצמם.

הפעולה המשולבת של מובילי monoamine שלפוחית ​​ואת השפע היחסי של דופמין ואמינים ביוגניים אחרים בגוף הוכחו לתווך זבוב פרי התנהגות grooming ^{9 , 10} . Octopamine ודופאמין לעורר פעילות טיפוח hindleg דומה זבובים ערופים, בעוד טירמין, החומר המוצא לייצור octopamine, תופעל גם טיפוח ובמידה פחותה ^7. ארבעה קולטנים דופאמין זוהו ב ד melanogaster ^{11 , 12 , 13 , 14} על ידי שימוש בשיטה assay הטיפוח המתואר בפרוטוקול זה, קבענו תפקיד עבור סוג אני משפחה Dopamine קולטן DopR ( DopR, dDA1, מטומטם ) ב hindleg התנהגות grooming ¹⁵ .

הטיפוח ניתן לכימות בעקיפין על ידי הסתכלות על מידת הניקיון שבו חיה יכולה לחתוך באופן מלא לאחר אבק לכל הגוף עם צבע סמן או אבק פלואורסצנטי ^{5 , 16} . שאר שאריות האבק שנותרו על הגוף יכולות לשמש כסמן יחסי להתנהגות הכללית. זבובים מאובקים לאחר שקיבלו מספיק זמן כדי החתן עשוי להיות לידי ביטוי גירעון מסוים בהתנהגות grooming. כמו חקירות הטיפוח הפכו נרחב יותר, פרוטוקולים שולבו פרקטיקות כגון עריפת ראש כדי להוסיף טיפולים תרופתי על הצוואר עצבי החיבור ¹⁰ , גירוי מישוש של זיפים כדי לעורר את התגובה grooming ² ,והקלטת וידאו של התנהגות ¹⁵ . תצפית ישירה של הטיפוח ניתן ללמוד בקלות באמצעות תצפית חזותית הקלטה ידנית של תדירות ומשך של אירועים grooming ספציפיים ⁴ .

עיצבנו חמישה עשר חדרים grooming כי ניתן לבנות עם מדפסת 3D או חותך לייזר, ואת עיצובים תכנית מתאר זמינים עבור רבייה ¹⁵ . העיצוב משתמש בשני לוחות מרכזיים מחוברים עם פתחים מתאימים מופרדים על ידי רשת ושני לוחות הזזה העליון והתחתון, שממנו זבובים ו / או צבע נטען, בהתאמה. לאחר המאפשרים זבובים אבק זמן החתן, אנו להפקיד אותם אתנול כדי solubilize לצבוע ולמדוד את ספיגת של פתרון זה באורך גל של צבע. קורא צלחת ניתן להשתמש בדגמים מקבילים מרובים או ספקטרופוטומטר יחיד לקרוא ניתן להשתמש עבור דגימות בודדות. שיטה זו ממזער את השגיאה המושרה על ידי טיפול אלLows עבור grooming assays להיות לרוץ על קטן, חסכונית בקנה מידה. שיטה זו נגזרת ו שונה מן השיטות חלוץ על ידי ג 'ולי סימפסון אנדרו זרעים, אשר משתמשים בתאי grooming גדול עם אלמנטים חימום עבור מניפולציות מעגל טמפרטורה רגישה ⁵ . פרוטוקול הבא מציג את כימות של הטיפוח של הגוף כולו, כמו גם מראה שיטות חלופיות quantitation של הצטברות צבע על חלקי גוף בודדים. כמו כן, אנו מציגים נתוני השוואה מדגם בין מוטציות WT ו- DopR , כמו גם שיטות לחישוב מדד ביצועים פשוט להתנהגות הטיפוח.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנה

1. הכן aspirator להזיז תסיסנית לחיות מתוך בקבוקון תרבות לחדר grooming. Aspirators לאפשר העברת בעלי חיים מודעים לתאי התנהגות כדי להבטיח כי הרדמה אינה משפיעה על התצפית ההתנהגותית שלאחר מכן.
   1. באמצעות מספריים לחתוך 1.5 מטר של צינור tygon מזהה ⅛ ", OD ¼". Cut לפחות 1 אינץ 'של קצה קצה 1 מ"ל חד פעמי micropipette. החזק חתיכת 1 ס"מ מרובע של רשת (פתיחה 0.196 אינץ ') על קצה לחתוך.
      הערה: רוב עצות 1mL יש קו הדרגתית שבו קצה יושב בתיבת החבילה, בדרך כלל לחתוך לקו זה.
   2. במקום snugly טרי 1 מ"ל micropipette עצה מעל קצה / רשת לחתוך. התבוננו בצורת רשת בין שני הטיפים. החלק הפנימי של קצה חדש יוצר חדר החזקת זבובים.
   3. חותכים את קצה קיצוני של קצה micropipette חדש להרחיב את פתיחת מספיק כדי לאפשר מעבר של זבוב אחד. הולדואר יהיה בערך להתאים את הפתיחה של החדר grooming (כ 1.5-2 מ"מ קוטר).
   4. התקינו בקפידה את הקצות המקוננות על קצה צינורות הטיגון. דחוף את הקצות לתוך הצינור כדי להבטיח התאמה הדוקה כדי לאפשר לחץ ואקום.
   5. בקצה השני של הצינור, לחתוך את קצה קצה micropipette 200 μL ולהתאים את סוף לחתוך צר לתוך צינורות. זהו הצד "הפה" של השואף.
2. הכן צינורות aliquot אבק. שוקלים כ 5 מ"ג של צבע צהוב מבריק על נייר במשקל שקוף. יוצקים את האבק לתוך צינור microcentrifuge 0.6 מ"ל לסגור בחוזקה את הכובע.
   הערה: אנו מייעצים לשימוש כפפות ניטריל במהלך הכנה aliquot, כמו כמה כפפות לטקס חדיר לצבוע.
3. חזור על שלב 1.2) עבור כל דגימות בניסוי (אחד לכל זבוב בכל חדר).
4. הכן אתנול (EtOH) צינורות: פיפ 1 מ"ל של EtOH 100% לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מ"ל. תווית צינורות עבור גנוטיפים או תנאים/ Li>
5. חזור על שלב 1.4) עבור כל דגימות בניסוי (אחד לכל זבוב בכל חדר). שווי ולשמור את צינורות EtOH להשלמת assay הטיפוח. גם לכלול לפחות אחד "ריק" מדגם אשר יהיה רק ​​1 מ"ל EtOH ללא זבוב עבור שולטת שלילית.
6. להרכיב כל חדר grooming ידי הברגה צלחת העליון מחליק (עם חורים קטנים), אבל משאיר את הצלחת התחתונה (עם חורים גדולים) הוסרו עבור תוספת של אבק.
7. מניחים כל חדר השינה grooming הכרחי על השולחן עם הפנים למעלה למטה. הצד הזבוב של הכניסה הוא כלפי מטה.
8. טען 5 מ"ג Brilliant צבע aliquot מבריק לתוך החדר על ידי הקשה על הצינור על פני השטח של החדר מעל הבאר הרצוי. הקש על החדר נגד השולחן כדי להבטיח כי כל האבק נופל דרך הרשת אל צלחת העליון.
9. הברג את הצלחת התחתונה על כל חדר כזה הקצוות הרחבים של הפתחים חרוטי הפנים החוצה את החורים לא לנוח על הבארות. לאבטח את הבוטצלחת טום בחוזקה, כך שהוא לא להחליק ולשחרר צבע.
10. הפוך את החדר מעל לדפוק אותו על השולחן כמה פעמים, כך האבק נופל דרך הרשת לנוח על הצלחת התחתונה.
11. החלק את הצלחת העליונה של החדר לתוך "מיקום פתוח", כך חורים קטנים ליישר עם חמש עשרה בארות, המאפשר את כניסתם של זבובים לתוך בארות בודדים.

2. לטוס-אבק ו grooming

1. טען זבוב אחד לתוך aspirator הפה על ידי מציצה בעדינות דרך קצה אחד של aspirator כאילו באמצעות קש. להפקיד את הזבובים על ידי נושבת קלות לכוון את הפתח לכיוון המטרה.
2. לשאוב זבוב אחד לתוך כל משמש היטב עבור הניסוי. לאחר טעינת באר, החלק את הצלחת העליונה כך לטוס הוא לכוד בחדר קלטת במקום מעל הפתיחה של זה היטב במהלך הטעינה של החדר כולו כדי למנוע את הבריחה של הזבוב תוך טעינת בארות אחרות. אם זבובים מרובים הם aspirated לתוך סינגלובכן, להשאיר את הפתח חשף עד רק זבוב אחד נשאר.
3. לאחר כל הבארות הדרושים מלאים זבובים, תהפכו את החדר כך את הצלחת התחתונה היא כלפי מעלה, כך אבק יש פוטנציאל מעיל את הזבובים על ידי נפילה דרך הרשת.
4. מאובטח היטב את צלחות העליון והתחתון על ידי הידוק הברגים, ו מערבולת החדר לאבק את הזבובים במשך 4 שניות.
5. לדפוק את החדר (צלחת העליונה כלפי מטה) על השולחן פעמיים כך צבע נופל אל הצד השני. לאחר מכן, להפוך את החדר מעל (צלחת העליונה כלפי מעלה) ולהפיל את החדר פעמיים כדי להבטיח צבע מתיישב על הרצפה של החדר התחתון הרחק זבוב שנערך בחדר העליון.
6. עבור זבובים שליטה אשר אינם מורשים החתן, מיד להמשיך לשלב 3 של הפרוטוקול. עבור זבובים כי ישלים את assay, המשך לשלב 2.7.
7. הניחו את החדר קאמרית על שולחן או משטח עם צלחת העליון כלפי מעלה במשך שלושים דקות כדי לאפשר זבובים לחתן. מניחים את התאאה רעש ורעש ללא שטח לשמור על הסביבה שלך קבוע לכל הניסויים grooming (רמות תאורה, לחות, טמפרטורה). אינקובטור שולחן ב RT או 25 ° C עם לחות שולט הוא אידיאלי.

3. הכנת דוגמאות וניתוח ספיגה

1. שמירה על רמה קאמרית עם צלחת למעלה כלפי מעלה, בעדינות לפתוח את הצלחת התחתונה ולהסיר אותו מן החדר, נזהר לא לאבד צבע.
2. מניחים את החדר על משטח פליי CO ₂ עם זרימת אוויר נמוכה עד זבובים הם מורדמים.
3. פתחו את צלחת העליון מהחדר. בזהירות להשתמש במלקחיים לתפוס רגל ולהזיז אחד לטוס אבק מכל חדר ולהפקיד אותו צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל המכיל EtOH. זמן ההעברה עבור 15 תאים כל אחד המכיל זבוב אחד הוא כ 3-5 דקות. הניסוי צריך גורם פעמים העברה אם / כאשר ניסויים מדהימים עם תאים מרובים כדי להבטיח היערכות יעילה של ניסויים.
4. לאחר כל צינור microcentrifuge מכיל 1 לטוס, לסגור את מכסה ולהפוך את הצינור שלוש פעמים כדי לעורר ולערבב את הפתרון של צבע ואתנול.
5. דגירה צינורות המכילים אתנול זבובים עבור 5 שעות ב RT כדי להבטיח הסרת מלאה של צבע מן לטוס לתוך פתרון. לאחר 5 שעות, במערבולת קצרה כל צינור (2) כדי להבטיח אישור של צבע מן הזבובים.
6. Aliquot 50 μL של צינור 1.5 מ"ל ניסיוני לתוך באר של צלחת 96 גם אם זמין, לשים לב למיקום של כל מדגם על הצלחת. הוסף 200 μL של EtOH לדלל את המדגם 5x. הדילול נמנע השפעות התקרה של זבובים מאובקים בכבדות או פגמים גדולים grooming.
7. השתמש הקורא צלחת לנתח כל מדגם ב 397 ננומטר. לחלופין, למדוד ספיגה עבור דגימות בודדים וחסר על ספקטרופוטומטר סטנדרטי בספקטרום גלוי אם קורא צלחת אינו זמין.
8. לקרוא ולהקליט את המדגם דרך הקורא צלחת ולשמור את הגיליון האלקטרוני עם recordeד דוגמאות על הצלחת.

4. כימות התוצאות

1. לקמפל תוצאות עבור כל הדגימות ולמדוד את השונות עבור כל גנוטיפ או מצב.
   הערה: הצטברות צבע בזמן 0 דקות ובזמן 30 דקות נחשבים כתנאים נפרדים באמצעות ניתוח סטטיסטי על ידי ANOVA חד כיווני ותיקון Bonferroni או תיקונים אחרים עבור השוואות מקבילות מרובות.
2. חישוב הפרש אחוז ההבדל עבור כל גנוטיפ / תנאי באמצעות המשוואה הבאה: [(צבירת צבע אומר ערך בזמן 0 '- צבירת צבע מתכוון ערך בזמן 30') / צבירת צבע אומר ערך בזמן 0] x 100.
3. להביע את אחוז עבור כל גנוטיפ ומצב של מגרשים בר להשוות בין גנוטיפים ותנאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

Assay הטיפוח תשואות נתונים כמותיים כדי להעריך את הביצועים ההתנהגותיים על בסיס שארית יחסית של צבע שנצבר נותר על גופים של זבובים לאחר זמן מוגדר של המדידה לטיפוח (30 דקות). תמונות לדוגמה של עיצוב חדר השינה grooming השלבים העיקריים של assay מודגשים בתרשים 1

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Assay הטיפוח הוא פשוט יחסית, אבל היינו הזהיר הניסויים להקדיש תשומת לב מיוחדת בנושאים הבאים. שמירה על חותם הדוק על ידי הידוק הברגים על צלחות העליון והתחתון לאחר החדרת זבובים וצבע הוא חיוני עבור תוצאות לשחזור. צבע צהוב מבריק הוא מאוד בסדר המפרקים רופפת יאפשר הפסדים של צבע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Flex Tygon PVC Clear Tubing	McMaster-Carr	5229K54	ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators
Micropipette tips (1 mL and 200 μL)	Genesee Scientific	24-165, 24-150R
Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6"	McMaster-Carr	9318T44	Used to construct grooming chamber and mouth aspirators
Dumont #5 Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5050
Brilliant Yellow Dye	Sigma-Aldrich	201375-25G	we recommend use of nitrile gloves while handling this product
Vortexer	Fisher Scientific	12-812	set to "touch"
Ethanol	Carolina Biological Supply	86-1282
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR International	10025-726
0.65 mL microcentrifuge tubes	VWR International	20170-293	tubes can be reused with successive assays
UV 96-well plate	Corning	26014017
BioTek Synergy HTX Platereader	BioTek	need to download catalog to access product number	http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	BioTek
Microsoft Excel	Microsoft		https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Drosophila Incubator	Tritech	DT2-CIRC-TK
1/4" acrylic plastic	McMaster-Carr	8473K341
8 - 32 nuts	McMaster-Carr	90257A009
8 - 32 x 1" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A199	the bottom plate needs to be tapped for this size screw
8 - 32 x 1/2" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A194	the second plate from the top needs to be tapped
2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws	McMaster-Carr	91500A088	these hold the two middle plates together
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe	McMaster-Carr	92510A044	Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.  These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate