Quantificazione del comportamento del grooming di Drosophila

Riepilogo

Questo protocollo descrive una tecnica di dosaggio individuale scalabile di dosaggio in Drosophila che fornisce dati robusti e quantitativi per misurare il comportamento di manipolazione. Il metodo si basa sulla comparazione della differenza di accumulo di tinture nei corpi di animali non trattati e trattati in un determinato periodo di tempo.

Abstract

Il comportamento di grooming di Drosophila è un complesso programma locomotore multiplo che richiede un movimento coordinato di entrambi i lati e le zampe. Qui presentiamo un protocollo di dosaggio e un nuovo disegno a camera che è economicamente efficiente e scalabile per studi su piccola o larga scala di Drosophila . Le mosche vengono spolverate in tutto il corpo con la colorazione gialla brillante e hanno dato tempo per rimuovere il colorante dai loro corpi all'interno della camera. Le mosche vengono quindi depositate in un determinato volume di etanolo per solubilizzare il colorante. Sono misurate e registrate l'assorbanza spettrale relativa dei campioni di coloranti etanolo per animali da allevamento contro animali non macellati. Il protocollo fornisce dati quantitativi di accumulo di tinture per singole mosche, che possono essere facilmente mediate e confrontate tra campioni. Ciò consente ai disegni sperimentali di valutare facilmente le abilità di cura per gli studi sugli animali mutati o sulle manipolazioni dei circuiti. Questa procedura efficace è versatile e scalabile. Mostriamo wOrc-flow del protocollo e dati comparativi tra animali WT e animali mutanti per il Drosophila type I Dopamine Receptor ( DopR ).

Introduzione

Il grooming in Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) è un comportamento robusto innato che coinvolge il coordinamento di più programmi motori indipendenti ¹ . I frutti volano puliscono i loro corpi di polvere, microbi e altri agenti patogeni che potrebbero inibire la normale funzione fisiologica, come la vista e il volo, o portare a importanti sfide immunitarie. Nel rilevare e reagire sia all'attivazione meccanica ² che all'immunizzazione ³ , le mosche si ripetono a strofinare le gambe insieme o su una regione corporea mirata fino a quando non è sufficientemente pulita e il grooming progredisce in un'altra parte del corpo. Le mosche svolgono movimenti di governare in attacchi distinti che in gran parte si verificano nei modelli stereotipati ^{1 , 4} . Una gerarchia comportamentale diventa evidente come i segnali di governare sono prioritizzati. Circuiti e modelli di attività sono stati identificati in supporto oFa il modello che i programmi di grooming in cima alla gerarchia si verificano in primo luogo e sopprimono i segnali paralleli da aree del corpo che vengono curate in seguito ⁵ . La massima priorità è data alla testa, poi all'addome, alle ali e infine al torace ⁵ .

Il programma di grooming in D. melanogaster è un sistema ideale per studiare circuiti neurali, segnali molecolari modulatori e neurotrasmettitori. Ad esempio, il compromesso della funzione neurofibromina ⁶ , la perdita della proteina Drosophila fragile X retardazione mentale ( dfmr1 ) ⁷ e l'esposizione a bisfenolo A (BPA) ⁸ provocano eccessivi trattamenti e altri comportamenti analoghi ai sintomi umani discreti di neurofibromatosi, fragili X Sindrome e aspetti dei disordini dello spettro autistico e disordine di iperattività (ADHD). Il comportamento di grooming può anche essere habituaTed differenzialmente attraverso i ceppi mutanti ² , prestando questo programma motore a studi di plasticità comportamentale. L'ampiezza dei fenomeni neurologici che può essere modellata da Drosophila richiede un nuovo approccio comparativo per misurare la capacità delle mosche di sposarsi.

Si è dimostrato che l'azione combinata di trasportatori di monoammina vescicolare e la relativa abbondanza di dopamina e di altre ammine biogene nel corpo sono in grado di mediare il comportamento della volatili da frutta ^{9 , 10} . L'ottopamina e la dopamina stimolano un'attività comparativa di regolazione del collo posteriore nelle mosche decapitate, mentre la tiramina, precursore della ottopamina, innesca anche un grooming in misura minore ⁷ . Quattro recettori della dopamina sono stati identificati in D. melanogaster ^{11 , 12 , 13 , 14} . Utilizzando il metodo di analisi di grooming descritto in questo protocollo, abbiamo determinato un ruolo per il tipo D di Dopamine Receptor DopR ( DopR, dDA1, dumb ) nel comportamento pastorale ¹⁵ .

Il grooming può essere quantificato indirettamente guardando l'estensione della pulizia con cui un animale può spogliarsi completamente dopo aver spolverato tutto il corpo con un colorante marcatore o una polvere fluorescente ^{5 , 16} . Il resto della polvere lasciato sul corpo può essere utilizzato come marcatore relativo per il comportamento complessivo. Dusty vola dopo essere stato dato tempo sufficiente per lo sposo può manifestare un deficit specifico nel comportamento grooming. Mentre le indagini di cura sono diventate più estese, i protocolli hanno incorporato tali pratiche come la decapitazione per aggiungere trattamenti farmacologici sui nervi connettivi del collo ¹⁰ , stimolazione tattile delle setole per ottenere la risposta di grooming ² ,E la registrazione video del comportamento ¹⁵ . L'osservazione diretta del grooming può essere facilmente studiata utilizzando l'osservazione visiva e registrando manualmente la frequenza e la durata di eventi specifici di grooming ⁴ .

Abbiamo progettato una camera da 15 grosse dimensioni che può essere costruita con una stampante 3D o una taglierina laser e i disegni dei modelli sono disponibili per la riproduzione ¹⁵ . Il disegno utilizza due piastre centrali unite con aperture abbinate e separate da maglie e due piastre superiore e inferiore di scorrimento aggiuntive, da cui sono caricate rispettivamente mosche e / o tinture. Dopo aver lasciato alle spalle le mosche spolverate, lo depositi in etanolo per solubilizzare il colorante e misurare l'assorbanza di questa soluzione alla lunghezza d'onda del colorante. Un lettore di piastre può essere utilizzato per campioni multipli paralleli o uno spettrofotometro a singolo lettura può essere utilizzato per campioni individuali. Questo metodo minimizza l'errore indotto dalla manipolazione e alI bassi per i test di cura da eseguire su una scala più economica ed economica. Questo metodo è derivato e modificato dai metodi precedenti da Julie Simpson e Andrew Seeds, che utilizzano camere di grooming più grandi con elementi di riscaldamento per manipolazioni di circuiti sensibili alle temperature ⁵ . Il seguente protocollo mostra la quantificazione della cura di tutto il corpo e mostra metodi alternativi per la quantificazione dell'accumulazione di coloranti sulle singole parti del corpo. Inoltre presentiamo i dati di confronto campione tra i mutanti WT e DopR , nonché i metodi per calcolare un indice di performance semplice per il comportamento di grooming.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

1. Preparazione

1. Preparare un aspiratore per spostare Drosophila vivo da un flaconcino di cultura alla camera di cura. Gli aspirazione consentono il trasferimento di animali coscienti alle camere comportamentali per assicurare che l'anestesia non pregiudichi l'osservazione comportamentale successiva.
   1. Usando le forbici tagliate 1,5 piedi di tubo TYGON ID ⅛ ", OD ¼". Cucito almeno 1 pollice fuori dalla punta di una punta da 1 ml di micropipetta usa e getta. Tenere un pezzo di maglia quadrata di 1 cm (apertura 0,196 pollici) sopra la punta tagliata.
      NOTA: La maggior parte dei suggerimenti da 1 mL ha una linea di gradazione dove la punta si trova nella confezione, in genere tagliata a quella riga.
   2. Posizionare rigidamente una punta di micropipetta da 1 ml fresca sopra la punta della maglia / taglio. Osservare che la maglia costituisce una barriera tra le due punte. L'interno della nuova punta crea una camera di tenuta per le mosche.
   3. Tagliare la punta estrema della nuova punta della micropipetta per allargare l'apertura abbastanza per consentire il passaggio di una singola mosca. L'oroE corrisponde approssimativamente all'apertura della camera di grooming (circa 1,5-2 mm di diametro).
   4. Inserire a fondo le punte nidificate alla fine del tubo di tygon. Spingere le punte nel tubo per assicurare una tenuta stretta per consentire la pressione del vuoto.
   5. Dall'altra estremità del tubo, tagliare la punta di una punta di micropipetta da 200 μL e montare l'estremità del taglio stretto nel tubo. Questo è il lato "bocca" dell'aspirapolvere.
2. Preparare i tubi di aliquota della polvere. Pesa circa 5 mg di colorante giallo brillante su carta pesata tarata. Versare la polvere in un tubo da microcentrifuga da 0,6 ml e chiudere bene il tappo.
   NOTA: Consigliamo l'uso di guanti di nitrile durante la preparazione di aliquote, poiché alcuni guanti in lattice sono permeabili al colorante.
3. Ripetere la fase 1.2) per tutti i campioni nell'esperimento (uno per ogni mosca in ciascuna camera).
4. Preparare tubi di etanolo (EtOH): Pipettare 1 mL di 100% EtOH in 1,5 mL di microcentrifuga. Tubetti di etichetta per genotipi o condizioni/ Li>
5. Ripetere il passo 1.4) per tutti i campioni nell'esperimento (uno per ogni mosca in ogni camera). Coprire e salvare i tubi EtOH per completare il test di cura. Includere anche almeno un campione "vuoto" che sarà solo 1 mL di EtOH senza una mosca per controlli negativi.
6. Assemblare ogni camera di manipolazione avvitando la piastra superiore scorrevole (con i fori più piccoli) ma lasciando la piastra inferiore (con i fori più grandi) rimossi per l'aggiunta della polvere.
7. Posizionare ogni camera di grooming necessaria su un tavolo con il lato superiore rivolto verso il basso. Il lato di ingresso della mosca è rivolto verso il basso.
8. Caricare 5 ml di aliquota brillante di tintura gialla in ciascuna camera toccando il tubo contro la superficie della camera sopra il pozzo desiderato. Toccare la camera contro il tavolo per assicurare che tutta la polvere cada attraverso la maglia alla piastra superiore.
9. Avvitare la piastra inferiore su ciascuna camera in modo che le estremità più ampie delle aperture coniche si rivolgano verso l'esterno ei fori non si riposino sui pozzetti. Protegga il botTom piastra in modo che non scivoli e rilasci la tintura.
10. Spostare la camera sopra e batterlo piatta su un tavolo poche volte in modo che la polvere cada attraverso la maglia per riposare sulla piastra inferiore.
11. Far scorrere la piastra superiore della camera nella "posizione aperta" in modo che i piccoli fori si allineino con i quindici pozzetti, consentendo l'introduzione di mosche in singoli pozzetti.

2. Spruzzando le mosche e coltivando

1. Caricare una mosca nell'aspirazione della bocca aspirando delicatamente attraverso un'estremità dell'aspirazione come se si utilizza una paglia. Depositate le mosche colando leggermente e dirigendo l'apertura verso l'obiettivo.
2. Aspirare una mosca in ogni pozzo utilizzato per l'esperimento. Dopo aver caricato un pozzo, far scorrere la piastra superiore in modo che la mosca sia intrappolata nella camera e posizionare il nastro sopra l'apertura del pozzo durante il caricamento di tutta la camera per evitare che la mosca sfugga durante il caricamento di altri pozzetti. Se più mosche vengono aspirate in un singoloBene, lasci l'apertura scoperta fino a quando rimane solo una mosca.
3. Dopo che tutti i pozzi necessari sono pieni di mosche, flip la camera in modo tale che la piastra inferiore sia in alto in modo che la polvere abbia il potenziale per ricoprire le mosche cadendo attraverso la maglia.
4. Serrare bene le piastre superiore e inferiore serrando le viti e vorticola la camera per spolverare le mosche per 4 s.
5. Bussare la camera (piastra superiore rivolta verso l'alto) contro un tavolo due volte in modo che la tintura cada dall'altra parte. Quindi, ruotare la camera sopra (piastra superiore rivolta verso l'alto) e bussare due volte la camera per assicurare che il colorante si deposita sul pavimento della camera inferiore dalla mosca tenuta nella camera superiore.
6. Per le mosche di controllo che non sono autorizzate a sposo, procedere immediatamente al punto 3 del protocollo. Per le mosche che completeranno il test, procedere al punto 2.7.
7. Riposare la camera da letto su un tavolo o il piano di lavoro con la piastra superiore verso l'alto per trenta minuti per permettere alle mosche di sposo. Mettere la cameraIn un ambiente di rumore e senza vibrazioni per mantenere costante l'ambiente per tutti gli esperimenti di cura (livelli di illuminazione, umidità e temperatura). Un incubatore a tavoletta a RT oa 25 ° C con controlli di umidità è l'ideale.

3. Preparazione dei campioni e analisi di assorbanza

1. Tenendo il livello della camera con il piatto superiore verso l'alto, svitate delicatamente la piastra inferiore e rimuovila dalla camera, facendo attenzione a non perdere la tintura.
2. Posizionare la camera su un cuscinetto Fly CO ₂ con flusso d'aria basso fino a quando le mosche sono anestetizzate.
3. Svitare la piastra superiore dalla camera. Utilizzare attentamente le pinze per afferrare una gamba e spostare una mosca spolverata da ogni camera e depositarla in un tubo da 1,5 ml di microcentrifuga contenente EtOH. Il tempo di trasferimento per 15 camere ciascuna contenente una mosca è di circa 3-5 minuti. I esperimenti dovrebbero fatturare i tempi di trasferimento se / quando esperimenti sconcertanti con più camere per assicurare una gestione efficiente degli esperimenti.
4. Una volta che ogni tubo di microcentrifuga contiene una mosca, chiudere il tappo e invertire il tubo tre volte per agitare e mescolare la soluzione di colorante e etanolo.
5. Incubare i tubi contenenti etanolo e volare per 5 ore a RT per garantire la completa rimozione del colorante dal fly in soluzione. Dopo i 5 h, brevemente vortexare ogni tubo (2 s) per garantire la distanza del colorante dalle mosche.
6. Aliquota 50 μL del tubo sperimentale da 1,5 ml in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, se disponibile, prendendo atto della posizione di ciascun campione sulla piastra. Aggiungere 200 μL di EtOH per diluire il campione 5x. La diluizione evita gli effetti di soffitto di mosche pesanti o grossi difetti di grooming.
7. Utilizzare un lettore di piastre per analizzare ogni campione a 397 nm. In alternativa, misurare l'assorbanza per i singoli campioni e gli spazi su uno spettrofotometro standard nello spettro visibile se non è disponibile un lettore di piastre.
8. Leggere e registrare il campione tramite il lettore di piastre e salvare il foglio di calcolo con il recordD sulla piastra.

4. Quantificazione dei risultati

1. Compilare i risultati per tutti i campioni e misurare la varianza per ogni genotipo o condizione.
   NOTA: L'accumulo di tintura a 0 min e in tempo 30 min viene considerato come condizione separata utilizzando analisi statistiche mediante correzione ANOVA e Bonferroni a senso unico e altre correzioni per più confronti paralleli.
2. Calcola la differenza percentuale di grooming per ciascun genotipo / condizione usando la seguente equazione: [(valore medio di accumulo di tintura al tempo 0 '- valore medio di accumulo di tintura al tempo 30') / valore medio di accumulo di tintura al tempo 0] x 100.
3. Esprimere la percentuale per ogni genotipo e condizione nelle barre e confrontare tra genotipi e condizioni.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Il dosaggio di cure rende dati quantitativi per valutare le prestazioni comportamentali basate sul residuo relativo della colorante accumulata lasciata sui corpi delle mosche dopo un tempo di misura impostato per la cura (30 min). Le figure di esempio del disegno della camera di scorrimento scorrevole e delle fasi principali del dosaggio sono evidenziate in figura 1 . Le mosche aggregano una quantità significativa di tintura dalla polverizzazione immedi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Il test di cura è relativamente semplice, ma avremmo cautela i sperimentatori a prestare particolare attenzione ai seguenti problemi. Il mantenimento di una guarnizione a tenuta stretta delle viti sulle piastre superiore e inferiore dopo l'introduzione di mosche e tinture è essenziale per i risultati riproducibili. Il colorante giallo brillante è molto fine e le giunture sciolte consentiranno perdite di tintura dai bordi della camera. L'irregolarità del contenuto di tinture per ciascun pozzetto potrebbe faci...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Flex Tygon PVC Clear Tubing	McMaster-Carr	5229K54	ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators
Micropipette tips (1 mL and 200 μL)	Genesee Scientific	24-165, 24-150R
Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6"	McMaster-Carr	9318T44	Used to construct grooming chamber and mouth aspirators
Dumont #5 Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5050
Brilliant Yellow Dye	Sigma-Aldrich	201375-25G	we recommend use of nitrile gloves while handling this product
Vortexer	Fisher Scientific	12-812	set to "touch"
Ethanol	Carolina Biological Supply	86-1282
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR International	10025-726
0.65 mL microcentrifuge tubes	VWR International	20170-293	tubes can be reused with successive assays
UV 96-well plate	Corning	26014017
BioTek Synergy HTX Platereader	BioTek	need to download catalog to access product number	http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	BioTek
Microsoft Excel	Microsoft		https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Drosophila Incubator	Tritech	DT2-CIRC-TK
1/4" acrylic plastic	McMaster-Carr	8473K341
8 - 32 nuts	McMaster-Carr	90257A009
8 - 32 x 1" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A199	the bottom plate needs to be tapped for this size screw
8 - 32 x 1/2" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A194	the second plate from the top needs to be tapped
2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws	McMaster-Carr	91500A088	these hold the two middle plates together
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe	McMaster-Carr	92510A044	Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.  These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate