JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом протоколе описывается масштабируемая индивидуальная методика анализа grooming у Drosophila, которая дает надежные количественные данные для измерения поведения ухода. Метод основан на сравнении различий в накоплении красителя на телах ухоженных и ухоженных животных за определенный период времени.

Аннотация

Drosophila - это сложная многоступенчатая локомоторная программа, которая требует скоординированного движения как передних, так и задних конечностей. Здесь мы представляем протокол анализа grooming и новую конструкцию камеры, которая экономична и масштабируема для небольших или крупномасштабных исследований по уходу за Drosophila . Мухи пылиются по всему телу с помощью блестящей желтой краски и дают время для удаления красителя из их тел внутри камеры. Мухи затем осаждаются в заданном объеме этанола для солюбилизации красителя. Измеряют и регистрируют относительную спектральную абсорбцию образцов красителя-этанола для ухоженных и неопытных животных. Протокол дает количественные данные о накоплении красителя для отдельных мух, которые можно легко усреднить и сравнить по выборкам. Это позволяет экспериментальным проектам легко оценивать способность ухаживать за мутантными исследованиями на животных или с помощью схемных манипуляций. Эта эффективная процедура универсальна и масштабируема. Покажем wOrk-поток протокола и сравнительные данные между животными WT и мутантными животными для Dopamine рецептора Drosophila I типа ( DopR ).

Введение

Уход в Drosophila melanogaster ( D. melanogaster ) - это надежное врожденное поведение, которое включает в себя координацию нескольких независимых моторных программ 1 . Фруктовые мухи очищают свои тела от пыли, микробов и других патогенов, которые могут препятствовать нормальной физиологической функции, такой как зрение и полет, или приводят к значительным иммунным проблемам. При восприятии и реагировании как на механическую 2, так и на иммунную активацию 3 , мухи повторно натирают свои ноги вместе или на целевую область тела, пока они не станут достаточно чистыми, а ходьба прогрессирует в другую часть тела. Мухи совершают движения в отдельных поединках, которые в основном происходят в стереотипных узорах 1 , 4 . Поведенческая иерархия становится очевидной, так как приоритетные сигналы имеют приоритет. Схемы и схемы деятельности были определены в поддержку oFA модель , которая холить программы на вершине иерархии происходят первую и подавлять параллельные сигналы от участков тела, которые впоследствии ухоженных 5. Наивысший приоритет отдается голове, затем животу, крыльям и, наконец, грудной клетке 5 .

Программа ухода в D. melanogaster - идеальная система для изучения нейронных цепей, модулирующих молекулярных сигналов и нейротрансмиттеров. Например, компромисс функции нейрофибромина 6 , потеря хрупкого Х- запаса умственной отсталости Drosophila ( dfmr1 ) 7 и воздействие бисфенола A (BPA) 8 все вызывают чрезмерный уход и другие поведения, которые аналогичны дискретным человеческим симптомам нейрофиброматоза, хрупким X Синдром и аспекты расстройств спектра аутизма и синдрома дефицита внимания с гиперактивностью (ADHD), соответственно. Сходное поведение также может быть habituaВ зависимости от мутантных штаммов 2 , предоставляя эту моторную программу исследованиям поведенческой пластичности. Широта неврологических явлений, которые могут быть смоделированы Drosophila, требует нового сравнительного подхода, чтобы измерить способность мух жениться на себе.

Было показано, что совместное действие везикулярных транспортеров моноаминов и относительное обилие дофамина и других биогенных аминов в организме являются опосредующими поведением плодовых мух 9 , 10 . Октапамин и дофамин стимулируют сравнимую активность задней конечности у обезглавленных мух, в то время как тирамин, предшественник октопамина, также вызывает уход в меньшей степени 7 . Четыре рецептора допамина были идентифицированы в D. melanogaster 11 , 12 , 13 , 14 . Используя метод анализа grooming, описанный в этом протоколе, мы определили роль для рецептора Dopamine DopR семейства I типа ( DopR, dDA1, dumb ) в поведении 15 .

Уход можно косвенно определить количественно, посмотрев на степень чистоты, с помощью которой животное может полностью ухаживать после вытирания всего тела маркерным красителем или флуоресцентной пылью 5 , 16 . Остальная часть пыли, оставленной на теле, может использоваться как относительный маркер для общего поведения. Пыльные мухи после того, как им предоставлено достаточное время для жениха, может проявиться определенный дефицит в поведении. Поскольку исследования по уходу за больными стали более обширными, протоколы включили такие методы, как обезглавливание, чтобы добавить фармакологическое лечение на соединительные нервы 10 шеи, тактильную стимуляцию щетинок, чтобы вызвать реакцию 2 ухода,И видеозапись поведения 15 . Прямое наблюдение за ходьбой можно легко изучить, используя визуальное наблюдение и вручную регистрируя частоту и продолжительность конкретных событий 4 .

Мы разработали 15-луночную камеру для уборки, которая может быть построена с помощью 3D-принтера или лазерной резки, а чертежные чертежи доступны для воспроизведения 15 . В конструкции используются две соединенные центральные пластины с отверстиями, соответствующими друг другу и разделенные сеткой, а также две дополнительные скользящие верхние и нижние пластины, из которых загружаются мухи и / или краситель. После того, как высушенные мухи успели дойти до жениха, мы их осаждаем в этаноле, чтобы солюбилизировать краситель и измерять поглощение этого раствора на длине волны красителя. Считыватель пластин может использоваться для нескольких параллельных образцов, или для отдельных образцов может использоваться одночиповой спектрофотометр. Этот метод минимизирует ошибку, вызванную обработкой, иМинимумы для анализа холинга, которые будут выполняться на меньшем, экономичном уровне. Этот метод получен и модифицирован по методам, впервые предложенным Джули Симпсон и Эндрю Сейдс, которые используют более крупные камеры для обжига с нагревательными элементами для температурно-чувствительных схемных манипуляций 5 . Следующий протокол демонстрирует количественную оценку ухода за всем телом, а также показывает альтернативные методы количественного накопления красителя на отдельных частях тела. Мы также представляем данные сравнения образцов между мутантами WT и DopR , а также методы расчета простого индекса производительности для поведения ухода.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка

  1. Подготовьте аспиратор для перемещения живой дрозофилы из культурального флакона в камеру для ухода. Аспираторы позволяют переносить сознательных животных в поведенческие камеры для обеспечения того, чтобы анестезия не влияла на последующие поведенческие наблюдения.
    1. Используя ножницы, отрежьте 1,5 фута трубки tygon ID ⅛ ", OD ¼". Нанесите, по крайней мере, 1 дюйм от кончика 1 мл одноразового наконечника микропипетки. Возьмите квадратный кусок сетки размером 1 см (отверстие 0,96 дюйма) над наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ. У большинства кончиков 1mL есть линия градации, где кончик находится в коробке с пакетом, обычно обрезается по этой линии.
    2. Нанесите свежий кончик микропипетки 1 мл поверх кончика сетки / среза. Наблюдайте за сеткой, образуя плотный барьер между двумя кончиками. Внутренняя часть нового наконечника создает камеру для мух.
    3. Отрежьте крайний наконечник нового наконечника микропипетки, чтобы расширить отверстие достаточно, чтобы обеспечить прохождение одной мухи. ХоллE будет примерно соответствовать открытию камеры для ухода (приблизительно 1,5-2 мм в диаметре).
    4. Плотно прилепите вложенные наконечники к концу трубки tygon. Вставьте наконечники в трубку, чтобы обеспечить плотное прилегание, чтобы обеспечить вакуумное давление.
    5. На другом конце трубки вырежьте кончик наконечника микропипетки 200 мкл и вставьте узкий разрез в трубку. Это «рот» стороны аспиратора.
  2. Подготовьте пылевые аликвотные трубки. Взвесьте приблизительно 5 мг блестящей желтой краски на взвешенной бумаге для взвешивания. Налейте пыль в микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл и плотно закройте колпачок.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Мы советуем использовать нитриловые перчатки во время приготовления аликвоты, так как некоторые латексные перчатки проницаемы для красителя.
  3. Повторите шаг 1.2) для всех образцов в эксперименте (по одному для каждой мухи в каждой камере).
  4. Подготовьте этанольные (EtOH) пробирки: нанесите 1 мл 100% EtOH на 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Этикетки для генотипов или условий.
  5. Повторите шаг 1.4) для всех образцов в эксперименте (по одному для каждой мухи в каждой камере). Крышка и сохранить EtOH трубы для завершения анализа grooming. Также включите по крайней мере один образец «Бланк», который будет только 1 мл EtOH без мухи для отрицательных контролей.
  6. Соберите каждую камеру для зачистки, завинтив скользящую верхнюю пластину (с меньшими отверстиями), но оставив нижнюю пластину (с большими отверстиями) удаленной для добавления пыли.
  7. Поместите каждую необходимую камеру для уборки на стол с верхней стороной вниз. Летающая сторона входа лицевой стороной вниз.
  8. Загрузите 5 мг бриллиантовой желтой краски в каждую камеру, постукивая трубкой по поверхности камеры над желаемой лункой. Нажмите камеру на стол, чтобы убедиться, что вся пыль попала через сетку к верхней пластине.
  9. Вверните нижнюю пластину на каждую камеру так, чтобы более широкие концы конических отверстий были обращены наружу, а отверстия не опирались на лунки. Защитить ботаТонер плотно, чтобы он не скользил и не отпускал краситель.
  10. Переверните камеру и несколько раз постучите по столу, чтобы пыль провалилась сквозь сетку, чтобы опираться на нижнюю пластину.
  11. Сдвиньте верхнюю пластину камеры в «открытое положение», чтобы маленькие отверстия совпали с пятнадцатью лунками, позволяя вводить мух в отдельные лунки.

2. Взлетно-пылеулавливание и уборка

  1. Загрузите одну муху в аспиратор, аккуратно сосать через один конец аспиратора, как будто используя соломинку. Вкладывайте мух, слегка вдувая и направляя отверстие к цели.
  2. Аспирируйте одну муху в каждую лунку, используемую для эксперимента. После загрузки колодца сдвиньте верхнюю пластину так, чтобы муха была заперта в камере и помещала ленту поверх отверстия этой скважины во время загрузки всей камеры, чтобы предотвратить вылет мухи при загрузке других колодцев. Если несколько мух аспирируют в синглХорошо, оставьте это открытие открытым, пока не останется только одна муха.
  3. После того, как все необходимые колодцы заполнены мухами, переверните камеру так, чтобы нижняя пластина была направлена ​​вверх, чтобы пыль могла покрыть мух, пробираясь сквозь сетку.
  4. Плотно закрепите верхнюю и нижнюю пластины, затянув винты, и встряхните камеру, чтобы пыль мух в течение 4 с.
  5. Стучите камеру (верхнюю пластину лицевой стороной вниз) к столу дважды, чтобы краска попала на другую сторону. Затем переверните камеру (верхнюю пластину лицевой стороной вверх) и дважды постучите в камеру, чтобы гарантировать, что краситель оседает на дне нижней камеры от мухи, удерживаемой в верхней камере.
  6. Для контрольных мух, которые не допускаются к жениху, немедленно перейдите к шагу 3 протокола. Для мух, которые завершат анализ, перейдите к шагу 2.7.
  7. Оставьте камеру на столе или столешнице с верхней плитой вверх в течение тридцати минут, чтобы мухи могли жениться. Поместите чашкуEr в пространстве без шума и вибрации, чтобы поддерживать постоянную обстановку для всех экспериментов по укладке (уровни освещенности, влажность и температура). Идеальным является настольный инкубатор при RT или 25 ° C с контролем влажности.

3. Подготовка образцов и анализ абсорбции

  1. Удерживая уровень камеры с верхней плитой вверх, аккуратно отвинтите нижнюю пластину и выньте ее из камеры, следя за тем, чтобы не потерять краситель.
  2. Поместите камеру на подушку Fly CO 2 с небольшим воздушным потоком, пока мухи не будут обезболиваться.
  3. Отвинтите верхнюю пластину из камеры. Тщательно используйте щипцы, чтобы схватить ногу и перенести одну пыльную муху из каждой камеры и поместить ее в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную пробирку, содержащую EtOH. Время передачи для 15 камер, каждая из которых содержит одну муху, составляет приблизительно 3-5 мин. Экспериментаторы должны учитывать время передачи, если / при ошеломляющих экспериментах с несколькими камерами для обеспечения эффективной постановки экспериментов.
  4. Как только каждая микроцентрифужная пробирка содержит 1 муху, закройте колпачок и три раза переверните трубку, чтобы перемешивать и смешивать раствор красителя и этанола.
  5. Инкубируйте трубки, содержащие этанол, и мух в течение 5 часов при комнатной температуре, чтобы обеспечить полное удаление красителя с мухи в раствор. Через 5 часов кратковременно встряхните каждую пробирку (2 с), чтобы обеспечить очистку красителя от мух.
  6. Аликвоту 50 мкл экспериментальной трубки 1,5 мл в лунку 96-луночного планшета, если таковая имеется, с учетом расположения каждого образца на пластине. Добавить 200 мкл EtOH для разбавления образца 5х. Разбавление предотвращает потолочные эффекты сильно напыленных мух или большие дефекты ухаживания.
  7. Используйте планшет-ридер для анализа каждого образца при 397 нм. В качестве альтернативы измерьте поглощение для отдельных образцов и заготовок на стандартном спектрофотометре в видимом спектре, если планшетный читатель недоступен.
  8. Прочитайте и запишите образец через считывающее устройство для планшетов и сохраните таблицу с записьюD образцов на пластине.

4. Количественная оценка результатов

  1. Скомпилируйте результаты для всех образцов и измерьте дисперсию для каждого генотипа или состояния.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Накопление красителя в момент времени 0 мин и время 30 мин рассматриваются как отдельные условия с использованием статистического анализа с односторонней коррекцией ANOVA и Bonferroni или другими исправлениями для множественных параллельных сравнений.
  2. Рассчитайте процентную разницу для каждого генотипа / условия, используя следующее уравнение: [(среднее значение накопления красителя в момент времени 0 '- среднее значение накопления красителя в момент времени 30') / среднее значение накопления красителя в момент времени 0] x 100.
  3. Выразите процентное соотношение для каждого генотипа и состояния на графиках и сравните по генотипам и условиям.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Анализ холинга дает количественные данные для оценки характеристик поведения, основанные на относительном остатке накопленной краски, оставшейся на телах мух после установленного времени измерения для ухода (30 мин). Образцы изображений конструкции камеры скольжени...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Анализ холинга относительно прост, но мы будем предупреждать экспериментаторов, чтобы обратить особое внимание на следующие проблемы. Поддержание плотного уплотнения затягиванием винтов на верхней и нижней пластинах после введения мух и красителей имеет важное значение для воспрои?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют никакого конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Брайана Шепарда, Тата Удомриттируджа, Аарона Вилли, Руби Фрума, Элиз Питмон и Роуз Хедрин за раннюю работу по тестированию и установлению этой методологии и камерных проектов. Мы благодарим Келли Теллеса и Грэма Бьюкена за чтение и редактирование рукописи. Мы благодарим Эндрю Семса и Джули Симпсон за их новаторскую работу и их советы и поддержку, предлагая использовать Brilliant Yellow Dye (Sigma). Эта работа частично поддерживается благотворительным фондом хирургических и медицинских исследований и образования Мэри Э. Грофф, Научным центром Бронфмана и Программой стипендиатов Хелмана.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
High-Flex Tygon PVC Clear TubingMcMaster-Carr5229K54ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators
Micropipette tips (1 mL and 200 μL)Genesee Scientific24-165, 24-150R
Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6"McMaster-Carr9318T44Used to construct grooming chamber and mouth aspirators
Dumont #5 ForcepsRoboz Surgical InstrumentRS-5050
Brilliant Yellow DyeSigma-Aldrich201375-25Gwe recommend use of nitrile gloves while handling this product
VortexerFisher Scientific12-812set to "touch"
EthanolCarolina Biological Supply86-1282
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR International10025-726
0.65 mL microcentrifuge tubesVWR International20170-293tubes can be reused with successive assays
UV 96-well plateCorning26014017
BioTek Synergy HTX PlatereaderBioTekneed to download catalog to access product numberhttp://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager SoftwareBioTek
Microsoft ExcelMicrosofthttps://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Drosophila IncubatorTritechDT2-CIRC-TK
1/4" acrylic plasticMcMaster-Carr8473K341
8 - 32 nutsMcMaster-Carr90257A009
8 - 32 x 1" hex cap screwsMcMaster-Carr92185A199the bottom plate needs to be tapped for this size screw
8 - 32 x 1/2" hex cap screwsMcMaster-Carr92185A194the second plate from the top needs to be tapped
2 - 56 3/8" flat head phillips machine screwsMcMaster-Carr91500A088these hold the two middle plates together
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipeMcMaster-Carr92510A044Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.  These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate

Ссылки

  1. Szebenyi, A. L. Cleaning Behaviour in Drosophila-Melanogaster. Animal. Behaviour. 17, (1969).
  2. Corfas, G., Dudai, Y. Habituation and dishabituation of a cleaning reflex in normal and mutant Drosophila. J Neurosci. 9 (1), 56-62 (1989).
  3. Yanagawa, A., Guigue, A. M. A., Marion-Poll, F. Hygienic grooming is induced by contact chemicals in Drosophila melanogaster. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 8, (2014).
  4. Dawkins, R., Dawkins, M. Hierarchical Organization and Postural Facilitation - Rules for Grooming in Flies. Animal Behaviour. 24 (Nov), 739-755 (1976).
  5. Seeds, A. M., et al. A suppression hierarchy among competing motor programs drives sequential grooming in Drosophila. Elife. 3, e02951(2014).
  6. King, L. B., et al. Neurofibromin Loss of Function Drives Excessive Grooming in Drosophila. G3-Genes Genomes Genetics. 6 (4), 1083-1093 (2016).
  7. Tauber, J. M., Vanlandingham, P. A., Zhang, B. Elevated Levels of the Vesicular Monoamine Transporter and a Novel Repetitive Behavior in the Drosophila Model of Fragile X Syndrome. Plos One. 6 (11), e27100(2011).
  8. Kaur, K., Simon, A. F., Chauhan, V., Chauhan, A. Effect of bisphenol A on Drosophila melanogaster behavior--a new model for the studies on neurodevelopmental disorders. Behav Brain Res. 284, 77-84 (2015).
  9. Chang, H. Y., et al. Overexpression of the Drosophila vesicular monoamine transporter increases motor activity and courtship but decreases the behavioral response to cocaine. Molecular Psychiatry. 11 (1), 99-113 (2006).
  10. Yellman, C., Tao, H., He, B., Hirsh, J. Conserved and sexually dimorphic behavioral responses to biogenic amines in decapitated Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (8), 4131-4136 (1997).
  11. Feng, G. P., et al. Cloning and functional characterization of a novel dopamine receptor from Drosophila melanogaster. Journal of Neuroscience. 16 (12), 3925-3933 (1996).
  12. Gotzes, F., Balfanz, S., Baumann, A. Primary Structure and Functional-Characterization of a Drosophila Dopamine-Receptor with High Homology to Human D(1/5). Receptors. Receptors & Channels. 2 (2), 131-141 (1994).
  13. Han, K. A., Millar, N. S., Grotewiel, M. S., Davis, R. L. DAMB, a novel dopamine receptor expressed specifically in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 16 (6), 1127-1135 (1996).
  14. Sugamori, K. S., Demchyshyn, L. L., Mcconkey, F., Forte, M. A., Niznik, H. B. A Primordial Dopamine D1-Like Adenylyl Cyclase-Linked Receptor from Drosophila-Melanogaster Displaying Poor Affinity for Benzazepines. Febs Letters. 362 (2), 131-138 (1995).
  15. Pitmon, E., et al. The D1 family dopamine receptor, DopR, potentiates hind leg grooming behavior in Drosophila. Genes Brain and Behavior. 15 (3), 327-334 (2016).
  16. Phillis, R. W., et al. Isolation of mutations affecting neural circuitry required for grooming behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 133 (3), 581-592 (1993).
  17. Hampel, S., Franconville, R., Simpson, J. H., Seeds, A. M. A neural command circuit for grooming movement control. Elife. 4, e08758(2015).
  18. Kays, I., Cvetkovska, V., Chen, B. E. Structural and functional analysis of single neurons to correlate synaptic connectivity with grooming behavior. Nature Protocols. 9 (1), 1-10 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

NeuroscienceDrosophila3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены