הכנה פיזיולוגית של תאי שיער מן Sacculus של הבוקסר האמריקאי (<em&gt; רנא catesbeiana</em&gt;)

Summary

של הצפרדע האמריקנית (רנא catesbeiana) sacculus מתיר בדיקה ישירה של פיזיולוגית שיער תאים. כאן לנתיחה וההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical מתוארת. אנחנו מראים ניסויי נציג מתאי שיער אלה, לרבות חישוב יחס כוח-העקירה של צרור והמדידה של התנועה המאולצת שלה.

Abstract

המחקר של השמיעה ושיווי המשקל נשען על תובנות שנשאבו מחקרים biophysical של מערכות מודל. מודל אחד כזה, את sacculus של הצפרדע האמריקנית, הפך תווך של מחקר שמיעתי שיווי משקל. מחקרים של האיבר הזה חשפו כיצד חושי בתאי שיער יכול לזהות אותות פעילים מהסביבה. בגלל המחקרים הללו, עכשיו אנחנו מבינים טוב יותר את gating ולוקליזציה מכני של ערוצי התמרה של תאים שיער, תפקידו של הסידן הסתגלות מכני, ואת הזהות של זרמים תא השיער. איבר נגישות גבוהה זו ממשיך לספק תובנה פעילותם של תאי שיער. כאן אנו מתארים את ההכנה של sacculus הצפרדע ללימודי biophysical על תאי השיער שלה. אנו כוללים את ההליך לנתיחה המלא לספק פרוטוקולים ספציפיים עבור הכנת sacculus בהקשרים ספציפיים. אנחנו גם כוללים תוצאות נציג השימוש בתכשיר, לרבות חישוביחס עקירה בכוח מיידי של שיער צרור ומדידה של תנודה ספונטנית של אגד.

Introduction

אברי acousticolateralis של יונקים בעלי ארכיטקטורה מורכבת שקר בתוך נישה אנטומיים שיכולים להיות קשים לגישה. לדוגמא, השבלול היונק מורכב מבוך התפתל והוא מוטבע בתוך העצם הטמפורלית העבה. בידוד של השבלול לעתים קרובות גורם ניזק מכני התא החושי שוכב בתוכו ולכן הוכיח להיות משימה קשה ^1. חוקרי מערכת העצבים ובכך הפכו מודל מערכות אשר יותר חילוץ בקלות מן הקודשים של האוזן.

אחת ממערכות מודל אלה, sacculus של צפרדע האמריקאי (רנא catesbeiana), במשך עשרות שנים הניב תובנות להכליל לתוך הפונקציה של מערכת השמיעה ואת שיווי המשקל. Sacculus הוא איבר מעורב פונקציה עם תפקידים חושיים בשתי שמיעה בתדירות נמוכה ותחושה סייסמיים. התאים החושיים של sacculus הם תאי השיער שלה, מתמרים מיוחדים שממירים אנרגיה מכאניתלאותות חשמליים בתוך האיברים השמיעתיים הווסטיבולארית. הקרנה מפני שטח הפסגה של כל תא שיער הנה למעשה אגודת שיער mechanosensitive שכוללת ציצת ​​מדורגים של microvilli המוגדל שנקרא stereocilia. העצות של stereocilia הסמוך הם מחוברים על ידי חלבוני filamentous טיפ-מקשרים מכאני תעלות יוני שער בתגובה לגירויים מכאניים ^{2, 3.} למרות איברים שמיעתיים שיווי משקל להגיב לסוגים שונים של גירויים, הם חולקים מנגנון זיהוי משותף. אחידות זו היא תחילתה של תובנות רבות שנרכשו לתוך mechanotransduction שיער תאים באמצעות מחקרים של sacculus לצפרדע. לדוגמא, התהליך הפעיל של שיער התא נחקר בהרחבת האיבר הזה ^{4, 5, 6, 7,} ואת צרור השיער מעסיק בתהליך רב-אנרגיה כדי לייצר מכניםעֲבוֹדָה. לא זו בלבד שהיא הוכחה כי תאי שיער ליצור עבודה פעילה ^6, אבל מנגנונים נפרדים שבבסיס התהליך הפעיל מאפייני הכוונון של תא שיער כבר חשפו באמצעות מחקרים של צפרדע acousticolateralis איברים. אלה כוללים תנועתיות שיער חלק מחבילה פעילה ⁸ ותא שיער חשמלי תהודה ^{9, 10, 11} sacculus סלקטיביות תדירות הסינפסה הסרט של תא השיער ¹² ב פטמית אמפיבי.

של sacculus הצפרדע מושך מדעני מוח חושיים מסיבות רבות. בניגוד השבלול היונק, האיבר הזה נמצא בתוך הקפסולה otic נגיש בקלות. שנית, בתאי השיער בתוך האיבר הזה יכול להישאר בריאים במשך כמה שעות תחת תנאים מתאימים ^{13, 14.} זה מאפשר experimentatיון על תאים אלה על לוחות זמנים ארוכים יחסית לעמיתיהם היונקים שלהם. שלישית, האיבר נושא עקמומיות קטנה, המתיר מניפולציה קלה. רביעית, כל איבר מורכב שיער אלף תאים או יותר ^15, מתן גם תפוקה גבוהות סבירות גבוהה איתור של סט מתאים של תאי שיער עבור בניסוי נתון. לבסוף, של sacculus הצפרדע היא דמיינה בקלות בשל הרזון של האיבר הזה וגודל גדול של תאי השיער שלה.

מאפיינים אלה מספקים גמישות רבה לחקר תאי חושי בתוך של sacculus לצפרדע. בהתאם השאלה שעל הפרק, אחד ההכנות ניסיוני כמה ניתן המתקבל sacculus. הפשוט שבהם הוא הכנת חד קאמרית. כאן sacculus היא משותקת בתא מלא perilymph מלאכותית, מלוח נתרן עשיר גבוה סידן. הכנה זו מאפשרת הלימוד של זרמי תא שיער ומכניקה צרור שיער בסיסית. תצורה שנייה, הכנה שני הקאמרי, יכולה לשמש כדי לחקור תנועות צרורות שיער ספונטניות. כאן בצד הפסגה של תאי השיער חשוף מלוחים אשלגן-עשיר בסידן עניים כינה endolymph מלאכותית, בעוד הצד basolateral טובל perilymph מלאכותית. תאים אלה שני לחקות את הסדר in vivo של Salines ולספק סביבה המאפשרת צרורות שיער להתנדנד באופן ספונטני.

אנו מתארים במאמר זה ההכנה של sacculus הצפרדע למחקר ביו-תאי השיער החושיים שלה. אנחנו ראשונים לספק תיאור מפורט של הבידוד של האיבר הזה מהאוזן הפנימית של הצפרדע. לאחר מכן, אנו מתארים הם אחד ו הכנות ניסיון שני הקאמרי וכוללים תוצאות נציג עבור כל תצורה.

Protocol

משפט ואתיקה: כל ההליכים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (IACUC) באוניברסיטת רוקפלר.

1. טרום הניסוי Prespanparation

1. פתרונות
   1. הכן את הפתרון eugenol (2.5 גרם · L ^-1 · ק"ג ^-1 צפרדע). הכן את פתרונות מלוחים (טבלה 1).
      הערה: לקבלת הכנה חד-תא, להכין perilymph מלאכותית; עבור הכנה השנייה קאמרית, להכין הן perilymph המלאכותי endolymph המלאכותית.

2. כלי ניסיוני

1. הכנת סיבי גירוי זכוכית
   1. צמצם את נימי בורוסיליקט זכוכית עם חולץ אלקטרודה במשיכה חד-קו עם חום גבוה ומהירות גבוהה. טען את הנימים נכנסו חולץ סולנואיד מונחה.
   2. תביא את הקצה של הנימים לקראת נימה עם חרוז זכוכיתנמס על זה עד המגעים נימי חרוז זכוכית.
   3. הפעל את הנימה כדי להמס את קצה הנימים לתוך חרוז הזכוכית. לאחר גשר דק של צורות זכוכית בין הנימים ואת החרוז, לכבות את הנימה וברחבי באותו הזמן להפעיל את חולץ סולנואיד.
      הערה: זה ימשוך את נימי זכוכית בזווית ישרה לציר שלה ארוך וליצור סיבים מוצקים.
   4. ודא בקוטר של הסיבים הוא לא יותר מ -0.5 - 1 מיקרומטר וכי אורכו אינו עולה על 100 - 300 מיקרומטר. אם האורך של הסיב עולה הממד הזה, לקצץ אותו עם איריס מספרית. השתמש במספריים כי הם כבר משעמם כדי למנוע נזק הכלים לנתיחה.
   5. כדי לשפר לעומת זאת אופטי, גמגום מעיל הסיב. השתמש coater גמגום עם מקור זהב-פלדיום. אנכי לטעון כל סיב לתוך coater גמגום עם לקצה החד שלה לעבר המקור. תביאו את קצה סיב עד למרחק של 1 - 2 ס"מ ממקור זהב-פלדיום.
   6. סגור אתגמגום הקאמרי של coater כדי ליצור חותם ולהדליק אותו. שוב ושוב לשטוף את אוויר הסביבה עם ארגון. לאחר שטיפה באוויר, להפחית את הלחץ בתוך החדר עד 10 Pa (70 mTorr).
   7. גמגום מעיל שבסעיף פולסים 10 עם ים עיכובים 10 מעל קורס של 120 שעות.
      הערה: טיפ של הסיבים יהיה להחשיך על המשך בפרוטוקול זה אם ציפוי הגמגום היה הצלחה.
2. הכנת microelectrodes חדה
   1. משוך נימי זכוכית עם נימה פנימית באמצעות משיכה חד-קו בטמפרטורה גבוהה. אלקטרודות צריך להיות התנגדות של 100 - 300 MΩ כאשר התמלאו 3 M KCl. ממלאים כל אלקטרודה עם 3 מ KCl.
   2. בנד בכל קצה האלקטרודה עם microforge כדי להבהיר את זה בניצב למשטח הפסגה תא השיער כאשר רכוב המגבר headstage ^16.
3. הכנת טפטפות iontophoresis
   1. משוך נימי זכוכית עם פנימינימת טיפ 50 MΩ. מלאו עם המומס מרוכז (למשל, 500 מ"מ סולפט גנטמיצין).
4. הכנת מרובע הרכבת אלומיניום
   1. חותכים ריבוע 1 ס"מ x 1 ס"מ של נייר אלומיניום. לחורר את הרדיד במרכז עם קצה מוט pithing או חפץ חד אחר. לעצב את ניקוב כך הוא מעגלי כ 1 מ"מ קוטר.
5. הכנת מזרק גריז מלא אבק.
   1. הסר את הבוכנה של מזרק 5 מ"ל. מלאו מזרק מהחלק האחורי עם גריז ואקום. החזר את הבוכנה.
6. הכנת מוליך דבק polytetrafluoroethylene
   1. ערוך צירי 2 מ"מ אורך וחותך סוף מקל מוליך עץ. החריץ צריך להיות במרכז של המוליך כאשר צפו סוף-על.
   2. במספריים חדים או סכין גילוח, לחתוך מלבן 2 מ"מ x 4 מ"מ של polytetrafluoroethylene מסדין של עובי 1 מ"מ.
   3. השתמש סכין גילוח דק אחד הקצוות 2-ארוך מ"מ של מלבן polytetrafluoroethylene. החל באמצע המלבן, להפחית את העובי של המלבן ידי חיתוך החוצה כדי ליצור שיפוע בקצה המלבן.
   4. הכנס את מלבן polytetrafluoroethylene לתוך החריץ המוליך עץ כזה שהקצה הקטומה פונה הרחק מקל. החל 5 דקות אפוקסי לבסיס של המלבן polytetrafluoroethylene כדי לאבטח אותו במקומו. אפשר מוליך הדבק לרפא עבור 1 שעות בטמפרטורת חדר.
7. הכנת החצי התחתון של שני קאמרי הר
   1. מכונית או 3D להדפיס את החצי התחתון של שני קאמרי הר (קובץ 2 משלימה). זהה את מעגל הפסקה בקוטר 20 מ"מ על פני השטח התחתון של החדר.
   2. למרוח שכבה דקה של אפוקסי 3 המ"מ לרוחב ביותר של המעגל השקוע. החל אחד coverslip זכוכית עגולה 18 מ"מ על אפוקסי. אפשר אפוקסי לרפא עבור 1ח.

3. הפקת האיברים הפנימיים-אוזן

1. להרדים צפרדע אמריקנית ידי הצבתו בתוך דלי קטן המכיל הרדמת eugenol במשך 10 דקות. כוון את עוצמת הקול של פתרון כך שקרים משותפים humero-הגלימה של הצפרדע מעל הממשק הנוזל-האוויר.
2. להרדים את הצפרדע מורדמת על ידי pithing הכפול.
   1. אחוז הצפרדע הרדימה עם אצבע אחת על גבי האף שלה ועוד מתחת ללסת וסובבתי את ראשו של הצפרדע קדימה.
   2. במהירות לדרדר את מוט pithing לחדר ההכספות גולגולתי דרך מגנום foramen, אשר נמצא על קו האמצע בין התהליכים העורפיים של הצפרדע.
   3. לאט לסגת ולסובב את המוט עד קצהו יוצא מן מגנום foramen. להכריח את מוט caudally דרך foramina בחוליות להרוס את חוט השדרה.
   4. ודא הצפרדע כבר כראוי כפליים פגועה על ידי ההתבוננות כי הגפיים התחתונים שלה מורחבים.
3. אחוז הצפרדע עם אגודל על גבי אף האצבע הראשונה שהוא תופס את שיני vomerine עבור יציבות משופרת. לערוף את הצפרדע על ידי ניתוק משותף רקתי בילטרלי ובהמשך החיתוך orthogonally לצייר rostrocaudal. כדי להבטיח שהאיברים באוזן הפנימית בתוך הגולגולת נותרו על כנן, להבטיח כי הקיצוץ הוא זנב הוא tympana.
4. באמצעות מיקרוסקופ stereodissection, ולבצע קו האמצע, ביקע את רקמת החיך מהשיניים vomerine במידה האחורי ביותר של הרקמה (איור 1 א).
5. סבר וברור עם חתכים אופקיים של אזמל כל שריר שוכב מתחת רקמות החיך לחשוף את הסחוס האחורי. לאחר הסרת השריר, להתבונן בצורת סוכריה על מקל של הסחוס הזמני להרכיב את הגבול של הקפסולה otic.
6. סבר columella בשלב של קשר שהיה לו עם הסחוס של הקפסולה otic.
7. שוב ושוב לגלח שכבות דקיקות של סחוס זאת על ידי ביצוע shalloחתכים אופקיים w דרכו. הימנע חתכים עמוקים כדי למנוע נזק לאיברים באוזן הפנימית. פעולה זו פותחת את הקפסולה otic נמצא בתוך מבנה סוכריה על מקל של הסחוס הזמני (איור 1B). בתוך הקפסולה otic הם האיברים באוזן הפנימית של הצפרדע (תרשים 1C).
8. חתוך את האחוריים ואת הקצוות לרוחב של הקפסולה otic, נזהר שלא לפגוע באיברים באוזן הפנימית. במהלך הניתוח, לזרום מלוח לעתים קרובות על איברי האוזן הפנימיים על מנת להבטיח כי הם נשארים שקועים התייבשות.
9. אתר את שני הפתחים עגולים העצם הטמפורלית על הקשר המדיאלי של הסחוס אל קו האמצע. חותכים כלפי מטה דרך הפתח המדיאלי ביותר להתפקע העצם הטמפורלית.
10. ביצוע חתך שני כלפי מטה באמצעות הקפסולה otic בקצה postero-הצדדי שלה. הסר את פיסת סחוס בין זה לבין הקיצוץ הקודם כדי לספק גישה לאיברים באוזן הפנימית.
11. לרופף את הסחוס בין חתכי מצעדים 3.8nd 3.9 ופצע אותו מן הקפסולה otic. פעולה זו מנתקת את תעלת החצי העגולה הקרובה, אז מה שיכול לשמש כידית מניפולציות נוספות.
12. נזהר שלא לגעת sacculus, לנתק את השמיני ^ה העצב גולגולתי.
13. החזק את ampulla של תעלת החצי העגולה הקרובה. בעדינות לסובב את האוזן הפנימית לחשוף שתי תעלות בצורת חצי עיגול הנותרים. עם חשיפת כל תעלה, לנתק אותו.
14. החזקת העצב או ampulla יעלה חצי עגול, לחלץ את האוזן הפנימית מהראש ומניח אותו בצלחת המלאה perilymph מלאכותית מחומצן צונן. הסרת האוזן הפנימית היתרים להדמיה של הקטעים בתוך העצם הטמפורלית שדרכו התעלות הסמי עברו פעם אחת (איור 1D).
    הערה: חזור על שלבים אלה כדי לחלץ את האוזן השנייה.

4. הכנה אחת קאמרית

1. בידוד של sacculus
   1. אתר את sacculus ידי זיהוי כהוא הגדול שלהדואר המוני של otoconia ואת עצב saccular שנמצא על גבי זה (איור 1E). יש להיזהר שלא טראומת sacculus פיזית במהלך השלבים הבאים על מנת לשמור על שלמות תאי שיער saccular.
   2. חתוך את תעלות בצורת חצי עיגול כדי להבהיר את האוזן הפנימית יותר יכולת תמרון.
   3. הסר הבור perilymphatic שמעל הצד העצבי של sacculus. לבצע חתכים עדינים מסביב לבור. הבא לנתק את העמודים הקטנים של רקמה כי לגשר על הממברנה של הבור לצד העצבי של sacculus.
   4. הסר את lagena והעצב הקשורים אליו.
   5. החזקת עצב saccular, בעדינות להרים את sacculus ולחתוך את הקרום הדק של שק otoconial. כמו לשפוך otoconia מתוך השק, לשחרר את sacculus ידי חיתוך מסביב שלה.
      הערה: לאחר לבודד את sacculus, איברים באוזן פנימית נותרים ניתן לשמור אם ירצו בכך. הסרת sacculus מקל זיהוי של מבנים אחרים, כגוןאת הגבשושיות הדוחות ו basilar.
   6. השתמש במספריים או מלקחיים כדי לנגב בזהירות משם כל otoconia הנותרים על sacculus. יש להיזהר שלא לגעת sacculus במהלך תהליך זה.
   7. חתוך כל קרום otoconial במבוי הנותרים מהקצה 'sacculus. קרום זה נוטה לדבוק משטחי פלסטיק וזכוכית ופינויו ממזער אתגרים בטיפול הרקמה.
   8. בעדינות לזרום מלוחים מעל sacculus עם פיפטה פסטר כדי להסיר כל otoconia הנותרים (איור 1F).
      הערה: חזור על תהליך זה עבור sacculus השני, שהוא תמונת ראי של הראשונה.
2. עיכול הרכבה
   1. שימוש בסוף האחורי של פיפטה פסטר עם קצהו שבור, להעביר את sacculi מבודד כדי בצלחת פטרי המכילות 3 מ"ל של 67 מ"ג ∙ ל ^-1 פרוטאז XXIV ב perilymph מלאכותית.
      הערה: טיפול פרוטאז זה מעכל הקישורים קשירה כל נורה kinociliary אל otolithicהממברנה, מה שמאפשר הסרה של קרום מבלי לפגוע צרורות שיער חושית.
   2. דגירת הרקמה למשך 30 דקות ב 22 ° C (או 35 דקות ב 21 מעלות צלזיוס). העבר כל sacculus מתעכל אל חדר גלוי-פנים הניסיון ולאבטח את הרקמה עם סיכות מגנטיות.
   3. המקולה saccular שוכן ממש מתחת קרום otolithic והוא החלק של sacculus המכיל תאי השיער. לזהות אותו ובזהירות להסיר קרום otolithic שמעליה שלה באמצעות עפעף בסדר, נזהרת שלא לגעת המקולה saccular.

הכנה דו תאית 5.

1. בידוד של sacculus
   1. לבודד את sacculus מהאיברים באוזן הפנימית כמו בסעיף 4.1.
2. הרכבה ועיכול
   1. מלאו את בלוק הרכבה (קובץ משלימה 3) עם perilymph מלאכותית ולמקם את רדיד אלומיניום מחורר על פתח אחד, באמצעות שתי נקודות של ואקוםלשמן להחזיק אותו במקום ליצור חותם חלש.
   2. העברה אחד sacculus כדי לסכל ומרכז אותו על גבי החור עם המקולה פונה כלפי מטה ואת גדם העצב פונה כלפי מעלה.
   3. סר המלוח סביב sacculus עם פיסת הרקמה מעווה. וויק המלוח לייבש את פני השטח של ריבוע האלומיניום סביב sacculus.
   4. השתמש מוליך polytetrafluoroethylene ליישם דבק cyanoacrylate כדי ליצור חותם חזק לאורך הגבול בין הקצה של sacculus וכיכר האלומיניום. ודא כי ההיקף הכולל של sacculus מכוסה דבק.
      הערה: הליך לאט מדי מאפשר דבק cyanoacrylate לזחול על הצד העצבי של sacculus ולבסוף לכסות אותו. לכן הכרחי כדי להשלים משימה זו במהירות.
   5. מניחים טיפת מלח על גבי הרקמה רכוב לרפא את הדבק. דוק של דבק עלול להיווצר על גבי טיפת מלח; להסיר אותו עם מלקחיים.
   6. מוציאים בזהירות tהוא לסכל מהגוש הגובר. תהפוך את הרקמה רכובה על כך שהצד מהקולרים של sacculus פונה כלפי מעלה ולצוף אותו על צלחת פטרי מלאכותית מלא perilymph.
   7. הוסף טיפה של תמיסת XXIV פרוטאז על גבי המקולה דגירה במשך 30 דקות ב 22 ° C (או 35 דקות ב 21 מעלות צלזיוס). מלא את התעלה התחתונה של המנגנון השני הקאמרי (קובץ משלימת 2) עם גריז ואקום perilymph והמקום ברחבי האולם המרכזי.
   8. מניח את sacculus רכוב בצלופן על בתא התחתון עם העצב שלה מול פני השטח של התא. להוסיף גריז מסביב את נייר הכסף.
   9. מניחים את החדר העליון (קובץ משלימה 1) של התכשיר על נייר הכסף, מקפיד ליצור חותם שלמה עם גריז ואקום. ממלאים את החדר העליון עם endolymph מלאכותית מבעבע בעדינות להסיר את הקרום otolithic עם עפעף.

תוצאות

האפיתל החושית של sacculus של הצפרדע יכולה להיות מועסקת בתצורות שונות כדי לחקור את הפיסיולוגיה של תאי שיער. מכיוון הרקמה הוא שטוח יחסית, זה יכול להיות מותקן בשני חד והכנות שני קאמריות. התצורה חד התא מספקת התקנה פשוטה עבור קלטות אלקטרו ו micromechanical של תאי שיער. הכנת שני הקאמרית במקום מדמה היא endolymphatic ותאי perilymphatic על בהתאמה צדדי apical ואת הבסיס של תאי שיער. תאים אלו יחד מספקים סביבה-רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לחקר mechanotransduction ידי תאי שיער.

המאפיינים רגישי תמרה של תאי שיער בבסיס התגובה החשמלית שלהם לגירוי מכאני. כדי לחקור תכונות אלה, הקליטו בו זמנית מתוך שיער בודד לתא עמדת הצרור שלהפוטנציאל קולטן של התא (איור 2). אנחנו ראשונים צרפנו סיבי זכוכית גמישים הנורה kinociliary של צרור שיער ליישם פולסים כוח. לאחר מכן, אנו מודדים את העקירה של צרור השיער באמצעות (איור 2 א) מערכת ² כפול photodiode. אנחנו ובמקביל רכשנו את הפוטנציאל של שיער התא על ידי impaling התא עם microelectrode חדה. השגנו עקומת עקירה-תגובה על ידי התוויית תגובת מתח השיא שהושרה על ידי כל גירוי מכאני נגד העקירה המקבילה של השיער הצרור (איור 2 ב). שיער התגובה החשמלית של תא המרווה היא קיצון positive- ושלילית עקירה. צמצום פוטנציאל הממברנה בצעדי תזוזה שליליים מעיד על קיומו של מנוחה פנימה נוכחי mechanotransduction. נוכחי מנוחה זו היא מווסת על ידי הפעולה של Ca ^{2 +} משתי ההסתגלות המהירה ואיטית ^{17, 18, 19, 20, 21.}

ההתנהגות של שיער תא תלוי לא רק על התכונות החשמליות שלה, אלא גם על micromechanics של צרור השיער החושי שלה. מחק תצורת שני קאמרי הפרדת endolymph ו perilymph in vivo, מתן תנאים אידיאליים עבור המחקר של המכניקה של צרור שיער. בתנאים אלה ועם קרום otolithic המוסר, חבילות שיער יכולות להתנדנד באופן ספונטני ^6. הנה שיישמנו הכנת השנייה הקאמרית להעריך את micromechanics צרורה בודד. הקלטנו את תנודות ספונטניות של צרור שיער על ידי ומטילה צל על צג עקירה כפול photodiode (איור 3). כדי להעריך את התפקיד של גנטמיצין aminoglycoside אנטיביוטי על mechanotransduction, אנו iontophoretically rele ased גנטמיצין ישירות על גבי צרור שיער (איור 3). ריכוז גנטמיצין שוחרר עולה באופן יחסי עם הזרם עבר דרך micropipette. גנטמיצין מעכב בתנודה של צרור שיער ומשרת סטטי הקיזוז הצרור לכיוון הצד הגבוה שלה. תופעות אלה משקפים את התפקיד של גנטמיצין כמו חוסם פתוח ערוצים המקיים במצב הפתוח של ערוצי mechanotransduction תוך חסימת הנקבוביות החלחול שלהם. Iontophoresis של כימיקלים טעונים מתיר מקומי ושחרור לכימות של כימיקלים בריכוזים שונים בהעדר הפרעה מכאנית הנגרמת זרימת נוזל ובכך הוא אידיאלי לחקר אברונים mechanosensitive כגון צרור שיער ^22.

הצעה ספונטנית של שיער צרור נובעת הגומלין בין הסתגלות וקשיחות צרור קוי ^7,Xref "> ^{8, 23, 24.} תנועה ספונטנית זוהי חתימה של תהליך הפעיל של שיער צרור, אשר ממיר אנרגית אות לעבודה מכאנית להתגבר גרור צמיג. צרורות שיער הוכחו להפגין קשיחות מיידית קוית של שיווי המשקל ^2, שמיעה ^25, ומערכות לרוחב-קו ^26.

אנחנו ישירות מדדנו את הקשיחות המיידית של צרור שיער בודד מתוך של sacculus הצפרדע (איור 4). כדי להשיג זאת, אנו מצמידים קצה סיב זכוכית גמיש כדי נורת kinociliary של השיער הצרור (איור 4 א). סיפקנו כוחות אל צרור שיער על ידי תפיסת הבסיס של סיבים. הכח המופעל על צרור השיער על ידי סיבי הגירוי תואם את ההבדל בין ההתקות של bas של הסיביםדואר קצה, כשהוא מוכפל של קשיחות סיבים ^{2, 27.} מתן פולסים על פני מגוון של כוחות מגלה קשר בין הכח המופעל על הצרור ואת העקירה שהתפתחה של האגד. השיפוע ביחס לכוח-עקירה זו תואם את הקשיחות המיידית של השיער הצרור (איור 4 א).

שיטה זו אפשרה לנו למדוד ונוקשות מיידי של צרור הפרט כפונקציה של הסטייה שלה (איור 4B). עקומת כוח-העקירה המיידית מציגה מערכת יחסים ליניארית, חושף נוקשות קויות של הצרור על פני טווח של כ -20 ננומטר סביב למצב ההמנוח שלו. מחוץ לטווח זה, צרור השיער מתנהג כמו חומר Hookean, הנוקשות שלה היא ליניארי עבור סטיות גדולה בסולם ריכטר.

תוצאות אלו demonstלדרג את הרבגוניות של צפרדע sacculus בחקר הפיזיולוגיה שיער תאים. באמצעות תכשירים אחרים ואלה, ואפשר לטייל בה mechanotransduction בשלבים מרובים בהעברת מידע מהצרור לכיוון המוח.

איור 1: Dissection של האוזן הפנימית של הבוקסר. (א) צופה בחיך העליון של הצפרדע מצד הגחון שלה ניתן לזהות את חצוצרת השמע (העיגול). השתקפות לרוחב של העור המכסה את הצד הימני של החיך העליון מגלה את מיקומו של האוזן הפנימית (תיבה מקווקות). הסרה (B) של הסחוס בצד הגחון של העצם הטמפורלית של הצפרדע פותחת את הקפסולה otic (קו מקווקו). (ג) הוצג הוא תמונה בהגדלה גבוהה יותר של הקפסולה otic, שבו sacculus, lagena, CN VIII, ו sacc עצב תואר בלבד ניתן לזהות בקלות. (ד) נוכח הקפסולה otic לאחר הסרת האיברים באוזן הפנימית מגלה את מיקומם של התעלות הסמי. (ה) לאחר הסרת האוזן הפנימית המבודדת, sacculus, lagena, ו- VIII ^ה עצב גולגולתי (VIII CN) ניתן לזהות בקלות. (ו) sacculus המבודד בעל גדם קצר של עצב saccular ו קרום otolithic שוכב על גבי האפיתל החושית שלה. תוויות מתאימות (i) sacculus, (ii) lagena, (iii) CN VIII, (iv) העצבים saccular, ו (v) קרום otolithic. ציר תוויות P ו- A מתאימה בהתאמה להנחיות האחוריות קדמיות. ברים סולם מייצגים 1 ס"מ (A, B), 1 מ"מ (C, D, E), ו -400 מיקרומטר (F).
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
s "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן להורדת גרסה וקטור של נתון זה.

איור 2: Curve תגובת תזוזה עבור תא שערה אחת. (א) קצה סיב גירוי זכוכית היה מצמיד את נורת kinociliary של צרור שיער והבסיס של הסיבים נעקר ובהמשך פני תשע פסיעות בדידות. העמדה הצרורה הייתה במעקב על מערכת הכפולה-פוטו-דיודה, ופוטנציאל הקולטן שלו נמדד בו זמנית באמצעות microelectrode שתפוקתם נחקקה דרך מגבר במצב גשר. התנגדות טיפ של האלקטרודה הייתה 95 MΩ ואת פוטנציאל הממברנה המנוחה של הצרור היה -47 mV. (ב) עלילה של פוטנציאל קולטן של הצרור כפונקציה של העקירה שלה חושפת מערכת יחסים לינארית בין תגובת הצרור שלהעמדה. כל נקודה תואמת את העקירה ולהתכוון ממוצע מעל חלון 2.5 ms זמן, החל 2.5 מילישניות לאחר הופעת הגירוי מכאני. כל צבע מייצג סט של סדרת הזמן המתאימה לאותו דופק העקירה.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנא לחץ כאן כדי להוריד בגרסה וקטורית של נתון זה.

איור 3: השפעת גנטמיצין על תנודה Bundle ספונטני שיער. התנועה הספונטנית של צרור שיער תכשיר השני קאמרי נרשמה באמצעות מערכת פוטו-דיודה כפולה. בהיעדר שחרור iontophoretic של גנטמיצין (0 Na), השיערצרור מציג תנודות סימטריות. כמו גודל של זרם עבר דרך פיפטה iontophoretic מלא 500 מ"מ סולפט גנטמיצין גדל (10 נה, 20 Na), תדירות טיולים שיער חלק מחבילה נופל באופן תלוי מינון ואת צרור מקוזז לכיוון קצה גבוה שלה למשך זמן ארוך יותר תקופות זמן.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
אנא לחץ כאן כדי להוריד בגרסה וקטורית של נתון זה.

איור 4. חישוב קשיחות המיידי של שיער Bundle. (א) סיבי גירוי (אדום) של קשיחות K _F מצמיד to נורה kinociliary (החום) של צרור שיער בודד (צהובה). לעקירתם בבסיס סיבים במרחק ידוע X _F גורם צרור להעביר _B X המרחק. ההבדל בין ההתקות של סיבים ואת הצרור הוא יחסי הכח המופעל על הצרור ידי סיבי הגירוי, F _F. חזרה זו על פני מגוון של כוחות מניב יחס כוח-עקירה מיידי (מימין), השיפוע אשר תואם את הקשיחות המיידית של השיער הצרור. (ב) צרור פרט היה נתון לכפות פולסים בעצמה גוברת והתזוזה שלה בתוך 50 ms הראשונים לאחר הופעת הדופק נמדדה (נקודות כחולות). הנה צרור שיער מציג קשיחות קוית מיידית על פני טווח של כ 20 ננומטר סביב למצב ההמנוח שלו. עקומת אדום מתאים לנכון היחס F = k * X - * 60 * z (1 / (1 + exp (- z * (X - X ₀₎ / (k _B * T))) + F _0, שבו F הוא הכוח המופעל על הצרור, X הוא עקירה של צרור, k = 790 ± 51 μN ∙ מ ^-1 הוא צרור של קבוע כאשר נוקשים כל הערוצים הם או סגורים או פתוחים, z = 0.43 ± 0.04 pN הוא הכח של קפיץ gating יחיד, X ₀ = 2 ± 1.9 ננומטר הוא המיקום של הצרור שבה 50% של הערוצים שלה פתוחים, _B k הוא בולצמן של מתמיד, T היא הטמפרטורה, ו- F ₀ = 11.7 ± 1.3 pN הוא כוח לקזז. התאמת בעל מקדם הסבר של 0.98. סיבי הגירוי היו נוקשות של 107 μN ∙ ^-1 מ '.
אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
es / ftp_upload / 55,380 / Figure4_v5.eps "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן להורדת גרסה וקטור של נתון זה.

המומס	משקל פורמולה (g / mol)	הוסף 1 L
		perilymph מלאכותית	endolymph מלאכותית
NaCl	58.4	6.54 גרם	0.117 גרם
KCl	0.149	0.149 גרם	8.62 גרם
CaCl 2 ⦁ 2H 2 O	147	2 מ"ל של 1 M CaCl 2 המניות	250 μL של 1 M CaCl 2 מניות
HEPES	238.3	1.19 גרם	1.19 גרם
D - (+) - גלוקוז	180.2	0.541 גרם	0. 541 גרם

פתרונות לוח 1. לנתיחת הכנה ניסויית. מוצגים בלוח זה הם מתכוני perilymph מלאכותית ופתרונות endolymph מלאכותיים המשמשים לנתיחה בהכנות אחת או שני קאמריות. הפתרונות להביאן 7.2 pH - 7.4 עם כ -2 מ"ל של NaOH (perilymph) או 2 מ"ל KOH (endolymph). כוחו האוסמוטי צריך לקרוא כ 230 מילימול · קילו ^-1 עקב ניתוק יוני שלם.

Discussion

בתוך של sacculus הצפרדע לשקר כמה אלף תאי שיער חושיים נגישים. כאן אנו מדגימים חילוץ והכנה sacculus להקלטות אחד והשני קאמרית. ההכנות שני אלה מאפשרים בשני המחקרים micromechanical ו אלקטרו של תאי השיער חבילות הקשורים בהם. מכיוון הרקמה יכולה לשרוד במשך כמה שעות עם החלפה תכופה של תמיסת מלח מחומצן, ניסויים יכולים להימשך תקופות ארוכות. תאי שיער בהכנות אלה בדרך כלל נשארים קיימא עבור הקלטה microelectrode עד 6 שעות לאחר הניתוח, בעוד צרורות שיער להתנדנד באופן ספונטני עד 24 שעות לאחר החילוץ.

מיצוי הרכבה מוצלח של sacculus צירים על surmounting כמה אתגרים משותפים. ראשית, מגע ישיר עם למשטח הפסגה של המקולה saccular יש להימנע לאורך כל ההליך הכנה. העצב saccular מספק ידית נוחה manipu בטוחאוכלוסייה של sacculus. לאחר משוחררים משאר האיברים הפנימיים-האוזן, sacculus יועברו בעזרת פיפטה גדול נשא תוך שמירה שקוע בנוזל, כדי למנוע נזק מכני האפיתל חושית שלה. הסרת otoconia מפני השטח מקולרי חייב להסתיים ללא נזק מכני לתאי שיער. מכיוון otoconia לשקר ישירות על גבי המקולה, בתאי השיער עלולים להיפגע על ידי מגע מקרי בין כלי לנתיחה הממברנה otolithic תוך הסרת otoconia. כדי למנוע ניזק, אנו ממליצים שההמסה הדביקה של otoconia שתתקיים בבאתר רחוק המקולה והוציאה כגוש אחד. זה ימנע פיצול של מסת otoconial לאשכולות רבים, שכל אחד מהם יהיה חילוץ בנפרד. אם אשכולות קטנים של otoconia להישאר הם יכולים להסיר עם לחץ נוזל עדין נמסר על ידי פיפטה פסטר. אתגר אחרון כולל היווצרות חותמת חזק בין כיכר הרכבת sacculus והאלומיניום בהכנת שתי קאמרית. העסקה מרובעת עם נקב קטן מספיק כדי לאפשר חפיפה של כ -100 מיקרומטר בין sacculus ואת היתרי אלומיניום שמסביב אטימה מלאה של הרקמה. הדבק צריך להיות מובא במגע עם כ 100 מיקרומטר של רקמות saccular מסביב של המקולה כדי ליצור חותם חזק.

ריכוז Ca חינם ²⁺ הוא שיקול חשוב בחקר תאי שיער. Ca ^{2 +} המסדיר הוא הסתגלות מהירה ואיטית, ובכך בקביעת קינטיקה של מנגנון mechanotransduction ואת המאפיינים של תופעות פעילה בתהליך של צרור השיער, כולל תנועת ⁸ צרור ^{ספונטני, 23.} סידן Endolymphatic in vivo נמצא ב 250 מיקרומטר, ולכן קינטיקה הרלוונטית ביותר מהבחינה הפיזיולוגית מוערכת בריכוז זה (Maunsell JHR, ר 'ג' ייקובס, ו AJ Hudspeth. Unpublisתצפיות הד ^16). עם זאת, קלטות microelectrode מתאי שיער דורשות ריכוז סידן חיצוני עולה על 2 מ"מ לאיטום תקין של הממברנה התאית סביב microelectrode. לכן חשוב להשתמש מלוחים גבוה סידן לניסויים אלה. לבסוף, אחד מומלץ לחקור את ההשפעות של סידן חיצוני על mechanotransduction באמצעות מגוון של ריכוזי סידן. במקרים אלה, חשוב לזכור כי ריכוזי סידן מתחת ל -1 מיקרומטר בדרך כלל להוביל לקרע טיפ-link ואובדן בלתי הפיך של תמרה ^28.

שתי ההכנות ניסיון המתואר כאן מאפשרות מגוון של מדידות biophysical על תאי שיער. עם זאת, מדידות נוספות יכולות להתבצע עם שינויים קלים כדי ההכנות הללו. בהכנת saccular המקופלת, חבילות שיער הם דמיינו רוחביים. הדמיה בתנועה שיער חלק מחבילה מנקודת תצפית זו מגלה mot קוהרנטיתיון של שני stereocilia הקצר והגבוה ^29. הנה המקולה saccular מופרדת ראשונה מרקמות הבסיס שלה ובהמשך מקופל לאורך הציר המוגדר על ידי עצב saccular כך צרורות שיער פן כלפי חוץ הם דמיינו רוחביים בקפל. מודיפיקציה שני, דיסוציאציה שיער תאים, מאפשר המחקר הן של הצרור של תא שיער סומה שלה. תאי שיער הם ניתקים מכאניים על גבי זכוכית נושאת עבור הקלטת הדמית אלקטרו ^30. לבסוף, בתאי השיער ניתן הנמתח מן האפיתל על ידי ביצוע פרוטוקול דיסוציאציה דומה אך ללא הצעד ניתוק מכני. תוצאות טיפול זה בתאי השיער בהדרגה extrude מתוך האפיתל, מתן גישה basolateral עבור הקלטות אלקטרו תוך מזעור נזק מכני. תכשירים אלה ושינויים רבים שלהם להפגין את הרבגוניות של הצפרדע sacculus כמערכת מודל עבור biophysicalמחקר של תאי שיער חושיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Common to both preparations
Stereo-dissection microscope	Leica	MZ6	Other sources can be used
Tricaine methanesulfonate	Sigma	E10521	Other sources can be used
Metal pithing rod	Fine Science Tools	10140-01
Vannas spring scissors	Fine Science Tools	15000-03
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-20
Glass Pasteur pipette and bulb (x2)	Fisher Scientific	22-042816
Fine eyelash mounted on a hypodermic needle	Fisher Scientific	22-557-172
Dow-corning vacuum grease	Fisher Scientific	14-635-5C
Syringe for vacuum grease	Fisher Scientific	14-829-45	Other sources can be used
35 mm Petri dish (x2 - 3)	Fisher Scientific	08-772A	Other sources can be used
Micropipette puller	Sutter	P-97 or P-2000
120 V Solenoid puller			Home-made, see parts list
Sputter coater	Anatech USA	Hummer 6.2
Current source for iontophoresis	Axon Instruments	AxoClamp 2B	Other sources can be used
Piezoelectric actuator	Piezosystem Jena	P-150-00
Amplifier for piezoelectric actuator	Piezosystem Jena	ENV800
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1B120F-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
For one-chamber preparation
Microelectrode amplifier	Axon Instruments	AxoClamp 2B	Can be used for iontophoresis and microelectrode recordings simultaneously
Magnetic pins (x2)			Home-made, see parts list
Open-top chamber with magnetic sheet			Home-made, see parts list
Name	Company	Catalog Number	Comments
For two-chamber preparation
Upper chamber			Supplementary file 1
Troughed lower chamber			Supplementary file 2
Aluminum foil	Fisher Scientific	01-213-100	Other sources can be used
Mounting block			Supplementary file 3
Wooden applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112	Other sources can be used
Teflon sheet	McMaster-Carr	8545K12	For teflon applicator
Cyanoacrylate glue	3M	1469SB
Lab tissues (Kimwipes)	Fisher Scientific	06-666A	Other sources can be used
Gentamicin sulfate	Sigma-Aldrich	G1914	Other sources can be used
Quick-setting epoxy	McMaster-Carr	7605A18
18 mm glass coverslips	Fisher Scientific	12-546	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments
Saline components
NaCl	Fisher Scientific	S271-3	Other sources can be used
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G	Other sources can be used
CaCl2 • 2H2O	Fisher Scientific	10035-04-8	Other sources can be used
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375-100G	Other sources can be used
D-(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G7021	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Parts lists for home-made equipment
Solenoid puller
Solenoid	Guardian Electric	A420-065426-00	Other sources can be used
Foot-pedal switch	Linemaster	T-51-SC36	Other sources can be used
Pipette holder	World Precision Instruments	MEH900R	Other sources can be used
Coarse manipulator	Narishige Group	MM-3	Other sources can be used
Platinum wire	Alfa Aesar	25093	Other sources can be used
Power supply	Leica	Z050-261	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Magnetic pins
Epoxy	McMaster-Carr	7556A33	Other sources can be used
1 mm thickness aluminum	McMaster-Carr	89015K45	Other sources can be used
Insect pins	Fine Science Tools	26000-40	Other sources can be used
Name	Company	Catalog Number	Comments/Description
Open-top magnetic chamber
Flexible magnetic strip	McMaster-Carr	5759K75	Other sources can be used
1 mm thickness aluminum	McMaster-Carr	89015K45	Other sources can be used