גישה G-quadruplex זיקה-DNA עבור טיהור של enzymatically Active G4 Resolvase1

Summary

G4 Resolvase1 נקשר G-quadruplex (G4) מבנים עם זיקה המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב ומייצג את מרבית הפעילות ההתרה G4-DNA בתאים הלה. אנו מתארים פרוטוקול רומן שמנצל את הזיקה ופעילות התרה תלויה ATP של G4-Resolvase1 לטהר במיוחד קטליטית G4R1 רקומביננטי הפעיל.

Abstract

מהסוג-הגבוה-יותר מבני חומצות גרעין בשם G-quadruplexes (G4S, מבני G4) עלול להצטבר באזורים עתיר גואנין הוא DNA ו- RNA והם מאוד יציבות תרמית. ישנם> 375,000 רצפים G4 יוצרי המשוערת בגנום האנושי, והם מועשרים באזורי אמרגן, אזורים מתורגמים (UTRs), ובתוך חוזרי telomeric. בשל פוטנציאל מבנים אלה כדי להשפיע על תהליכים תאיים, כגון שכפול שעתוק, התא התפתח אנזימים כדי לנהל אותם. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase 1 (G4R1), אשר היה שותף מאופיין ביוכימית ידי מעבדה שלנו Nagamine et al. , ונמצא שהיא נקשרת בצורה חזקה ביותר לשני _(ד K בטווח הנמוך-PM) G4-דנ"א G4-RNA. G4R1 הוא המקור של רוב הפעילות-בפתרון G4 lysates התא הלה ומאז היה מעורב לשחק תפקיד במטבוליזם הטלומרים, פיתוח הלימפה, שעתוק גנים, hematopoiesis, ומעקב חיסוני. יכולת EFficiently להביע ולטהר קטליטית פעילה G4R1 היא בעלת חשיבות למעבדות מעוניינות להשיג תובנה נוספת לתוך האינטראקציה הקינטית של מבני G4 ואנזימים-בפתרון G4. כאן אנו מתארים שיטה מפורטת לטיהור רקומביננטי G4R1 (rG4R1). ההליך המתואר משלב את טיהור הזיקה המבוססת המסורתית של אנזים היסטידין מתויג בטרמינל C-הביעה בחיידקי קודון אופטימיזציה אדם עם הניצול של היכולת של rG4R1 להיקשר ולהירגע-DNA G4 לטהר אנזים פעיל מאוד בתוך ATP- צעד elution תלוי. הפרוטוקול כולל גם צעד בקרת איכות שבו הפעילות האנזימטית של rG4R1 נמדדת על ידי בחינת היכולת של האנזים מטוהר להירגע G4-DNA. שיטה גם מתוארת כי מאפשרת כימות של rG4R1 המטוהר. עיבודים אלטרנטיביים של פרוטוקול זה הם דנו.

Introduction

מבני G4 הם מבנים משניים מאוד יציבים חומצות גרעין היוצרים בתוך האזורים עשירים-גואנין של DNA ו- RNA. מבני G4 מיוצבים באמצעות אינטראקציות מליטות Hoogsteen ולתאם מליטה בתוך החלל המרכזי עם קטיונים חד ערכיים (כלומר. K ⁺ ו ⁺ Na) שתורמים משמעותי ליציבות התרמית המדהימה של מבני G4 ^{1, 2.} מחקרים ביואינפורמטיקה מוקדם הציע כי הגנום האנושי מכיל> 375,000 "מוטיבים G4 יוצרי פוטנציאל" ^{3, 4.} עוד הערכות מחקר שנערך לאחרונה עולה כי מספר מוטיבים G4 גבוה בפקטור של 2-5 ^5, ואילו במחקר אחר צופה 716,310 רצפי G4 יוצרי פוטנציאל מובהק בגנום האנושי ^6. G4 יוצרי רצפים שמורים באבולוציה ולא התפזרו באופן אקראיהגנום. מוטיבי G4 מועשרים באזורי קידוד גן, ולמעלה מ -40% מכלל יזמי הגן מכילים G4 מוטיבים ^7. מעניין לציין, כי מידת העשרת מוטיבים G4 בגן הודגמה להציע את הפונקציה של הגן. לדוגמא, פרוטו-אונקוגנים וגנים מעורבים בפיתוח באופן משמעותי העשרה גדול של מבני G4 מאשר גני מדכאי סרטן ^{8, 9.}

עם יציבות תרמית גבוהה, נוכחות בכל מקום כמעט לאורך הגנום, ואת הפוטנציאל להשפיע על תהליכים סלולריים גדולים משמעותי, אין זה מפתיע לגלות כי התא התפתח אנזימים לנהל את המבנים האלה. אנזים אחד כזה הוא G4 Resolvase1 (G4R1; המכונה גם RHAU ו DHX36), אשר אפיינו כמקור של רוב פעילות בפתרון tetramolecular G4-דנ"א אנושי (הלה) תאים ^10. מאז, הוכח that G4R1 ומסוגר המחבר ואת קטליטית unwinds ו tetramolecular unimolecular G4-דנ"א G4-RNA עם KDS המדווחת ההדוקה עבור חלבון G4 מחייב ^{11, 12, 13.} בנוסף, הפעילות-בפתרון G4 של G4R1 הייתה מעורבת במגוון רחב של תהליכים ביוכימיים הסלולר, כוללים ביולוגיה הטלומרים / טלומרז ^{11, 14, 15, 16,} שעתוק שחבור ^{17, 18, 19, 20,} פיתוח ^21, hematopoiesis תקנה ^21, והמערכת החיסונית ^{22, 23.} עם רצפים עליונים של G4 ממוקם במיוחד לאורך הגנום ואת p הסלולר המגווןrocesses כי G4R1 היה מעורב לאחרונה להיות מעורבים עם, היכולת להביע ולטהר ביעילות מאוד פעיל rG4R1 יהיה בעל חשיבות עליונה עבור הבהרת המנגנונים הביוכימיים והתנהגויות של חלבון זה.

הנה, אנחנו מדגימים ביטוי ברומן ואת ערכת טיהור (איור 1) שמנצל של ATP התלוי, הפעילות-בפתרון G4 של rG4R1 לבודד אנזים פעיל ביעילות. תכנית זו יכולה להיות מותאמת לטהר אנזימי חומצות גרעין תלוי ATP אחרים עבורו המוצר של התגובה האנזימטית הוא כבר לא מצע לכריכה, כפי שנהוג עבור G4R1.

Protocol

1. הכנת מבנים G4-DNA כדי לשמש עבור טיהור rG4R1 (כינונה של Biotinylated G4-DNA G-Quadruplex)

1. הזמן את oligomer DNA הבא, שנקרא Z33-ביו, ביחס של 1 μmole מידה: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT ביוטין 3'. ודא כי מחצית ביוטין היא על 3 'סוף oligomer.
2. הכן 10x חיץ G4: 450 mM Tris-HCl pH 8, 25 מ"מ EDTA, ו -2,500 מ"מ NaCl.
3. Resuspend את oligomer Z33 ב 250 μL של מים (כך ריכוז oligomer הוא ~ 2.5 מ"מ). הוסף 25 μL של 10x חיץ G4 ומערבבים. דגירת oligomer ב 50 מעלות צלזיוס במשך ~ 48 שעות.
4. בקצרה לסובב את הצינור כדי לאסוף את העיבוי (בערך 1000 XG, 10 שניות). הוסף ~ 50 μL של פוליסכריד גבוהה המונית, הידרופילי (30% Ficoll ב O H ₂₎ ומערבבים. יוצקים ג'ל גליצרול 10% acrylamide / 1x TBE / 10% (מידות ג'ל: 16 ס"מ x 16 ס"מ x 1 מ"מ). לאחר ג'ל הוא polymerized, לשטוף את הבארות עם TBE 1x והעומסoligomer Z33-ביו נוצר באופן שווה על פני רוב ג'ל (טעינת ליין מדגם ניתן דמיינו עם קווי שליארן).
   1. בנתיב אחד בסוף הג'ל, לטעון חלק קטן של oligomer כי כבר מחומם על 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (זה ישמש פקד מובנה), כמו גם כמות קטנה של צבע טעינת ג'ל אחר השביל כדי לפקח כמה רחוק את הג'ל יש להפעיל.
5. השתמש 1x TBE כמו למאגר פועל ג'ל ולהפעיל את הג'ל על 120 V עד בחזית לצבוע חצו לפחות 1/3 של הג'ל.
6. מניחים צלחת כרומטוגרפיה בשכבה דקה עם הפנים למעלה הצד המחוספס שלה באריזת מגן גיליון (או מכסים בניילון נצמד). סר אחד מלוחות הזכוכית ולהעביר את הג'ל אל פני השטח של המגן וכו. כבו את האורות תקורה וצל UV הג'ל (אורך גל ארוך: 365 ננומטר). השתמש סכין גילוח טרי לחתוך את להקת G-quadruplex-Z33-ביו, אשר תראה בריצה גבוהה בתוך הג'ל (שיש ניידות איטית) ביחס להמסשליטת ed.
7. מניחים את הפרוסה ג'ל המכיל את G4-DNA שנוצר בתוך שפופרת 50 מ"ל ולהוסיף מספיק השריה חיץ כדי לכסות את הפרוסה ג'ל (חיץ השריית מורכב 1/3 נפח 10x TBE, אצטט נתרן 1/3 נפח רווי, 1/3 נפח H ₂ O). מניחים את הצינור בתוך 37 ° C חממה (nonhumidified) דגירה O / N.
8. מעבירים את הפתרון לצינור מ"ל 15 ולהוסיף גליקוגן נפח 1/10 (מלאי הגליקוגן ב 20 מ"ג / מ"ל ​​ב 10 mM Tris-HCl pH 8, 2.5 mM EDTA pH 8, ו אזיד הנתרן 0.05%) ו ~ isopropanol נפח 1.2x .
   הערה: אזיד הנתרן הוא בחריפות רעילים, כך השתמש בזהירות!
   1. מערבבים ומניחים את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס במשך לפחות h 2. לסובב את הצינור ב 2,700 XG בצנטריפוגה שולחן מקורר 4 מעלות צלזיוס במשך 12 דקות. בעדינות למזוג את הפתרון מן G4-DNA pelleted. שטפו את הכדור 3 פעמים עם 70% EtOH + 50 מ"מ NaCl (מלח בכביסה הוא קריטי ליציבות G4). וויק משם נוזל עודף בנייר טישו נטול סיבים.
9. מקוםגלולת השטף במקרר למשך שעה לפחות 2 מימה הגלולה ולאפשר resuspension קל. Resuspend גלולה ב 50 μL של חיץ TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 מ"מ NaCl, ו 0.05 מ"מ EDTA pH 8).
10. מקום 5 μL של התגבשה זה DNA G-quadruplex לתוך 495 μL של H ₂ O ולכמת באמצעות ספקטרופוטומטר המאפשר מקדם הכחדה שייקבע על ידי הזנת בהרכב נוקלאוטיד של oligomer (מקדם הכחדה של oligomer DNA Z33 עם הרכב הבסיס של A = 8, C = 3, G = 15, ו- T = 7 הוא 341,946 L / mol / ס"מ). הזן את הגורם לדילול 25 (לא 100), כמו G-quadruplex נוצר מורכב 4 גדילי הדנ"א.
11. Aliquot המקבילה נפח של 3 ODS (OD ₂₆₀ יחידות) לכל צינור ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס; למשל, אם 5 μL כי נוספו 495 μL של H ₂ O נותן קריאת OD ₂₆₀ של 3, אז להכין 5 aliquots μL.

2. הכנת מבנים G4-DNA כדי שניתן יהיה להשתמש בו Assay הפעילות האנזימטית של rG4R1 (כינונה של טמרה שכותרתו G4-DNA)

1. הזמן את oligomer DNA הבא, שנקרא Z33-TAM, ביחס של 1 μmole מידה: 5 'טמרה-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. ודא כי מחצית טמרה נמצאת 5 'סוף oligomer.
2. בצע את אותו תהליך כמפורט בסעיף 1 להיווצרות של-quadruplex G, חוץ מזה הצללה אולטרה סגול (UV) הוא לא נחוץ משום tetramethylrhodamine (טמרה) -labeled G-quadruplex יהיה גלוי בקלות בעין בלתי מזוינת. שוב, הקפד לכלול שליטה מומסת על הג'ל.
3. לאחר לקיחת הקריאה ספקטרופוטומטר של-quadruplex G טמרה שכותרתו DNA, כמו בשלב 1, לדלל את G-quadruplex שמטרתן 0.2 pmol / μL עם חיץ TNE. לבסוף, להוסיף גליצרול לריכוז ולאחסן הסופי 10% ב -20 ° C.

3. Transform (DE3) PlysS תאים מוסמכים עם PTRiEx4-DHX36 (G4R1 אדם הקידוד פלסמיד) ולגדול / יגרום גדולות תרבויות חיידקים

1. השג את הפלסמיד TriEx4-DHX36.
2. Aliquot החיידקים לתוך 20 aliquots μL ולאחסן אותם ב -80 ° C. Aliquot המדיום SOC (2% tryptone, תמצית שמרים 0.5%, 10 מ"מ NaCl, KCl 2.5 מ"מ, 10 מ"מ MgCl _2, 10 mM MgSO _4, ו -20 גלוקוז מ"מ) לתוך 80 aliquots μL ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
3. כן carbenicillin (פחמימות) / chloramphenicol (CAM) צלחות LB-אגרו. ריכוזים מאגר של פחמימות ו- CAM הם 50 מ"ג / מ"ל ב H ₂ O ו -35 מ"ג / מ"ל ב -70% EtOH, בהתאמה, ואלה 1,000x מרוכזת; וכך, הריכוזים הסופיים צלחות מבחר אגר LB 50 מיקרוגרם / מיליליטר ו -35 מיקרוגרם / מיליליטר, בהתאמה.
4. מקום 1 aliquot של חיידקים על הקרח ומניחים 1 aliquot של המדיום SOC ב RT. הוסף 1 מיקרוגרם של פלסמיד pTriEx4-DHX36 החיידק לערבל בעדינות עם קצה פיפטה לערבב. דגירה על קרח למשך הלם חום אז 5 דקות נוספות ב 42 & #176; C למשך 30 שניות. מניחים על קרח במשך 2 דקות ומוסיפים את המדיום SOC.
5. פלייט את החיידקים שינו על צלחות מבחר prewarmed (בדרך כלל, צלחת נפח קטן, כגון 5 - 10 μL, כדי להבטיח צפיפות מושבה נמוכה כך מושבות אחת יכולות להיות מחוסנות בקלות לתוך תרבויות גדולות) ו לדגור על 37 מעלות CO / N.
6. כן מרק נהדר על פי הוראות היצרן ^24. הפוך 500 מ"ל לכל בקבוק גדול (לוודא להוסיף גליצרול) החיטוי על מחזור נוזלי קצר.
7. להוסיף פחמימות / CAM (50 מיקרוגרם / מ"ל ​​/ 35 מיקרוגרם / מ"ל) אל התבשיל ואז לחסן תרבויות על ידי לקיחת אגר תקעים (בעזרת פיפטה P1000) המכיל מושבת חיידקים יחיד pipetting לתוך המרק. מערבולת התרבויות נמרצות לאורר אותם ואז דגירה התרבויות בשעה 37 ° CO / N בלי לרעוד.
8. למחרת, למקם את התרבויות שייקרו 37 ° C ולנער ב ~ 225 סל"ד. לגדול התרבויות עד OD ₆₀₀ הוא כ 0.4 -0.6, אשר בדרך כלל ייקח בערך 4 - 6 שעות, תלוי צפיפות התאים הראשונית.
   הערה: זה ידרוש ניטור צפיפות תקופתי באמצעות קריאות spectrophotometric, ואת זה הוא קריטי לא לגדול תרבויות הרבה מעל 0.5 ODS. כתוצאה ריקה לקריאת spectrophotometric, ספין למטה 1 מיליליטר של חיידקים להשתמש במרק בהיר כפתרון לתלייה על הקיר.
9. לאחר OD הראוי ₆₀₀ מתקבל, מייד למקם את התרבויות על קרח במהירות לקרר אותם עד 10 מעלות צלזיוס. צג הטמפרטורה באמצעות מדחום מחה נקי עם EtOH 70%. לזרז את הקירור על ידי החלפה של צלוחיות במהירות תוך על הקרח, כמו זה יהיה להגביל התפתחות חיידקים נוספת לפני אינדוקציה חלבון רקומביננטי.
10. הוספת IPTG לריכוז סופי 1 מ"מ (~ 120 מ"ג / 500 תרבות מ"ל) ולאחר מכן ללחוץ על 80 סל"ד ב 14 מעלות צלזיוס במשך ~ 17 - 18 שעות. הטמפרטורה האידיאלית לזירוז חלבון כבר מצאו להיות 14 מעלות צלזיוס; הטובה ביותר להשיג זאת, להשתמש loc שייקר מים באמבטיה מקוררated בחדר קר קונבנציונאלי ידני לבדוק את הטמפרטורה של המים באמבטיה עם מדחום.
    הערה: לחלופין, להשתמש שייקרו מקורר אוויר / חממה, אם כי יש צורך לבדוק מה הגדרת טמפרטורה שנקבעת דיגיטלי תניב את הטמפרטורה הנוזלית הרצויה (מבחן זה על ידי דוגרי קיתון של מים עם מדחום בתוכו רועד ב 80 סל"ד במשך כמה שעות, כדי להתאים את הטמפרטורה הדיגיטלית הגדרה בהתאם עד 14 ° C הוא הגיע).
11. מניח את התרבויות על קרח לקרר אותם במהירות, כמו בשלב 3.9. קח aliquot קטן של חיידקים ולקחת OD ₆₀₀ קריאה; באופן אידיאלי, התרבויות תהיינה הוכפלו במהלך האינדוקציה כ -0.8 - 1.2 OD _600.
12. מעבירים את החיידקים 500 מ"ל צינורות צנטריפוגות ידני לאזן אותם באמצעות תרבית החיידקים כדי לאזן את המשקל בין צינורות. לאחר מאוזן, צנטריפוגות אותם 3,840 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. יוצק את המרק הבהיר ולהקפיא את pel החיידקיםמאפשר ב -80 ° C עד למועד טיהור חלבונים.

טיהור 4. אדם rG4R1

1. הפשרת lyse כדורי חיידקים.
   1. ההפשרה גלולה חיידקים 3 מ"ל של חיץ TN ב RT (חיץ TN מורכב 100 מ"מ טריס pH 7.5 ו -50 מ"מ NaCl). החזק את הבקבוקים ביד המערבולת להפשיר / resuspend גלול חיידקים. לאחר מופשר יחסית מושהית ומאוזנת, ולהביא את נפח של עד 5 מ"ל עם TN חיץ (השעיה נוספת ניתן להשיג באמצעות pipetting מעלה ומטה עם טפטפת 5 מ"ל).
      הערה: זה אופייני להפשיר / הכנה או 2 או 4 בקבוקים ביום הכנה, תלוי של רמת המשתמש של נוחות עם הליך הטיהור.
   2. ממיסים 20 מ"ג של ליזוזים ב 250 μL של H ₂ O (מחיר התרבות) ולהוסיף חיידקים resuspended. אפשר ליזוזים לעכל את החיידקים עבור ~ 5 - 10 דקות בעוד מתערבל הבקבוקים ביד.
      הערה: הצבע של susהפנסיה תתחיל להאיר מעט ככל שמתקדם העיכול, ואת השעיית תהיה יחסית שאינו צמיגה. אם התרבויות הם מגודלים מדי (כלומר הרבה יותר מאשר 1.2 OD _600), אז בכרומוזומי DNA חיידקי יכול לגרום צמיגות רצויות בשלב זה.
   3. הוסף 250 μL של מעכבי פרוטאז קוקטייל (PIC) ו aliquot אחד 10 μL של leupeptin. מערבבים היטב.
   4. מניחים על קרח ולהוסיף 10 מ"ל של חיץ קר TN ו -22 μL של BME. מעבירים צינור 50 מ"ל.
   5. Sonicate את החיידקים על קרח עם sonicator דיגיטלית המוגדרת משרעת 30%. Pulse ב -2 s ON ו- s OFF 2 דקות 1. חזור על sonication 3 פעמים, ומאפשר דגימות להתקרר על קרח דק 2 לפחות בין הצעדים sonication.
      הערה: מרובת תרבויות, sonicate כל אחד בתורו לפני חזרה על חזרות sonication. במהלך sonication, להיות זהיר כדי לשמור על קצה sonication שקוע מספיק את lysate חיידקי, אך לא לגעת הצדדי דואר של הצינור, כמו זה יהיה לייצר חום עודף.
   6. הוסף נפח שווה (15 מ"ל) של SSC 4x קר + 20 μL של BME + 50 μL של PIC + 1 aliquot של leupeptin ומערבבים.
   7. בצנטריפוגה השולחן מראש מקורר עד 4 ° C, צנטריפוגה lysates ב 2,300 XG במשך 20 דקות. מעבירים את supernatant טריים, צינורות טרום מקורר 50 מ"ל (1 צינור לכל תרבות גדולה להיות prepped).
2. כן חרוזי G4-מגנטי.
   1. קח 1 מ"ל של חרוז פאראמגנטיים streptavidin ההשעיה (SPB) (לכל 1 L התרבות) ולהעביר אותו צינור 1.5 מ"ל microcentrifuge. גלולה SPB עם מגנט ולשטוף 2x עם 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspend את SPB לרחוץ 200 μL של אותו פתרון ששימשה לשטיפת חרוזים.
   2. להוסיף אחד 3 OD aliquot של G4-דנ"א (G4 Z33-ביו המוכן בסעיף 1) על השעיית SPB ומערבב במהירות על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים. מניחים את הצינורות על הכתף וסיבוב ב RT למשך 30 דקות לפחות (עד 60 דקות).
   3. אָחוֹראה תקופה זו של סיבוב, לחסום את SPB הנכנס G4 על ידי הוספת 1 מ"ל של lactalbumin 0.4%, ולשמור על הקרח עד הצורך. לדלל את lactalbumin 0.4% ממלאי 4% lactalbumin באמצעות 1x טריס-גליצין.
      הערה: lactalbumin% המניות 4 (w / v) מוכן בתחילה על ידי פירוק ב 2 מ 'גליצין pH 7.5, בתוספת נוספת של 1x PIC ו אזיד הנתרן 0.05%.
3. לאגד היסטידין-tagged rG4R1 חרוזים קובלט (CB) (המשך משלב 4.1).
   1. הוסף 1 מ"ל של תרחיף CB (שווה ערך לנפח חרוז 0.5 מ"ל) על צינור אחד 50 מ"ל המכיל lysate חיידקי הבהיר. דגירה במשך 20 דקות ב RT על הכתף.
      הערה: נפח חרוז 0.5 מ"ל משמש לכל 1 ליטר של lysate הבהיר; למשל, אם שני 500 תרביות חיידקים מ"ל ערוכים, רק להוסיף CB אל הצינור 50 מ"ל המכיל lysate הבהיר מאחד תרבויות בשלב זה, כפי lysate מתרבות השני יהיו מחויבים באופן סדרתי עם אותו 0.5 מ"ל של CB ב stEP 4.3.3).
   2. ספין למטה CB ב 110 XG במשך 5 דקות בצנטריפוגה השולחן 4 ° C.. לשאוב את הנוזל בזהירות, ולהשאיר כמה מ"ל של נוזל כדי לא להפריע את CB pelleted. לשטוף עם 10 - 15 מ"ל של 4x SSC + BME (0.5 μL של BME / מ"ל ​​של 4x SSC) קר.
      הערה: לקבלת שוטף, לשפוך 10-15 מ"ל ישירות על גבי חרוזים קובלט pelleted במקום pipetting, כמו pipetting יגרום החרוזים להיתקע לחלק הפנימי של פיפטה וחלבון יאבדו.
   3. גלולה CB שוב באמצעות צנטריפוגה ואז לשפוך את lysate הבא הבהיר (30 מ"ל, המייצגים את התרבות חיידקי המושרה 2 ^nd גדול) על CB pelleted. דגירה במשך 20 דקות נוספות ב RT על הכתף ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 10-15 מ"ל של BME + 4x SSC. גלולה ב 110 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
   4. לאחר לשטוף את השני, לשאוב את הנוזל ולהשאיר כ -2 מ"ל של נוזל חרוזים / בתחתית של התחתית. מעבירים את CB חלבון הנכנס לצינור מראש מקורר 2 מ"ל ידיבאמצעות קצה פיפטה 1 מ"ל "רחב נשא".
      הערה: משתמשת סכין גילוח טרי לחתוך את הקצה של הקצה לפני העברה, כמו השימוש "רחב נישא" קצה פיפטה זה יקטין את ההפסד של חרוזי קובלט הנכנס חלבון.
   5. בקצרה בצנטריפוגה חרוזים בצינור מ"ל 2 במהירות גבוהה (~ 18,000 XG) microcentrifuge בבית 4 ° C (~ 5 - 10 שניות הוא כל מה שנדרש עבור pelleting מהירה). הוצא בעדינות וזורקים supernatant ידי pipetting, נזהרים שלא לאבד את CB כבול-חלבון.
4. Elute rG4R1 מ CB.
   1. דגירה CB ב 0.5 מ"ל של חיץ elution היסטידין (HEB) על הכתף במשך 5 דקות בחדר קר. שוב, בעת הוספת HEB, רק פיפטה 0.5 מ"ל על חרוזים (לחסל אובדן CB) ו resuspend את החרוזים על ידי צינור היפוך. HEB הוא 0.7 M L-היסטידין pH 6 (ה- pH מותאם באמצעות חומצה אצטית).
   2. צנטריפוגה ב 18,000 XG ב microcentrifuge 4 ° C. דקות 1. מעבירים את supernatantלצינור מראש מקורר 15 מ"ל. הוצא בעדינות ולהעביר את supernatant המכיל חלבון על ידי pipetting הזהיר, משאיר כמות קטנה של נוזל על גבי CB.
   3. חזור על שלבים 4.4.1 ו 4.4.2 עבור סכום כולל של 3 elutions HEB.
   4. Elute פעם עם 0.2 M EDTA pH 6.0; את הצבע של CB ישתנה מוורוד לבן כמו EDTA chelates קובלט.
   5. לאחר elution הרביעי והאחרון זה הועבר ל -15 הצינור מ"ל, פיפטה למאגר elution שיורית מן CB באמצעות טיפ ג'ל טעינת על קצה קצה פיפטה 1 מ"ל; ניתן לאסוף באמצעות תקיעת הקצה אל החלק התחתון של הצינור, חיץ elution חלבון המכיל שיורית.
5. לאגד rG4R1 כדי SPB הנכנס G4 ו elute אנזים רקומביננטי באופן תלוי ATP.
   1. הכן הצפת מיל 5x: 250 מ"מ טריס-אצטט pH 7.8, 250 מ"מ NaCl, 2.5 מ"מ MgCl _2, ו -50% גליצרול. הכן הצפת מיל 3x: 0.915 מ"ל של H ₂ O, 2 מ"ל של 5x הצפת מיל, 0.33 מ"ל של 0.4% lactalbumin (דiluted מ lactalbumin 4% עם 1x טריס-גליצין), 0.010 מ"ל של BME, 0.015 מ"ל של 1 M MgCl _2, 0.050 מ"ל של PIC, ו 0.010 מ"ל של leupeptin. שמור על הקרח.
      הערה: lactalbumin% המניות 4 (w / v) מוכן בתחילה על ידי פירוק ב 2 מ 'גליצין pH 7.5, בתוספת נוספת של 1x PIC ו אזיד הנתרן 0.05%.
   2. גלולה G4-SPB אל הצד של הצינור עם מגנט וזורקים supernatant (G4-SPB, כמו מוכן בשלב 4.2). הוסף 1 מ"ל של 3x מיל הצפת אל G4-SPB ו פיפטה לערבב.
   3. פיפטה 1 זה מ"ל של G4-SPB המרחפים חיץ מיל 3x לתוך הצינור 15 מ"ל המכיל ~ 2 מ"ל של המכילים חלבון HEB / EDTA (eluate משלב 4.4). דגירה במשך 15 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה מדי פעם כך החרוזים לא להתפשר.
   4. על קרח, גלולת G4-SPB הנכנס החלבון אל הצד של הצינור עם מגנט. כדי לשטוף, להוסיף 1 מ"ל של lactalbumin 4x SSC + 0.4% (+ 0.5 μL / מ"ל ​​BME) ו פיפטה כדי resuspend את החרוזים. חרוזים גלולים עם tהוא המגנט על הקרח. חזור על זה לשטוף עבור סכום כולל של 2 שוטפים.
      הערה: סבלנות נדרשת במהלך הליך הכביסה כדי להבטיח שכל של החרוזים המגנטיים כבר pelleted בין השוטף. הדבר נכון במיוחד בהתחשב צמיגות המוגבר של הפתרון בשל גליצרול הכלול מאגרי המיל.
   5. שטפו את 1x G4-SPB עם 1 מ"ל של הצפת מיל 3x.
   6. הכן חיץ elution (EB): 0.5 מ"ל של הצפת מיל 3x, 0.1 מ"ל של 0.1 מ 'ATP, ו -0.4 מ"ל של H ₂ O.
   7. טרום חמים 1 מיליליטר של EB ל -37 מעלות צלזיוס PCR צינורות המופצים ברחבי בלוק החימום של Cycler תרמית מוגדרת 37 ° C.
   8. גלולה G4-SPB עם המגנט על הקרח resuspend את החרוזים 100 μL של EB מחומם מראש. מיד להעביר את החרוזים לצינור מראש חימם PCR דגירה למשך 30 שניות על 37 מעלות צלזיוס.
   9. מיד להוסיף 12 μL של 5 M NaCl ו פיפטה למעלה ולמטה במרץ 20 - 30 פעמים. השילוב של מלח הגבוה ו- ATP הכלול EBמשמש elute rG4R1 מן-חרוזי G4.
      הערה: חשוב מאוד לצמצם את מספר הבועות הנוצרות במהלך תהליך pipetting, כבועות יכול לפגל החלבון.
   10. מייד גלולת G4-SPB עם מגנט ולהעביר את eluate המכיל חלבון לצינור PCR טרי על קרח (שכותרתו עם התאריך).
   11. חזור על elution והעברת כמתואר בשלבים 4.5.8-4.5.10; המוצר בסופו של תהליך זה הוא אפוא ~ 200 μL של EB מכיל מטוהרי rG4R1. מניחים בצד שני 7 aliquots μL (צינורות PCR שכותרתו עם התאריך המתאים) לשימוש assay הפעילות האנזימטית בקרת איכות כי יבדקו האם rG4R1 פעיל מאוד אכן טוהרו.
   12. אחסן את rG4R1 מטוהרים ב -80 ° C עד למועד של assay פעילות.

5. Assay פעילות בקרת איכות אנזימתי של מטוהרים rG4R1

1. עבור כל הכנת rG4R1 להיות assayed, להכין 300 μLשל חיץ assay resolvase (RAB), כאשר כל 30 μL מכיל 0.2 pmol של DNA G4 Z33 שכותרתו טמרה (מוכן בשלב 2); האיפור של RAB הוא כדלקמן: 0.1 מ"ל של הצפת מיל 3x, 0.01 מ"ל של 0.2 pmol / μL G4-Z33-TAM, 0.03 מ"ל של 0.1 מ 'ATP, ו 0.16 מ"ל של H ₂ O. ב רצועה של 6 PCR צינורות, פיפטה 40 μL של RAB לתוך הצינור הראשון ו -30 μL של RAB לתוך צינורות הנותרים (לשמור את הצינורות על קרח בשלב זה).
2. אחזור באחת מ -7 aliquots μL rG4R1 (משלב 4.5.11) ומניחים אותו על קרח. עם טפטפת P20 מוגדר 5 μL, פיפטה בעדינות מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב את rG4R1 ב aliquot ולהעביר 5 μL אל הצינור הראשון של רצועת 6 צינורות PCR (אחד המכיל 40 μL של RAB). לאחר מכן, לקבוע את פיפטה עד 10 μL ו סדרתי להעביר 10 μL אל צינורות הנותרים PCR המכיל RAB.
3. מיד דגירה ברצועה זו של צינורות PCR ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בתוך Cycler תרמית, ואחריו להחזיק 4 ° C..פתח את הצינורות בזמן שהם מוחזקים על 4 מעלות צלזיוס ומוסיף 2 μL של 0.5 M EDTA pH 8 צינור אחד (כדי לעצור את התגובה האנזימטית).
4. יוצקים ג'ל גליצרול 10% acrylamide / 1x TBE / 10%. לאחר הסרת המסרק, לשטוף את הבארות עם TBE 1x. הוסף 5 μL של פוליסכריד גבוהה המונית, הידרופילי (30% Ficoll ב H ₂ O) על צינור אחד והעומס 15 μL מהצינור כל (והעמסת בארות יכול שוב לצפות באמצעות קווי שליארן).
   1. כביקורת לניידות G4-DNA, להוסיף 4 μL של מסה גבוהה, פוליסכריד הידרופילי 20 μL RAB, והעומס 15 μL; כבקרה התיר monomeric Z33, חום 20 μL של RAB ב 98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, להוסיף 4 μL של מסה גבוהה, פוליסכריד הידרופילי, והעומס 15 μL.
5. הפעל את הג'ל על 120 וולט עבור 2 שעות עם TBE 1x כמו למאגר ריצה. תמונה הג'ל על תרמי multimodal עם יכולת הקרינה הדמיה באמצעות טמרה ספציפי מסננים (להלהיב עם לייזר ירוק 532 ננומטר ולהשתמש 58להקת 0 ננומטר לעבור 30 מסנן (580 BP 30)).
   הערה: תכשיר פעיל ביותר של rG4R1 יניב ברזולוציה מלאה של Z33 טמרה שכותרתו ב -3 הנתיבים הראשונים הועמסו על הג'ל, כפי שמוצג באיור 2.

6. איגום של Preps rG4R1 מאוד פעיל, aliquoting, ואחסון

הערה: שלב זה דורש 2 אנשים. מספר ודרישות האנזימטית של מבחני במורד הזרם כי rG4R1 מטוהרים ישמש יקבע כמה הכנות נדרשות לפני aliquoting. הכנה גדולה טיפוסית מורכבת וריכוז 8 תכשירים פעילים מאוד (ובכך באמצעות סך של 16 מושרה 500 תרביות חיידקי מיליליטר), אבל זה מספר שרירותי והוא ספציפי במעבדה.

1. חשבתי את הנפח הכולל של rG4R1 הפעיל, נקי במיוחד כי היא להיות aliquoted. בדרך כלל, 7 aliquots μL משמשים מבחני במורד הזרם. מלאו את הבלוק של cycl תרמיתאה המוגדר כ -4 מעלות צלזיוס עם צינורות הרצועה PCR (אלה יהיו aliquoted לתוך, כאופי המוצק של הגוש יזרז הסגירה המהירה של רצועות PCR).
2. תחזר את צינורות PCR המכילים rG4R1 הפעיל ביותר מ -80 ° C ובמהירות להפשיר את הצינורות ביד; כאשר כמות של קרח קטנה שנשארה בצינור, מניח את הצינורות על קרח. מערבב את כל ההכנות המופשרות במהירות לתוך צינור prechilled, 15 מ"ל ומערבב היטב, והקפד למזער בועות.
3. בעזרת פיפטה חוזר אוטומטי, לוותר על נפח aliquot הרצוי לתוך צינורות רצועת PCR מראש צונן Cycler התרמית. ברגע 1 - 2 רצועות הושלמו, יש לאדם השני לסגור את העפעפיים ולהעבירם ופלים 96-היטב כי הם מרחפים בחנקן נוזלי (הקפאה פלאש יש צורך לשמר הפעילות האנזימטית).
   הערה: אין ליטול יותר מאשר על 200 μL של rG4R1 לתוך קצה פיפטה אוטומטית בכל פעם, כדי לצמצם את הזמן כי האנזים הוא לא ב 4מעלות צלזיוס.
4. לאחר צינורות רצועת PCR prechilled Cycler התרמית מולאו עם aliquots קפוא כראוי, להעביר במהירות יותר מראש צונן צינורות PCR הרצועה מן הקרח כדי Cycler התרמית ולהמשיך aliquoting. המשך בדרך זו עד שארית האנזים כבר aliquoted, פלאש קפואים בחנקן נוזלי, והועבר קרח יבש. לבסוף, להעביר את aliquots ל -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

7. כימות ריכוז המטוהרים rG4R1

1. יוצקים% תקן 5 לערום / 12% בפתרון ג'ל acrylamide / SDS להפרדת חלבונים.
2. ההפשרה כ -50 μL של rG4R1 aliquoted, לשלב לתוך צינור אחד, ומערבבים היטב. מדוד את נפח המדויק עם טפטפת ולהוסיף כמות שווה של חיץ מדגם 2x Laemmli (65.8 mM Tris-HCl pH 6.8, 26.3% (w / v) גליצרול, 2.1% SDS, ו 0.02% bromophenol כחול) + BME (50 μL / 950 μL של חיץ 2x Laemmli). לפגל חלבון 98 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
3. הכן דילולים של סמני MW רחב-טווח במאגר מדגם 1x + BME כך כמויות החלבון הבאות ניתן הועמסו על ג'ל סטנדרטים: 31.3, 62.5, 125, 250, ו -500 ng.
   הערה: כל תקן חלבון הכלול סמני MW-מגוון הרחב נוכחת 0.1 מיקרוגרם / μL, למעט חלבון 50 kDa, אשר שוהים על 0.3 מיקרוגרם / μL. סמנים אלה לא צריך להיות-מפוגל חום.
4. הסר את המסרק מן הג'ל ולשטוף את הבארות עם חיץ ריצה 1x SDS / גליצין סטנדרטי. טען את המקבילה של 25 ו -12.5 μL של rG4R1 (המהווה 50 ו -25 μL של חלבון מפוגל), אם כי בהיקף האנזים האופטימלי לטעון צריך להיקבע על ידי המשתמש, כמו הריכוז של ההכנות האנזימטית תשתנה (למשל, 35 μL הועמס על ג'ל באיור 3). טען את סטנדרטי החלבון מוכנים בשלב 7.3. ודא כי טפטפות מכוילים כראוי, ולוודא לדייק ככל possible עם טכניקת pipetting כדי להבטיח כימות מדויק.
5. הפעל את הג'ל על 120 V עד בחזית לצבוע חצו בערך 2/3 של ג'ל (כדי להבטיח הפרדה נאותה של חלבונים שמרכיבים את סמנים רחב-טווח MW).
6. הסר את הג'ל ולסלק את החלק של הג'ל כי לא מכיל חלבון על ידי חיתוך אותו עם סכין גילוח. מניחים את הג'ל בצלחת תבשיל זכוכית או כלי קיבול שווה ערך. הכתם ג'ל עם צבע Coomassie (50 מ"ג של Coomassie R-250 ל -100 מ"ל של 50:10:40 v / מתנול v: חומצה אצטית: H ₂ O כי סוננה דרך משפך מסנן נייר) O / N ב RT על סט שייקר מסלולית כדי להבטיח תסיסה נאותה של הג'ל.
7. דה-להכתים את הג'ל עם 30:10:60 v / v מתנול: חומצה אצטית: H ₂ O באמצעות מגולגלים, נטולת מוך ממחטת נייר כדי לזרז destaining. שנה את הפתרון destaining לפי הצורך. המשך destaining עד שהרקע הוא נמוך מספיק כדי להמחיש סטנדרטי rG4R1 וחלבון; ג'ל טיפוסית זובשלב מוצג באיור 3.
8. מניחים את הג'ל destained בין מגן גיליון ולסרוק את הג'ל על ≥300 רזולוציה. פתח את התמונה הסרוקה בתכנית תוכנת ניתוח תמונה (כגון פוג'י Multiguage או שווה ערך) ולהכין עקומות סטנדרטיות מן סטנדרטי החלבון מתאים 75, 100, ו -150 kDa (העקומות מייצגות כמויות גרמו לעומת קריאות densitometric). הקפד לחסר את הרקע בנתיב אחד להיות לכמת בתהליך קבלת ערכים densitometric.
9. בהנחה שסכום היקף rG4R1 שהועמס על הג'ל מכיל כמות של חלבון זה נמצא בטווח ליניארי של עקומות סטנדרטיות אלה, בסך גרם חלבון לכל מיקרוליטר של rG4R1 נטען יכולים להקיש מזה.
10. המרת הסכום גרם אקסטרפולציה של rG4R1 לתוך כמות טוחנת באמצעות המשקל המולקולרי של G4R1, שהוא 120,000 g / mol.
    הערה: עבור כל ג'ל, שלושה ערכים אקסטרפולציה יהיושנוצר (אחד עבור כל אחד סמנים חלבוניים שלושה השתמשו כדי ליצור את עקומות סטנדרטיות: 75, 100, ו -150 KDA). הפעל שני ג'לים נוספים כתם ולכמת אותם על ידי חזרה על שלבים 7.1 - 7.10. עם התוצאות של כימות עבור הג'ל הראשון, המשתמש יוכל לאמוד כמה rG4R1 יש לטעון על ג'לים יותר כדי להניב סכום נמצא בטווח ליניארי של סטנדרטי החלבון. בסך הכל, לחיץ תשעה ערכים המייצגים את ריכוז מאוד פעיל, מטוהרים rG4R1. ממוצע ערכים אלה לתת את ריכוז rG4R1 יצווה ספציפי הסופי, שהוא בדרך כלל בטווח של 20-100 ננומטר. חשב את סטיית התקן מערכים אלה (n = 9).

תוצאות

פרוטוקול זה (איור 1) מניב שגרתי כמעט טהור, rG4R1 פעיל קטליטית. כצעד של הפעילות האנזימטית, הוא ציין בדרך כלל כי 50% של 0.2 pmol של G4-DNA tetramolecular שכותרתו טמרה מומר מונומרים בתוך 0.2 - מגוון μL 0.013 של rG4R1, כפי assayed ידי assay פעילות G4 שתוארו לעיל (איור 2). Coomassie המכתים של מטוה?...

Discussion

פרוטוקול זה מייצג ערכת ביטוי, טיהור יעילה ביותר, וכימות עבור הבידוד של מוצר גן DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, המכונה גם RHAU ו DHX36) (איור 1). פרוטוקול זה מנצל שני צעדי טיהור: טיהור זיקת התג שלו על חרוזי זיקת קובלט וטיהור האנזימטית על חרוזי G4-DNA מצומדות. השלב האחרון הוא ייחודי בכך ש...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (from chicken egg white)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl pH=8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7	Universal Scientific Supply Co.	1966	or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8			For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8			For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	or From standard source
70% Ethanol			From standard source
Magnesium chloride (1 M solution)	Life Technologies	AM9530G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptin hemisulfate	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidin paramagnetic beads	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH=8	Universal Scientific Supply Co.	0718	or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6	Universal Scientific Supply Co.		From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)	Sigma-Aldrich	L5385
Cobalt metal affinity beads	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate	Universal Scientific Supply Co.	1667	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	or From standard source
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV lamp			Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)			Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge			Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath			For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria			For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria			For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer			capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer			From standard source
PCR strip tubes			From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene)			From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)			From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene)	Thermo Scientific	3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes			From standard source
Gel-loading tips			From standard source
Automatic repeating pipette			For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler			From standard source
Liquid Nitrogen			From standard source
Dry ice			From standard source
Laemlli sample buffer	Biorad	161-0737
Apparatus for running large slab gels	Biorad		We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet	Life Technologies	12301D	We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades			From standard source
Filter paper and funnel			From standard source
Glass casserole dish			From standard source
Orbital shaker			From standard source
Kimwipes			From standard source
Clear sheet protectors			From standard source
Scanner and associated TWAIN software			From standard source
Image analysis software			Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel			Or equivalent