Une approche du G-quadruplex ADN-affinité pour la purification de l'activité enzymatique G4 Resolvase1

Résumé

G4 Resolvase1 se lie à G-quadruplex (G4) structures avec le plus serré affinité rapportée pour une protéine G4 contraignante et représente la majorité de l'activité de déroulage G4-ADN dans les cellules HeLa. Nous décrivons un nouveau protocole qui tire parti de l'affinité et de l'activité ATP-dépendante dévidage de G4-Resolvase1 pour purifier spécifiquement G4R1 recombinante catalytiquement active.

Résumé

Ordre supérieur des structures d'acides nucléiques appelés G-quadruplex (G4s, structures G4) peuvent se former dans les régions riches en guanine de l'ADN et l'ARN et sont très stables thermiquement. Il y a> 375.000 putatifs séquences G4 formation dans le génome humain, et ils sont enrichis dans les régions de promoteurs, régions non traduites (UTR), et dans la répétition télomérique. En raison du potentiel de ces structures affectent les processus cellulaires tels que la réplication et la transcription, la cellule a évolué enzymes pour les gérer. Une telle enzyme est une résolvase G4 (G4R1), qui a été co-biochimiquement caractérisée par notre laboratoire et Nagamine et al. et a trouvé à se lier très étroitement à la fois G4-ADN et G4-ARN (K _d dans la gamme basse pM). G4R1 est la source de la majeure partie de l'activité de G4 à résolution dans les lysats cellulaires HeLa et a depuis été impliquée pour jouer un rôle dans le métabolisme du télomère, le développement de la lymphe, la transcription des gènes, de l'hématopoïèse et de la surveillance immunitaire. La capacité d'efsamment exprimer et purifier catalytiquement active G4R1 est d'une importance pour les laboratoires intéressés à acquérir un éclairage supplémentaire sur l'interaction cinétique des structures G4 et enzymes G4-résoudre. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour la purification de recombinant G4R1 (rG4R1). Le mode opératoire décrit comprend la traditionnelle purification par affinité d'une histidine enzyme C-terminale exprimée dans des bactéries de codon optimisé pour l'homme avec l'utilisation de la capacité de rG4R1 à se lier et se détendre G4-ADN pour purifier une enzyme hautement actif dans une ATP- étape d'élution dépendante. Le protocole comprend en outre une étape de contrôle de qualité, où l'activité enzymatique de rG4R1 est mesurée en examinant la capacité de l'enzyme purifiée pour dérouler l'ADN-G4. Un procédé est également décrit qui permet la quantification de rG4R1 purifié. adaptations alternatives de ce protocole sont discutées.

Introduction

structures G4 sont des structures secondaires d'acides nucléiques très stables qui se forment dans les régions riches en guanine de l'ADN et de l'ARN. Structures G4 sont stabilisées par des interactions Hoogsteen-liaison et coordonner la liaison au sein de la cavité centrale avec des cations monovalents (ie. K ⁺ et Na ⁺⁾ qui contribuent de manière significative à la stabilité thermique remarquable des structures G4 ^{1, 2.} Des études précoces de bioinformatique ont suggéré que le génome humain contient> 375.000 "motifs G4 formation potentiels" ^{3, 4.} Les estimations des études plus récentes indiquent que le nombre de motifs G4 est plus élevé par un facteur de ^{2 à 5 mai,} tandis qu'une autre étude prévoit 716,310 séquences G4 formant potentiels distincts dans le génome humain ^6. G4-formation de séquences sont évolutivement conservée et non dispersé de façon aléatoire dansle génome. Motifs G4 sont enrichis dans les régions codantes de gènes, et vers le haut de 40% de tous les promoteurs de gènes contiennent G4 motifs ^7. Chose intéressante, le degré d'enrichissement des motifs G4 dans un gène a été démontrée pour suggérer la fonction du gène. Par exemple, les proto-oncogènes et les gènes impliqués dans le développement ont significativement plus enrichissement des structures G4 que les gènes suppresseurs de tumeur ^{8, 9.}

Avec stabilités thermiques élevées, une présence presque omniprésente dans tout le génome, et le potentiel d'affecter de manière significative les principaux processus cellulaires, il est surprenant de constater que la cellule a évolué enzymes pour gérer ces structures. Une telle enzyme est G4 Resolvase1 (G4R1; également appelé Rhau et DHX36), que nous caractérisons comme la source de la majorité des activités de résoudre G4-ADN tétramoléculaire dans (HeLa) des cellules humaines ^10. Depuis lors, il a été montré that G4R1 étroitement lie et catalytiquement G4-ADN déroule tétramoléculaire et unimoléculaire et G4-ARN avec les plus serrés KD rapportés pour une protéine G4 de liaison ^{11, 12, 13.} En outre, l'activité de G4-résolution des G4R1 a été impliquée dans un large éventail de processus biochimiques et cellulaires, y compris télomère / télomérase biologie ^{11, 14, 15, 16,} de la transcription et de l' épissage ^{17, 18, 19, 20,} le développement ^21, de l' hématopoïèse ²¹ et immunitaire régulation ^{22, 23.} Avec une prépondérance de séquences G4 spécifiquement situé dans le génome et la diversité cellulaire processus que G4R1 a récemment été impliqué d'être impliqué, la capacité d'exprimer et efficacement purifier très actif rG4R1 sera de la plus haute importance pour élucider les mécanismes biochimiques et les comportements de cette protéine.

Ici, nous démontrons une expression nouvelle et système de purification (Figure 1) qui tire profit de l'activité dépendant de l' ATP G4-résolution des rG4R1 pour isoler efficacement enzyme active. Ce système pourrait être adapté pour purifier d'autres enzymes d'acide nucléique dépendant de l'ATP pour lequel le produit de la réaction enzymatique est plus un substrat pour la liaison, comme cela est le cas pour G4R1.

Protocole

1. Préparation des structures G4-ADN à utiliser pour la Purification de rG4R1 (Formation de biotinylé G4-ADN G-quadruplex)

1. Commandez l'oligomère suivant l'ADN, appelé Z33-Bio, à 1 umole échelle: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotine 3'. Faire en sorte que la fraction biotine est à l'extrémité 3 'de l'oligomère.
2. Préparer un tampon 10x G4: 450 mM de Tris-HCl pH 8, EDTA 25 mM et du NaCl 2500 mM.
3. Remettre en suspension l'oligomère Z33 dans 250 ul d'eau (de sorte que la concentration en oligomère est d'environ 2,5 mM). Ajouter 25 pi de 10x tampon G4 et mélanger. Incuber l'oligomère à 50 ° C pendant ~ 48 h.
4. Brièvement centrifuger le tube pour recueillir la condensation (~ 1000 xg, 10 s). Ajouter ~ 50 pi d'une masse élevée, polysaccharide hydrophile (30% Ficoll en H ₂ O) et mélanger. Verser un gel TBE à 10% d'acrylamide / 1X / 10% de glycérol (dimensions de gel: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Une fois que le gel est polymérisé, laver les puits avec 1x TBE et la chargel'oligomère formé Z33-Bio uniformément sur la majeure partie du gel (échantillon voie de chargement peut être visualisé avec des lignes Schlieren).
   1. Dans une voie, à la fin du gel, charger une petite fraction de l'oligomère qui a été chauffé à 98 ° C pendant 10 minutes (ce qui servira de contrôle non structuré), ainsi qu'une petite quantité de gel colorant de charge dans un autre la voie à suivre dans quelle mesure le gel a été exécuté.
5. Utilisez 1x TBE comme tampon de gel en cours d'exécution et exécuter le gel à 120 V jusqu'à ce que le front de colorant a traversé au moins 1/3 du gel.
6. Placez une plaque de chromatographie sur couche mince avec son côté rugueux face vers le haut dans un protecteur de feuille (ou couvrir d'une pellicule plastique). Enlever une des plaques de verre et de transférer du gel vers la surface du protecteur de la feuille. Éteignez les lumières et les ombres aériennes UV gel (longue longueur d'onde: 365 nm). Utilisez une lame de rasoir fraîche et découper la bande G-quadruplex-Z33-Bio, qui sera considéré comme en cours d'exécution plus haut dans le gel (ayant une mobilité plus lente) par rapport à la masse fonduecommande ed.
7. Placez la tranche de gel contenant le G4-ADN formé dans un tube de 50 ml et ajoutez juste assez tampon de trempage pour couvrir la tranche de gel (tampon absorbant est composé de 1/3 du volume 10x TBE, l'acétate de sodium saturé 1/3 de volume, et 1/3 le volume H ₂ O). Placer le tube dans un incubateur à 37 ° C (nonhumidified) et laisser incuber O / N.
8. Transférer la solution dans un tube de 15 ml et ajouter 1/10 de volume de glycogène (glycogène stock à 20 mg / ml dans 10 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 2,5 mM pH 8, et de l'azoture de sodium à 0,05%) et ~ 1,2x isopropanol .
   NOTE: L'azoture de sodium est très toxique, donc à utiliser avec précaution!
   1. Mélanger et placer le tube à -20 ° C pendant au moins 2 h. Faire tourner le tube à 2700 x g dans une centrifugeuse de table refroidie à 4 ° C pendant 12 min. Décanter la solution de l'ADN-G4 granulée avec douceur. Laver le culot 3 fois avec 70% EtOH + NaCl 50 mM (le sel dans le lavage est essentiel pour la stabilité du G4). Wick l'excès de liquide avec du papier de soie non pelucheux.
9. Endroitle culot lavé dans le réfrigérateur pendant au moins 2 h pour hydrater le culot et laisser pour faciliter la remise en suspension. Remettre en suspension le culot dans 50 pl de tampon TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 50 mM et 0,05 mM d'EDTA, pH 8).
10. Introduire 5 pl de cet ADN de G-quadruplex formé dans 495 ul de H ₂ O et à quantifier à l'aide d' un spectrophotomètre qui permet au coefficient d'extinction à déterminer en entrant dans la composition nucléotidique de l'oligomère (le coefficient d'extinction de l'oligomère Z33 ADN avec composition de base A = 8, C = 3, G = 15 et T = 7 est 341946 L / mol / cm). Entrez le facteur de dilution 25 (pas 100), le G-quadruplex formé se compose de 4 brins d'ADN.
11. Aliquoter l'équivalent en volume de 3 DO (DO ₂₆₀ unités) par tube et conserver à -20 ° C; par exemple, si les 5 ul qui a été ajouté aux 495 pi de H ₂ O donne une DO ₂₆₀ de lecture 3, puis de préparer des aliquotes de 5 ul.

2. Préparation des structures G4-ADN pour être utilisé dans une activité enzymatique de dosage de rG4R1 (Formation de TAMRA marqué G4-ADN)

1. Commandez l'oligomère d'ADN suivant, appelé Z33-TAM, à 1 umole échelle: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Assurez-vous que la partie TAMRA est à l'extrémité de l'oligomère 5.
2. Suivre la même procédure que celle décrite dans la section 1 pour la formation du G-quadruplex, sauf que les rayons ultraviolets (UV) shadowing est pas nécessaire parce que la tétraméthylrhodamine (TAMRA) marqué au G-quadruplex sera facilement visible à l'oeil nu. Encore une fois, assurez-vous d'inclure un contrôle fondu sur le gel.
3. Après avoir pris une lecture de spectrophotomètre de l'ADN G-quadruplex TAMRA marqué, comme dans l'étape 1, diluer le G-quadruplex formé à 0,2 pmol / ul avec un tampon TNE. Enfin, ajouter du glycérol à une concentration finale de 10% et conserver à -20 ° C.

3. Transformer (DE3) pLysS compétentes avec PTRiEx4-DHX36 (plasmide codant G4R1 humain) et de grandir / Provoquer Grandes Cultures bactériennes

1. Obtenir le plasmide TriEx4-DHX36.
2. Aliquoter les bactéries dans 20 aliquotes pi et les stocker à -80 ° C. Aliquoter le milieu SOC (2% tryptone, 0,5% d' extrait de levure, NaCl 10 mM, 2,5 mM de KCl, 10 mM de _MgCl2, mM MgSO ₄ 10, et 20 mM de glucose) en 80 aliquotes uL et conserver à -80 ° C.
3. Préparer carbénicilline (CARB) / chloramphénicol (CAM) des plaques d'agar-LB. Concentrations mères de CARB et CAM sont 50 mg / ml dans H ₂ O et 35 mg / mL dans 70% EtOH, respectivement, et ceux - ci sont 1,000x concentrés; ainsi, les concentrations finales dans les plaques de sélection de gélose LB sont de 50 pg / ml et 35 pg / ml, respectivement.
4. Placer 1 aliquote de bactéries sur de la glace et placez 1 aliquote de milieu SOC à TA. Ajouter 1 pg de pTriEx4-DHX36 plasmidique aux bactéries et agiter doucement avec la pointe de la pipette pour mélanger. Incuber sur la glace pendant encore 5 min, puis un choc thermique à 42 & #176; C pendant 30 s. Placer sur la glace pendant 2 min et ajoutez le milieu SOC.
5. Plaquer les bactéries transformées sur des plaques de sélection préchauffés (typiquement, une plaque un petit volume, par exemple 5 - 10 pi, pour assurer la densité des colonies faible, de sorte que les colonies simples peuvent être facilement inoculé dans de grandes cultures) et incuber à 37 ° CO / N.
6. Préparer Terrific Broth selon les instructions du fabricant ^24. Faire 500 mL par grand flacon (assurez-vous d'ajouter du glycérol) et autoclave sur un cycle court de liquide.
7. Ajouter CARB / CAM (50 pg / ml / 35 pg / ml) du bouillon, puis inoculer des cultures en prenant des bouchons de gélose (à l'aide d'une pipette P1000) contenant une seule colonie bactérienne et de pipetage dans le bouillon. Agiter les cultures vigoureusement pour les aérer et puis incuber les cultures à 37 ° CO / N sans agitation.
8. Le lendemain, placez les cultures dans un shaker C 37 ° et agiter à ~ 225 rpm. Cultiver les cultures jusqu'à ce que la DO ₆₀₀ est d' environ 0,4 -0,6, ce qui prend généralement environ 4 à 6 heures, en fonction de la densité cellulaire initiale.
   NOTE: Cela nécessite une surveillance de densité périodique par des lectures spectrophotométriques, et il est essentiel de ne pas pousser les cultures à bien au- dessus de 0,5 DO. En blanc pour les lectures spectrophotométriques, centrifuger 1 ml de bactéries et d'utiliser le bouillon clarifié comme la solution de suppression.
9. Une fois le bon OD ₆₀₀ est obtenue, placer immédiatement les cultures sur la glace et refroidir rapidement les 10 ° C. Surveiller la température à l'aide d'un thermomètre nettoyé avec 70% EtOH. Accélérer le refroidissement en faisant tourner rapidement les flacons tandis que sur la glace, ce qui limite la croissance bactérienne avant l'induction de protéines recombinantes.
10. Ajouter IPTG à une concentration finale mM 1 (~ 120 mg / culture de 500 ml), puis serrer à 80 tours par minute à 14 ° C pendant environ 17 - 18 h. La température idéale pour l'induction de protéine a été trouvée être de 14 ° C; pour mieux atteindre cet objectif, utiliser un bain-marie agitateur loc refroidiATED dans une chambre froide classique et vérifier manuellement la température du bain d'eau avec un thermomètre.
    REMARQUE: Vous pouvez également utiliser un refroidissement par air agitateur / incubateur, mais il est nécessaire de tester ce réglage de la température numérique réglée donnera la température du liquide désiré (test ce en incubant un flacon d'eau avec un thermomètre en elle et en agitant à 80 tours par minute pendant quelques heures, en ajustant le réglage en conséquence jusqu'à 14 ° C de température numérique est atteinte).
11. Placez les cultures sur la glace et les refroidir rapidement, comme dans l'étape 3.9. Prenez une petite aliquote de bactéries et de prendre une _DO600 lecture; idéalement, les cultures auront doublé au cours de l' induction à environ 0,8 à 1,2 OD _600.
12. Transférer les bactéries à 500 tubes à centrifuger mL et les équilibrer manuellement à l'aide de la culture bactérienne pour égaliser le poids entre les tubes. Une fois équilibrée, centrifuger les à 3840 xg pendant 20 min à 4 ° C. Verser le bouillon clarifié et geler la pel bactériennelaisse à -80 ° C jusqu'au moment de la purification des protéines.

4. Purification de l'homme rG4R1

1. Décongeler et lyser culots bactériens.
   1. Décongeler le culot bactérien dans 3 ml d'un tampon TN à la température ambiante (tampon TN est constitué de 100 mM de Tris pH 7,5 et NaCl 50 mM). Tenir les bouteilles à la main et agiter pour dégeler / resuspendre le culot bactérien. Une fois décongelé et relativement suspendu uniformément, porter le volume à 5 ml avec un tampon TN (suspension supplémentaire peut être accompli par l'intermédiaire d'pipetant avec une pipette mL 5).
      NOTE: Il est typique pour dégeler / prep 2 ou 4 bouteilles sur le jour de la préparation, selon le niveau de confort de l'utilisateur avec la procédure de purification.
   2. Dissoudre 20 mg de lysozyme dans 250 ul de H ₂ O (par culture) et ajouter aux bactéries remises en suspension. Laisser le lysozyme pour digérer les bactéries pendant environ 5 - 10 min en agitant les bouteilles à la main.
      NOTE: La couleur de la suspension commencera à alléger légèrement la digestion se poursuit, et la suspension sera relativement non visqueux. Si les cultures sont trop envahis (c. -à beaucoup plus grande que 1,2 OD _600), puis l' ADN chromosomique bactérienne peut causer la viscosité indésirable à ce stade.
   3. Ajouter 250 ul de cocktail inhibiteur de protease (PIC) et une aliquote de 10 pi de leupeptine. Bien mélanger.
   4. Placer sur la glace et ajouter 10 ml de tampon TN froid et 22 pi de BME. Transférer dans un tube de 50 ml.
   5. Soniquer les bactéries sur la glace avec un sonicateur numérique fixé à 30% d'amplitude. Pulse à 2 s ON et 2 s OFF pendant 1 min. Répéter le traitement par ultrasons 3 fois, ce qui permet de refroidir les échantillons sur de la glace pendant au moins 2 minutes entre les étapes de sonication.
      NOTE: Avec de multiples cultures, sonication chacun à son tour avant de répéter les itérations de sonication. Au cours de sonication, faire attention à garder la pointe de sonication suffisamment immergé dans le lysat bactérien, mais ne pas toucher thcôtés e du tube, car cela va générer de la chaleur en excès.
   6. Ajouter un volume égal (15 ml) de froid 4x SSC + 20 pl de BME + 50 pi de PIC + 1 aliquote de leupeptine et mélanger.
   7. Dans une centrifugeuse de table pré-refroidi à 4 ° C, centrifuger les lysats à 2300 xg pendant 20 min. Transférer le surnageant dans des tubes frais, pré-refroidi 50 ml (1 tube par grande culture étant préparée).
2. Préparer des perles de G4-magnétique.
   1. Prendre 1 ml de streptavidine paramagnétique bourrelet (SPB) suspension (par 1 L culture) et le transférer dans un tube à centrifuger de 1,5 ml. Pastiller le SPB avec un aimant et laver 2 fois avec 2 x SSC + EDTA 5 mM à pH 8. Remettre en suspension le SPB lavé dans 200 pl de la même solution utilisée pour le lavage des perles.
   2. Ajouter un 3 OD aliquote de G4-ADN (Z33-Bio G4 préparé à la section 1) à la suspension SPB et mélanger rapidement par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Placer les tubes dans un dispositif de rotation et tournent à la température ambiante pendant au moins 30 minutes (jusqu'à 60 minutes).
   3. à l'arrièreer cette période de rotation, bloquer le SPB G4 lié en ajoutant 1 mL de 0,4% lactalbumine, et de garder sur la glace jusqu'à ce que nécessaire. Diluer la lactalbumine 0,4% par rapport à la lactalbumine stock 4% en utilisant 1x Tris-glycine.
      NOTE: Le stock 4% lactalbumine (p / v) est d' abord préparé par dissolution dans 2 M de glycine , pH 7,5, avec l'addition supplémentaire de 1 x PIC et de l' azoture de sodium à 0,05%.
3. Bind histidine rG4R1 à des billes de cobalt (CB) (suite de l'étape 4.1).
   1. Ajouter 1 mL de suspension épaisse CB (ce qui équivaut à un volume de 0,5 ml de billes) à chaque tube contenant 50 ml de lysat bactérien clarifié. Incuber pendant 20 min à température ambiante sur un agitateur.
      REMARQUE: le volume de perles de 0,5 mL est utilisé par 1 litre de lysat clarifié; par exemple, si deux 500 cultures bactériennes ml sont préparées, seulement ajouter CB au tube 50 ml contenant lysat clarifié de l' une des cultures à ce point, comme lysat à partir de la seconde culture sera en série lié avec le même 0,5 ml de CB à step 4.3.3).
   2. Isoler CB à 110 xg pendant 5 min dans un 4 ° C table centrifugeuse. Aspirer le liquide avec soin, et laisser quelques ml de liquide de manière à ne pas perturber le CB pastillé. Laver avec 10 - 15 ml de froid 4x SSC + BME (0,5 pi de BME / ml de 4x SSC).
      NOTE: Pour les lavages, verser le 10-15 ml directement sur les billes sédimentées de cobalt au lieu de pipetage, comme le pipetage provoquera les billes de se coincer à l'intérieur de la pipette et la protéine sera perdue.
   3. Pellet la CB à nouveau par centrifugation, puis verser la prochaine lysat clarifié (30 ml, ce qui représente la culture bactérienne 2 ^e grande induite) sur la CB pastillé. Incuber pendant encore 20 min à température ambiante sur le rotateur puis laver deux fois avec 10-15 ml de 4x SSC + BME. Pellet à 110 g pendant 5 min à 4 ° C.
   4. Après le second lavage, aspirer le liquide et laisser environ 2 ml de billes / liquide au fond du tube. Transférer le CB lié à une protéine dans un tube pré-refroidie de 2 ml paren utilisant un "grand trou" pointe de la pipette 1 mL.
      REMARQUE: Utilisez une lame de rasoir propre pour couper l'extrémité de la pointe avant le transfert, que l'utilisation de cette pointe de la pipette "grand trou" permettra de réduire la perte de billes de protéine liée cobalt.
   5. Centrifuger brièvement les perles dans le tube 2 mL à grande vitesse (~ 18.000 xg) dans une microcentrifugeuse à 4 ° C (~ 5 - 10 s est tout ce qui est nécessaire pour la granulation rapide). Retirez délicatement et jeter le surnageant par pipetage, en faisant attention à ne pas perdre la CB lié à une protéine.
4. Eluer rG4R1 de CB.
   1. Incuber le disjoncteur dans 0,5 ml de tampon d'histidine d'élution (HEB) sur un dispositif de rotation pendant 5 min dans une chambre froide. Encore une fois, lors de l'ajout HEB, il suffit de les introduire à la pipette 0,5 ml sur les billes (pour éliminer les pertes de CB) et remettre en suspension les billes en inversant le tube. HEB est de 0,7 M de L-histidine à pH 6 (dont le pH est ajusté en utilisant de l'acide acétique).
   2. Centrifuger à 18 000 x g dans une microcentrifugeuse C à 4 ° C pendant 1 min. Transférer le surnageantun pré-refroidi 15 ml tube. Retirez délicatement et transférer le surnageant contenant des protéines par pipetage prudent, laissant une petite quantité de liquide sur le dessus de la CB.
   3. Répétez les étapes 4.4.1 et 4.4.2 pour un total de 3 élutions HEB.
   4. Eluer une fois avec EDTA 0,2 M pH 6,0; la couleur de la CB va changer du rose au blanc comme l'EDTA chélate le cobalt.
   5. Après cette quatrième et dernière élution a été transférée au tube de 15 ml, pipette le tampon d'élution résiduel de la CB à l'aide d'une pointe de gel de chargement à l'extrémité d'une pointe 1 ml de pipette; en plongeant l'extrémité du fond du tube, un tampon d'élution contenant la protéine résiduelle peut être recueillie.
5. Liez rG4R1 à G4 lié SPB et éluer enzyme recombinante d'une manière dépendante de l'ATP.
   1. Res préparer 5x tampon: 250 mM de Tris-acétate , pH 7,8, 250 mM de NaCl, 2,5 mM de _MgCl2 et 50% de glycérol. Préparer 3x Res Tampon: 0,915 ml de H ₂ O, 2 ml de tampon 5x Res, 0,33 ml de 0,4% de lactalbumine (diluted de 4% lactalbumine avec 1x Tris-glycine), 0,010 ml de BME, 0,015 ml de 1 M MgCl _2, 0,050 ml de PIC, et 0,010 ml de leupeptine. Gardez sur la glace.
      NOTE: Le stock 4% lactalbumine (p / v) est d' abord préparé par dissolution dans 2 M de glycine , pH 7,5, avec l'addition supplémentaire de 1 x PIC et de l' azoture de sodium à 0,05%.
   2. Pellet G4 SPB sur le côté du tube avec un aimant et jeter le surnageant (G4 SPB, tel que préparé à l'étape 4.2). Ajouter 1 ml de 3x Res Buffer pour le G4-SPB et la pipette pour mélanger.
   3. Pipeter ce 1 ml de G4-SPB suspension dans un tampon 3x Res dans le tube 15 ml contenant ~ 2 mL de HEB / EDTA contenant des protéines (éluat de l'étape 4.4). Incuber pendant 15 min dans un bain d'eau à 37 ° avec agitation occasionnelle de sorte que les perles ne se déposent pas.
   4. Sur de la glace, d'une pastille pour la protéine liée G4 SPB sur le côté du tube avec un aimant. Pour laver, ajouter 1 ml de 4x SSC + 0,4% lactalbumine (+ 0,5 pl / BME mL) et la pipette pour remettre en suspension les perles. perles à pellets avec til aimant sur la glace. Répéter ce lavage pour un total de 2 lavages.
      REMARQUE: La patience est nécessaire lors de la procédure de lavage afin de s'assurer que toutes les billes magnétiques ont été granulée entre les lavages. Cela est particulièrement vrai étant donné la viscosité accrue de la solution due à la glycérine contenue dans les tampons Res.
   5. Laver le G4-SPB 1x avec 1 ml de 3x Res Buffer.
   6. Préparer un tampon d'élution (EB): 0,5 ml de 3 x tampon Res, 0,1 ml de 0,1 M d' ATP, et 0,4 ml de H ₂ O.
   7. Préchauffer 1 mL de EB à 37 ° C dans des tubes PCR distribués à travers le bloc de chauffage d'un cycleur thermique réglé à 37 ° C.
   8. Pellet G4 SPB avec l'aimant sur la glace et remettre en suspension les billes dans 100 ul d'EB préchauffée. Transférer immédiatement les perles à un tube PCR préchauffée et incuber pendant 30 s à 37 ° C.
   9. Promptement ajouter 12 pi de 5 M de NaCl et la pipette de haut en bas vigoureusement 20 - 30 fois. La combinaison de la haute teneur en sel et de l'ATP contenue dans le EBsert à éluer rG4R1 des G4-billes.
      NOTE: Il est extrêmement important de minimiser le nombre de bulles formées au cours du processus de pipetage, sous forme de bulles peuvent dénaturer la protéine.
   10. sédimenter immédiatement le G4-SPB avec un aimant et transférer l'éluat contenant des protéines à un tube de PCR frais sur la glace (marqué avec la date).
   11. Répéter l'élution et le transfert décrit dans les étapes 4.5.8-4.5.10; le produit de ce procédé final est donc ~ 200 ul d'EB purifié contenant rG4R1. Mettez de côté deux 7 aliquotes (dans des tubes de PCR marqués avec la date appropriée) pour une utilisation dans le contrôle de qualité dosage de l'activité enzymatique qui permettra de tester si rG4R1 très actif a en effet été purifié.
   12. Stocker la rG4R1 purifiée à -80 ° C jusqu'au moment du dosage de l'activité.

5. Contrôle de la Qualité de dosage de l'activité enzymatique purifiée rG4R1

1. Pour chaque préparation de rG4R1 à tester, préparer 300 ulde tampon d'essai résolvase (RAB), où chaque 30 ul contenant 0,2 pmol de l'ADN-G4 Z33 TAMRA marqué (préparée à l'étape 2); la composition du RAB est la suivante: 0,1 ml de 3 x tampon Res, 0,01 ml de 0,2 pmol / G4-Z33-TAM, 0,03 ml de 0,1 M d' ATP et 0,16 ml de H ₂ O. Dans une bande de 6 PCR tubes, pipettes 40 pi de RAB dans le premier tube et 30 pi de RAB dans les tubes restants (garder les tubes sur la glace à ce moment).
2. Récupérez une des 7 aliquotes ul rG4R1 (de l'étape 4.5.11) et placez-le sur la glace. Avec une pipette de p20 réglé sur 5 pi, pipette doucement monter et descendre plusieurs fois pour mélanger le rG4R1 dans la partie aliquote et le transfert de 5 pi au premier tube de la bande de 6 tubes PCR (celle qui contient 40 pi de RAB). Ensuite, réglez la pipette 10 pi et de transférer en série 10 ul aux tubes PCR restants contenant RAB.
3. laisser incuber immédiatement cette bande de tubes de PCR à 37 ° C pendant 30 minutes dans un cycleur thermique, suivie d'un maintien à 4 C °.Ouvrez les tubes alors qu'ils sont maintenus à 4 ° C et ajouter 2 ul d'EDTA 0,5 M pH 8 à chaque tube (pour arrêter la réaction enzymatique).
4. Versez un gel TBE / 10% de glycérol 10% d'acrylamide / 1x. Après avoir retiré le peigne, laver les puits avec 1x TBE. Ajouter 5 ul d'une masse élevée, un polysaccharide hydrophile (30% de Ficoll dans H ₂ O) à chaque tube et on charge 15 pi de chaque tube (le chargement des puits peut à nouveau être observée en utilisant des lignes de Schlieren).
   1. En tant que témoin pour la mobilité G4-ADN, ajouter 4 pi d'une masse élevée, polysaccharide hydrophile à 20 pi RAB, et de la charge de 15 pi; comme une commande pour dérouler monomère Z33, la chaleur 20 pi de RAB à 98 ° C pendant 10 min, ajouter 4 pi d'une masse élevée, polysaccharide hydrophile, et la charge de 15 pi.
5. Exécutez le gel à 120 V pendant 2 h avec 1x TBE comme tampon en cours d'exécution. Image du gel sur un imageur multimodal avec une capacité de fluorescence-imagerie utilisant des filtres TAMRA spécifique (exciter avec un nm laser vert 532 et utiliser un 58bande 0 nm passer 30 filtre (580 BP 30)).
   NOTE: Une préparation très active de rG4R1 donnera une résolution complète de TAMRA marquée Z33 dans les 3 premières voies qui ont été chargés sur le gel, comme le montre la figure 2.

6. Mise en commun des Highly Active rG4R1 Preps, Aliquotage et stockage

REMARQUE: Cette étape nécessite 2 personnes. Le nombre et les besoins enzymatiques des essais en aval que le rG4R1 purifié sera utilisé dans déterminera le nombre de préparations sont nécessaires avant aliquotage. Une préparation typique consiste en la mise en commun de 8 préparations très actives (en utilisant ainsi un total de 16 500 cultures bactériennes induites ml), mais ce nombre est arbitraire et est spécifique au laboratoire.

1. Calculer le volume total de rG4R1, purifiés hautement actifs qui doivent être aliquotes. En règle générale, des aliquotes de 7 ul sont utilisés dans des essais en aval. Remplissez le bloc d'un cycl thermiqueer réglé à 4 ° C avec des tubes de PCR en bande (ceux-ci seront aliquotes dans, comme la nature solide du bloc permettra d'accélérer la fermeture rapide des bandes de PCR).
2. Récupérer les tubes PCR contenant rG4R1 très actif de -80 ° C et rapidement dégeler les tubes à la main; quand une petite quantité de glace est laissé dans le tube, placer les tubes sur la glace. Combinez tous les préparatifs rapidement-décongelés dans un prérefroidi, 15 ml tube et bien mélanger, en veillant à minimiser les bulles.
3. En utilisant une pipette automatique répéter, distribuer le volume de l'aliquote souhaitée dans les pré-réfrigérés tubes bande de PCR dans le cycleur thermique. Dès que 1 - 2 bandes sont terminées, ont la deuxième personne fermer les couvercles et les transférer sur des tranches de 96 puits qui flottent dans l'azote liquide (congélation instantanée est nécessaire pour préserver l'activité enzymatique).
   NOTE: Ne prenez pas plus d'environ 200 pi de rG4R1 dans la pointe de la pipette automatique à la fois pour réduire le temps que l'enzyme est pas à 4° C.
4. Une fois que les prérefroidi tubes de bande PCR dans le cycleur thermique ont été remplis avec des aliquotes et correctement gelé, transférer rapidement des tubes de la bande de PCR plus pré-réfrigérées de la glace au cycleur thermique et continuer aliquotage. Continuer de cette manière jusqu'à ce que le reste de l'enzyme a été aliquote, flash congelé dans l'azote liquide, et transféré à la glace sèche. Enfin, le transfert aliquotes à -80 ° C pour une conservation à long terme.

7. Quantification de la concentration Purifié rG4R1

1. Versez un standard de 5% d'empilement / 12% la résolution acrylamide / SDS gel pour la séparation des protéines.
2. Thaw environ 50 pi de aliquotés rG4R1, combiner dans un tube, et bien mélanger. Mesurer le volume exact avec une pipette et d'ajouter une quantité égale de tampon d'échantillon 2 x Laemmli (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (p / v) de glycerol, 2,1% de SDS et 0,02% de bleu de bromophénol) + BME (50 ul / 950 pi de tampon de Laemmli 2x). Dénaturer la protéine à 98 ° C pendant 10 min.
3. Préparer des dilutions de marqueurs MW à large spectre dans un tampon échantillon 1x + BME telle que les quantités de protéines suivantes peuvent être chargés sur le gel en tant que normes: 31,3, 62,5, 125, 250, et 500 ng.
   Remarque: chaque type de protéine contenue dans la large portée marqueurs de PM est présent à raison de 0,1 pg / pl, sauf pour la protéine de 50 kDa, qui est présent à raison de 0,3 pg / pl. Ces marqueurs ne sont pas besoin d'être dénaturé par la chaleur.
4. Retirer le peigne du gel et laver les puits avec du tampon de course / glycine 1x SDS standard. Charger l'équivalent de 25 et 12,5 ul de rG4R1 (qui est de 50 et 25 pl de protéine dénaturée), bien que le volume optimal de l' enzyme de charge doit être déterminée par l'utilisateur, comme la concentration des préparations enzymatiques peuvent varier (par exemple, 35 ul a été chargé sur le gel sur la figure 3). Chargez les normes de protéines préparées à l'étape 7.3. Veiller à ce que les pipettes sont correctement étalonnés, et assurez-vous d'être aussi précis que possible avec la technique de pipetage pour assurer une quantification précise.
5. Exécutez le gel à 120 V jusqu'à ce que le front de colorant a parcouru environ 2/3 du gel (pour assurer la séparation correcte des protéines qui composent les marqueurs large gamme MW).
6. Retirer le gel et disposer de la portion du gel qui ne sera pas contenir des protéines par la coupant avec une lame de rasoir. Placer le gel dans une cocotte en verre ou un récipient équivalent. Colorer le gel avec Coomassie colorant (50 mg de Coomassie R-250 par 100 ml de 50:10:40 v / v de methanol: acide acétique: H ₂ O qui a été filtré à travers un entonnoir papier-filtre) O / N à la température ambiante sur un ensemble de agitation pour assurer une agitation adéquate du gel.
7. De-tacher le gel avec 30:10:60 v / v de methanol: acide acétique: H ₂ O en utilisant balled-up, du papier de soie sans peluches pour accélérer la décoloration. Changer la solution de décoloration selon les besoins. Continuer détachage jusqu'à ce que le fond est suffisamment faible pour visualiser les normes rG4R1 et de protéines; un gel typique à ceétape est représentée sur la figure 3.
8. Placer le gel décoloré entre un protecteur de feuille et scanner le gel à ≥300 dpi. Ouvrez l'image numérisée dans un logiciel d'analyse d'images (tels que Fuji Multiguage ou équivalent) et de préparer des courbes standard des normes de protéines qui correspondent à 75, 100 et 150 kDa (les courbes représentent les montants en grammes par rapport à des lectures densitométriques). Assurez-vous de soustraire l'arrière-plan de chaque voie étant quantifiée au cours du processus d'obtention des valeurs densitométriques.
9. En supposant que la quantité en volume de rG4R1 qui a été chargé sur le gel contient une quantité de protéine qui est comprise dans la plage linéaire de ces courbes d'étalonnage, la quantité de protéine par gramme de microlitre de rG4R1 chargé peut être extrapolée.
10. Convertir la quantité en grammes extrapolée de rG4R1 en une quantité molaire en utilisant le poids moléculaire de G4R1, ce qui est 120 000 g / mol.
    NOTE: Pour chaque gel, trois valeurs extrapolées serontgénéré (une pour chacun des trois marqueurs protéiques utilisées pour générer des courbes standards: 75, 100 et 150 kDa). Exécutez deux autres gels et les taches et les quantifier en répétant les étapes 07.01 à 07.10. Avec les résultats de la quantification pour le premier gel, l'utilisateur sera en mesure d'évaluer à quel point rG4R1 doit être chargé sur d'autres gels pour obtenir une quantité qui est comprise dans la plage linéaire des normes de protéines. Au total, neuf extrapolation des valeurs représentant la concentration fortement active purifiée rG4R1. La moyenne de ces valeurs pour donner la concentration rG4R1 spécifique au lot final, qui est typiquement dans la gamme de 20 à 100 nm. Calculer l'écart type de ces valeurs (n = 9).

Résultats

Ce protocole (figure 1) , on obtient couramment à peu près pur, rG4R1 catalytiquement active. En tant que mesure de l' activité enzymatique, il est généralement observé que 50% de 0,2 pmol d'ADN-G4 tétramoléculaire TAMRA marqué est transformé en monomères à l'intérieur de la 0,2 - Gamme 0,013 ul de rG4R1, telle que déterminée par l'essai d'activité G4 décrite ci - dessus (fig 2). Coomassie de purifiée rG4R1 indique une seule bande au 120 taille kDa ...

Discussion

Ce protocole représente une expression, la purification et la quantification schéma très efficace pour l'isolement du produit génique DHX36, G4 Resolvase1 (G4R1, appelé aussi Rhau et DHX36) (figure 1). Ce protocole utilise deux étapes de purification: His-tag purification par affinité sur des billes d'affinité de cobalt et de purification enzymatique sur des billes G4-ADN conjugué. Cette dernière étape est unique en ce qu'il tire parti de l'affinité serré, une spécificité ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (from chicken egg white)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl pH=8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7	Universal Scientific Supply Co.	1966	or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8			For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8			For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	or From standard source
70% Ethanol			From standard source
Magnesium chloride (1 M solution)	Life Technologies	AM9530G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptin hemisulfate	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidin paramagnetic beads	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH=8	Universal Scientific Supply Co.	0718	or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6	Universal Scientific Supply Co.		From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)	Sigma-Aldrich	L5385
Cobalt metal affinity beads	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate	Universal Scientific Supply Co.	1667	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	or From standard source
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV lamp			Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)			Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge			Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath			For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria			For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria			For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer			capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer			From standard source
PCR strip tubes			From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene)			From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)			From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene)	Thermo Scientific	3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes			From standard source
Gel-loading tips			From standard source
Automatic repeating pipette			For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler			From standard source
Liquid Nitrogen			From standard source
Dry ice			From standard source
Laemlli sample buffer	Biorad	161-0737
Apparatus for running large slab gels	Biorad		We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet	Life Technologies	12301D	We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades			From standard source
Filter paper and funnel			From standard source
Glass casserole dish			From standard source
Orbital shaker			From standard source
Kimwipes			From standard source
Clear sheet protectors			From standard source
Scanner and associated TWAIN software			From standard source
Image analysis software			Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel			Or equivalent