Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1

Riepilogo

G4 Resolvase1 lega a strutture G-quadruplex (G4) con ristretti affinità segnalato per una proteina G4 vincolanti e rappresenta la maggioranza dell'attività svolgimento G4-DNA in cellule HeLa. Descriviamo un nuovo protocollo che sfrutta l'affinità e l'attività svolgimento ATP-dipendente di G4-Resolvase1 per purificare specificamente G4R1 ricombinante cataliticamente attivo.

Abstract

strutture di acidi nucleici di ordine superiore chiamato G-quadruplex (G4S, strutture G4) si possono formare in regioni ricche di guanina sia di DNA e RNA e sono altamente stabili termicamente. Ci sono> 375.000 putativi sequenze G4 di formazione nel genoma umano, e si sono arricchiti in regioni promotrici, le regioni non tradotte (UTR), e all'interno della ripetizione telomerica. A causa del potenziale di queste strutture di influenzare processi cellulari, come la replicazione e la trascrizione, la cellula si è evoluta gli enzimi per la loro gestione. Un tale enzima è G4 Resolvase 1 (G4R1), che è stato co-biochimicamente caratterizzata dal nostro laboratorio e Nagamine et al. ed è risultata estremamente legano strettamente sia G4-DNA e G4-RNA (K _d nella gamma bassa-PM). G4R1 è la fonte della maggior parte delle attività G4-risolvendo in lisati cellulari HeLa e da allora è stato implicato per svolgere un ruolo nel metabolismo dei telomeri, lo sviluppo della linfa, la trascrizione del gene, emopoiesi, e la sorveglianza immunitaria. La capacità di efficientemente esprimere e purificare cataliticamente attivo G4R1 è di importanza per i laboratori interessati ad approfondire la comprensione dell'interazione cinetica delle strutture G4 ed enzimi G4-risolvere. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per la purificazione di ricombinante G4R1 (rG4R1). La procedura descritta incorpora tradizionale purificazione per affinità basata su un enzima istidina-tag C-terminale espressa in batteri codone ottimizzato umani con l'utilizzo della capacità di rG4R1 di legare e distendersi G4-DNA per purificare enzima altamente attivo in una ATP- passo eluizione dipendente. Il protocollo comprende inoltre una fase di controllo di qualità in cui l'attività enzimatica di rG4R1 è misurata esaminando la capacità dell'enzima purificato per rilassarsi G4-DNA. Un metodo è anche descritto che consente la quantificazione purificato rG4R1. adattamenti alternativi di questo protocollo sono discussi.

Introduzione

strutture G4 sono strutture secondarie altamente stabili di acido nucleico che si formano nelle regioni ricche di guanina del DNA e RNA. Strutture G4 sono stabilizzati tramite interazioni Hoogsteen-bonding e coordinare l'incollaggio all'interno della cavità centrale con monovalenti cationi (es. K ⁺ e Na ⁺⁾ che contribuiscono in modo significativo alla notevole stabilità termica delle strutture G4 ^{1, 2.} I primi bioinformatica studi hanno suggerito che il genoma umano contiene> 375.000 "potenziali G4 che formano motivi" ^{3, 4.} Altre stime studio recenti suggeriscono che il numero di G4 motivi è superiore di un fattore del 2,5 ^5, mentre un altro studio prevede 716,310 potenziali sequenze distinte G4 formano nel genoma umano ^6. G4-forming sequenze sono evolutivamente conservata e non disperse in modo casuale ingenoma. Motivi G4 sono arricchiti in gene regioni codificanti, e verso l'alto del 40% di tutti i promotori dei geni contengono G4 motivi ^7. È interessante notare che il grado di arricchimento di motivi G4 in un gene è stata dimostrata per suggerire la funzione del gene. Ad esempio, proto-oncogeni e geni coinvolti nello sviluppo hanno significativamente maggiore arricchimento delle strutture G4 di geni oncosoppressori ^{8, 9.}

Con le alte stabilità termica, una presenza quasi onnipresente in tutto il genoma, e il potenziale per influenzare in modo significativo i principali processi cellulari, non è sorprendente scoprire che la cellula si è evoluta enzimi per gestire queste strutture. Uno di questi enzimi è G4 Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36), che abbiamo caratterizzato come la fonte della maggior parte dei tetramolecular G4-DNA attività risolvere in (HeLa), le cellule umane ^10. Da allora, è stato dimostrato that G4R1 ermeticamente lega e cataliticamente snoda tetramolecular e unimolecolare G4-DNA e G4-RNA con i più stretti KD riportato per una proteina G4 vincolante ^{11, 12, 13.} Inoltre, l'attività G4-risolutivo G4R1 è stata implicata in un'ampia gamma di processi biochimici e cellulari, tra telomero / telomerasi biologia ^{11, 14, 15, 16,} trascrizione e splicing ^{17, 18, 19, 20,} di sviluppo ^21, ematopoiesi ^21, e immune regolazione ^{22, 23.} Con una preponderanza di sequenze G4 situato specificamente nel genoma e diversificata p cellularerocesses che G4R1 è stato recentemente implicato di essere coinvolti con, la capacità di esprimere in modo efficiente e purificare altamente attiva rG4R1 sarà della massima importanza per chiarire i meccanismi biochimici e comportamenti di questa proteina.

Qui, dimostriamo un romanzo espressione e di schema di purificazione (Figura 1) che sfrutta l'ATP-dipendente, l'attività G4-risolutivo rG4R1 per isolare in modo efficace enzima attivo. Questo schema potrebbe essere adattato per purificare altri enzimi acido nucleico ATP-dipendente in cui il prodotto della reazione enzimatica non è più un substrato per il legame, come è il caso per G4R1.

Protocollo

1. Preparazione delle strutture G4-DNA da utilizzare per la purificazione di rG4R1 (Formazione di biotinilato G4-DNA di G-quadruplex)

1. Ordinare i seguenti oligomeri di DNA, denominato Z33-Bio, a 1 micromol scala: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'. Assicurarsi che la frazione biotina è alla 'fine della oligomero 3.
2. Preparare 10x tampone G4: 450 mm Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, e 2.500 mM NaCl.
3. Risospendere il oligomero Z33 in 250 ml di acqua (in modo che la concentrazione oligomero è ~ 2,5 mM). Aggiungere 25 ml di 10x tampone G4 e mescolare. Incubare l'oligomero a 50 ° C per ~ 48 h.
4. Brevemente spin down del tubo per raccogliere la condensa (~ 1.000 xg, 10 s). Aggiungere ~ 50 ml di un alto di massa, polisaccaride idrofila (30% Ficoll in H ₂ O) e mescolare. Versare una TBE / 10% gel 10% di acrilammide / 1x glicerolo (dimensioni gel: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Una volta che il gel è polimerizzato, lavare i pozzetti con 1x TBE e caricoil formato oligomero Z33-Bio in modo uniforme in tutta la maggior parte del gel (campione corsia di carico può essere visualizzato con linee Schlieren).
   1. In una corsia alla fine del gel, caricare una piccola frazione del oligomero che è stato riscaldato a 98 ° C per 10 min (questo servirà come controllo non strutturato), così come una piccola quantità di colorante di caricamento del gel in un altro corsia per monitorare fino a che punto il gel è stato eseguito.
5. Utilizzare 1x TBE come il buffer di gel in esecuzione ed eseguire il gel a 120 V fino a quando il fronte del colorante ha attraversato almeno 1/3 del gel.
6. Mettere un piatto cromatografia su strato sottile, con la sua faccia lato ruvido in un protettore foglio (o coprire con pellicola trasparente). Rimuovere una delle lastre di vetro e trasferire il gel sulla superficie del foglio di protezione. Spegnere le luci ambientali e ombre UV il gel (lunga lunghezza d'onda: 365 nm). Utilizzare una lama di rasoio fresco e tagliare la banda G-quadruplex-Z33-Bio, che sarà visto come l'esecuzione più in alto nel gel (avente mobilità più lenta) rispetto alla massa fusail controllo ed.
7. Posizionare la fetta gel contenente il G4-DNA ricavata in una provetta da 50 ml e aggiungere sufficiente tampone ammollo per coprire la fetta gel (buffer ammollo consiste di 1/3 del volume 10x TBE, 1/3 del volume satura di acetato di sodio, e 1/3 Volume H ₂ O). Posizionare il tubo in un 37 ° C incubatore (nonhumidified) e incubare O / N.
8. Trasferire la soluzione in una provetta da 15 ml e aggiungere 1/10 di volume glicogeno (glicogeno magazzino a 20 mg / ml in 10 mM Tris-HCl pH 8, 2,5 mM EDTA pH 8, e 0,05% sodio azide) e ~ isopropanolo 1.2x .
   NOTA: sodio azide è tossicità acuta, in modo da utilizzare con cautela!
   1. Mescolare e porre il tubo a -20 ° C per almeno 2 h. Spin la provetta a 2700 xg in una centrifuga da tavolo raffreddata a 4 ° C per 12 min. decantare delicatamente la soluzione dal G4-DNA pellettato. Lavare il pellet 3 volte con 70% EtOH + 50 mM NaCl (il sale nel lavaggio è critico per la stabilità G4). Wick via il liquido in eccesso con la carta velina e privo di lanugine.
9. Postoil pellet lavato in frigorifero per almeno 2 ore per idratare il pellet e consentire facile risospensione. Risospendere il pellet in 50 ml di tampone TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, 50 mM NaCl, e 0,05 mM EDTA pH 8).
10. Porre 5 ml di questo formato DNA G-quadruplex in 495 ml di H ₂ O e quantificare utilizzando uno spettrofotometro che consente il coefficiente di estinzione determinato inserendo la composizione nucleotidica del oligomero (il coefficiente di estinzione del oligomero Z33 DNA con composizione base A = 8, C = 3, G = 15 e T = 7 è 341.946 L / mol / cm). Inserire il fattore di diluizione 25 (non 100), come il formato del G-quadruplex è composto da 4 strati di DNA.
11. Aliquota del volume equivalente di 3 OD (OD ₂₆₀ unità) per tubo e conservare a -20 ° C; per esempio, se i 5 ml che è stato aggiunto al 495 ml di H ₂ O fornisce una OD ₂₆₀ lettura 3, quindi preparare 5 microlitri aliquote.

2. Preparazione delle strutture G4-DNA per essere utilizzato in un enzimatica attività test di rG4R1 (Formazione di TAMRA-etichettati G4-DNA)

1. Ordinare i seguenti oligomeri di DNA, denominato Z33-TAM, a 1 micromol scala: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'. Assicurarsi che la frazione TAMRA è al 5 'fine della oligomero.
2. Seguire la stessa procedura come descritto nella Sezione 1 per la formazione del G-quadruplex, salvo che ultravioletta (UV) shadowing non è necessario perché il tetramethylrhodamine (TAMRA) -labeled G-quadruplex sarà facilmente visibile ad occhio nudo. Anche in questo caso, assicurarsi di includere un controllo fusa sul gel.
3. Dopo aver scattato una lettura spettrofotometro di Tamra marcato DNA G-quadruplex, come al punto 1, diluire il formato G-quadruplex a 0,2 pmol / mL con tampone TNE. Infine, aggiungere glicerolo ad una concentrazione finale del 10% e conservare a -20 ° C.

3. Transform (DE3) pLysS Cellule competenti con PtriEx4-DHX36 (plasmidi codifica G4R1 umano) e crescere / Indurre Grandi colture batteriche

1. Ottenere il plasmide TriEx4-DHX36.
2. Aliquota i batteri in 20 microlitri aliquote e conservare a -80 ° C. Aliquotare il mezzo SOC (2% triptone, 0,5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl _2, 10 mM MgSO _4, e 20 mM di glucosio) in 80 aliquote microlitri e conservare a -80 ° C.
3. Preparare carbenicillina (CARB) / cloramfenicolo (CAM) piastre di LB-agar. Concentrazioni fotografici di CARB e CAM sono 50 mg / ml in H ₂ O e 35 mg / ml in 70% EtOH, rispettivamente, e queste sono 1,000x concentrato; pertanto, le concentrazioni finali nelle piastre di selezione agar LB sono 50 ug / ml e 35 mg / ml, rispettivamente.
4. Mettere 1 aliquota di batteri su ghiaccio e mettere 1 aliquota di media SOC a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mg di pTriEx4-DHX36 plasmide ai batteri e miscelare delicatamente con la punta della pipetta per mescolare. Incubare in ghiaccio per un ulteriore shock termico 5 minuti e poi a 42 e #176; C per 30 s. Mettere in ghiaccio per 2 minuti e aggiungere il supporto SOC.
5. Piastra le batteri trasformati su piastre di selezione preriscaldate (tipicamente, piatto Un piccolo volume, ad esempio 5 - 10 ml, per garantire bassa densità colonia cosicché singole colonie possono essere facilmente inoculati in grandi culture) e incubare a 37 ° CO / N.
6. Preparare Terrific Broth secondo le istruzioni ²⁴ del produttore. Fare 500 ml per gran fiasco (assicuratevi di aggiungere glicerolo) e autoclave su un breve ciclo di liquido.
7. Aggiungere CARB / CAM (50 ug / ml / 35 mg / ml) al brodo e poi inoculare le culture prendendo agar tappi (utilizzando una pipetta p1000) contenente una singola colonia batterica e pipettaggio nel brodo. Agitare vigorosamente le culture per aerare loro e poi incubare le culture a 37 ° CO / N senza agitare.
8. Il giorno seguente, posizionare le culture in una C shaker 37 ° e agitare a ~ 225 rpm. Far crescere le culture fino a quando la OD ₆₀₀ è di circa 0,4 -0,6, che saranno generalmente di circa 4 - 6 h, a seconda della densità cellulare iniziale.
   NOTA: Ciò richiederà il monitoraggio periodico della densità tramite letture spettrofotometriche, ed è fondamentale per non far crescere le colture di molto al di sopra di 0,5 OD. Come in bianco per le letture spettrofotometriche, spin down 1 ml di batteri e utilizzare il brodo chiarificato come la soluzione di soppressione.
9. Una volta che il corretto OD ₆₀₀ è ottenuto, posizionare immediatamente le culture su ghiaccio e rapidamente raffreddare a 10 ° C. Monitorare la temperatura con un termometro pulito con il 70% EtOH. Accelerare il raffreddamento ruotando rapidamente i palloni mentre su ghiaccio, in modo da limitare ulteriormente la crescita batterica prima dell'induzione proteina ricombinante.
10. Aggiungere IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM (~ 120 mg / 500 mL cultura) e poi agitare a 80 rpm a 14 ° C per ~ 17 - 18 h. La temperatura ideale per l'induzione di proteine ​​è stato trovato essere 14 ° C; per raggiungere meglio questo, utilizzare un raffreddato ad acqua-bagno shaker located in una stanza fredda convenzionale e controllare manualmente la temperatura del bagno d'acqua con un termometro.
    NOTA: In alternativa, utilizzare un raffreddato ad aria agitatore / incubatore, anche se è necessario verificare che regolazione della temperatura digitale-impostata produrrà la temperatura del liquido desiderata (test di questa incubando un pallone di acqua con un termometro in esso e agitazione a 80 rpm per alcune ore, regolando la temperatura digitale modificando di conseguenza fino 14 ° C viene raggiunto).
11. Posizionare le culture su ghiaccio e raffreddarli rapidamente, come al punto 3.9. Prendete una piccola aliquota di batteri e prendere un OD ₆₀₀ lettura; Idealmente, le colture saranno raddoppiati durante l'induzione a circa 0,8 - 1,2 OD _600.
12. Trasferire i batteri per 500 ml provette da centrifuga e bilanciare manualmente utilizzando coltura batterica per uniformare il peso tra i tubi. Una volta equilibrata, li centrifugare a 3.840 xg per 20 min a 4 ° C. Versare il brodo chiarificato e congelare il pel battericalascia a -80 ° C fino al momento della purificazione della proteina.

4. Purificazione di rG4R1 umana

1. Scongelare e lisare pellet batterici.
   1. Scongelare il pellet batterico in 3 mL di tampone TN a RT (tampone TN consiste di 100 mM Tris pH 7.5 e 50 mM NaCl). Tenere le bottiglie in mano e agitare per scongelare / risospendere il pellet batterico. Una volta scongelato e relativamente uniforme sospeso, portare il volume fino a 5 ml con tampone TN (un'ulteriore sospensione può essere realizzato tramite pipettando su e giù con una pipetta ml 5).
      NOTA: E 'tipico di scongelare / prep 2 o 4 bottiglie al giorno di preparazione, a seconda del livello d'uso del comfort con la procedura di purificazione.
   2. Sciogliere 20 mg di lisozima in 250 ml di H ₂ O (per la cultura) e aggiungere ai batteri risospeso. Lasciare che il lisozima per digerire i batteri per ~ 5 - 10 minuti, mentre agitando le bottiglie in mano.
      NOTA: Il colore del suspensione inizierà a schiarire un po 'con il procedere della digestione, e la sospensione sarà relativamente non viscoso. Se le colture sono troppo ricoperta (cioè molto maggiore di 1,2 OD _600), allora DNA cromosomale batterica può causare viscosità indesiderato in questa fase.
   3. Aggiungere 250 ml di cocktail di inibitori delle proteasi (PIC) e un'aliquota 10 ml di leupeptina. Mescolare accuratamente.
   4. Mettere in ghiaccio e aggiungere 10 ml di tampone TN freddo e 22 ml di BME. Trasferire in un tubo da 50 ml.
   5. Sonicare i batteri su ghiaccio con un sonicatore digitale impostato al 30% di ampiezza. Pulse a 2 s ON e OFF 2 s per 1 min. Ripetere la sonicazione 3 volte, permettendo ai campioni raffreddare in ghiaccio per almeno 2 min tra i passaggi sonicazione.
      NOTA: Con molteplici culture, sonicare ognuno a turno prima di ripetere le iterazioni sonicazione. Durante sonicazione, fare attenzione a mantenere la punta sonicazione sufficientemente sommerso nel lisato batterico, ma non toccare °e lati del tubo, in modo da generare il calore in eccesso.
   6. Aggiungere un volume uguale (15 mL) di freddo 4x SSC + 20 ml di BME + 50 ml di PIC + 1 aliquota di leupeptina e mescolare.
   7. In una centrifuga da tavolo pre-raffreddato a 4 ° C, centrifugare i lisati a 2.300 xg per 20 min. Trasferire il surnatante in fresco, tubi pre-raffreddato 50 mL (1 tubo per grande cultura viene preparata).
2. Preparare perline G4-magnetica.
   1. Prendere 1 ml di perline streptavidina paramagnetico (SPB) sospensione (per 1 L cultura) e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Pellet SPB con un magnete e lavare 2x con 2x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Risospendere il SPB lavato in 200 ml della stessa soluzione usata per lavare le perline.
   2. Aggiungere un 3 OD un'aliquota di G4-DNA (Z33-Bio G4 preparata nella Sezione 1) per la sospensione SPB e mescolare rapidamente pipettando su e giù parecchie volte. Porre i tubi su un rotatore e ruotare a temperatura ambiente per almeno 30 min (fino a 60 min).
   3. A poppaer questo periodo di rotazione, bloccare il SPB G4-bound con l'aggiunta di 1 ml di 0,4% lattoalbumina, e tenere in ghiaccio fino al momento dell'uso. Diluire la lattoalbumina 0,4% dal lattoalbumina magazzino 4% utilizzando 1x Tris-glicina.
      NOTA: Il magazzino 4% lattoalbumina (w / v) viene inizialmente preparato per dissoluzione in 2 M glicina pH 7,5, con l'ulteriore aggiunta di 1x PIC e 0,05% di sodio azide.
3. Bind istidina-tag rG4R1 di perline cobalto (CB) (continua dal punto 4.1).
   1. Aggiungere 1 ml di CB slurry (equivalente ad un volume tallone 0,5 mL) a ciascuna provetta 50 mL contenente lisato batterico chiarificato. Incubare per 20 minuti a RT su un rotatore.
      NOTA: il volume tallone 0,5 ml viene utilizzato per 1 L di lisato chiarificato; ad esempio, se vengono preparati due 500 colture batteriche mL, solo aggiungere CB al tubo 50 mL contenente lisato chiarificato da una delle culture a questo punto, come lisato dalla seconda coltura sarà serialmente legato con lo stesso 0,5 mL di CB in vep 4.3.3).
   2. Spin down CB a 110 xg per 5 min a 4 ° C tavolo centrifuga. Aspirare il liquido con attenzione, e lasciare un paio ml di liquido in modo da non disturbare il CB pellet. Lavare con 10-15 ml di freddo 4x SSC + BME (0,5 ml di BME / mL di 4x SSC).
      NOTA: per lavaggi, versare il 10-15 ml direttamente sulle perline di cobalto pellet invece di pipettaggio, come pipettaggio farà sì che le perline di rimanere bloccati all'interno della pipetta e proteine verranno persi.
   3. Agglomerare le CB di nuovo tramite centrifugazione e poi versare il prossimo lisato chiarificato (30 mL, che rappresenta la coltura batterica 2 ^° grande indotto) sul CB pellet. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente sul rotatore e poi lavare due volte con 10-15 ml di 4x SSC + BME. Pellet a 110 xg per 5 minuti a 4 ° C.
   4. Dopo il secondo lavaggio, aspirare il liquido e lasciare circa 2 ml di perline / liquido sul fondo della provetta. Trasferire il CB proteina legata ad un tubo di pre-raffreddamento 2-mLcon un 1 mL "wide-bore" punta della pipetta.
      NOTA: utilizzare una lama di rasoio fresca per tagliare l'estremità della punta prima del trasferimento, come l'uso di questo "wide-bore" punta della pipetta riduce la perdita di perline cobalto legati alle proteine.
   5. centrifugare brevemente le perline nel tubo 2 ml ad alta velocità (~ 18.000 xg) in una microcentrifuga a 4 ° C (~ 5 - 10 s è tutto ciò che è necessario per pellet rapido). Rimuovere delicatamente e scartare il surnatante pipettando, facendo attenzione di non perdere il CB legato alle proteine.
4. Eluire rG4R1 da CB.
   1. Incubare la CB in 0,5 mL di tampone di eluizione istidina (HEB) su un rotatore per 5 minuti in una camera fredda. Anche in questo caso, quando si aggiunge HEB, solo pipetta la 0.5 mL sulle perline (per eliminare le perdite CB) e risospendere le sfere invertendo il tubo. HEB è 0.7 M L-istidina pH 6 (il pH viene regolato con acido acetico).
   2. Centrifugare a 18.000 xg in una microcentrifuga C 4 ° per 1 min. Trasferire il surnatanteun pre-raffreddata 15 mL tubo. Rimuovere delicatamente e trasferire il surnatante contenente proteine ​​da un'attenta pipettaggio, lasciando una piccola quantità di liquido sulla parte superiore del CB.
   3. Ripetere i punti 4.4.1 e 4.4.2 per un totale di 3 eluizioni HEB.
   4. Eluire una volta con 0.2 M EDTA pH 6.0; il colore del CB cambia dal rosa al bianco come EDTA chela cobalto.
   5. Dopo questa quarta e ultima eluizione è stata trasferita al tubo 15 mL, pipetta la tampone di eluizione residua dalla CB utilizzando una punta di gel-caricamento sulla estremità di una punta mL 1 pipetta; immergendo la punta al fondo della provetta, tampone di eluizione contenente proteine ​​residua può essere raccolto.
5. Associare rG4R1 a G4-bound SPB ed eluire enzima ricombinante in un modo ATP-dipendente.
   1. Preparare 5x Res buffer: 250 mM Tris-Acetato pH 7,8, 250 mM NaCl, 2,5 mM MgCl _2, 50% glicerolo. Preparare 3x Res Buffer: 0,915 ml di H ₂ O, 2 ml di 5x Res Buffer, 0,33 ml di 0,4% lattoalbumina (diluted dal 4% lattoalbumina con 1x Tris-glicina), 0,010 ml di BME, 0,015 ml di 1 M MgCl _2, 0,050 ml di PIC e 0,010 ml di leupeptina. Tenere in ghiaccio.
      NOTA: Il magazzino 4% lattoalbumina (w / v) viene inizialmente preparato per dissoluzione in 2 M glicina pH 7,5, con l'ulteriore aggiunta di 1x PIC e 0,05% di sodio azide.
   2. Pellet G4-SPB al lato del tubo con un magnete e scartare il surnatante (G4-SPB, come preparato al punto 4.2). Aggiungere 1 ml di 3x Res Buffer al G4-SPB e pipetta per mescolare.
   3. Pipettare 1 ml di G4-SPB sospesa in tampone 3x Res nel tubo da 15 ml contenente ~ 2 ml di proteine ​​contenenti HEB / EDTA (eluato dal punto 4.4). Incubare per 15 minuti a 37 ° C bagnomaria con agitazione occasionale in modo che le perle non si depositano.
   4. Il ghiaccio, pellet proteina-bound G4-SPB al lato del tubo con un magnete. Per lavare, aggiungere 1 ml di 4x SSC + 0,4% lattoalbumina (+ 0,5 microlitri / ml BME) e pipetta per risospendere le sfere. perline pellet con tsi magnete sul ghiaccio. Ripetere questo lavaggio per un totale di 2 lavaggi.
      NOTA: La pazienza è richiesto durante la procedura di lavaggio per assicurare che tutte le sfere magnetiche sono state pellet tra i lavaggi. Ciò è particolarmente vero dato l'aumento della viscosità della soluzione a causa del glicerolo contenuto nel buffer Res.
   5. Lavare il G4-SPB 1x con 1 ml di 3x Res tampone.
   6. Preparare tampone di eluizione (EB): 0,5 mL di 3x Res Buffer, 0,1 ml di 0,1 M ATP, e 0,4 ml di H ₂ O.
   7. Pre-caldo 1 ml di EB a 37 ° C in PCR tubi distribuiti in tutto il blocco di riscaldamento di un termociclatore impostato a 37 ° C.
   8. Pellet G4-SPB con il magnete su ghiaccio e risospendere le sfere in 100 ml di EB pre-riscaldato. Trasferire immediatamente le perline per un tubo preriscaldata PCR e incubare per 30 s a 37 ° C.
   9. Prontamente aggiungere 12 ml di 5 M NaCl e pipetta su e giù con forza 20 - 30 volte. La combinazione di alta sale e ATP contenuta nella EBserve per eluire rG4R1 dai G4-perline.
      NOTA: E 'molto importante ridurre al minimo il numero di bolle formatesi durante il processo di pipettaggio, come bolle possono denaturare la proteina.
   10. pellet immediatamente il G4-SPB con un magnete e trasferire l'eluato proteici ad un tubo di PCR fresco sul ghiaccio (l'etichetta con la data).
   11. Ripetere l'eluizione e il trasferimento descritto ai punti 4.5.8-4.5.10; il prodotto finale di questo processo è quindi ~ 200 ml di EB depurati rG4R1. Mettere da parte due 7 aliquote microlitri (in provette da PCR etichettate con la data appropriata) per l'uso nel saggio di attività enzimatica di controllo della qualità che metterà alla prova se altamente attiva rG4R1 ha infatti stato purificato.
   12. Conservare il rG4R1 purificato a -80 ° C fino al momento del saggio di attività.

5. Qualità enzimatica Controllo Attività Assay di purificata rG4R1

1. Per ogni preparazione di rG4R1 da dosare, preparare 300 mldi tampone resolvase (RAB), dove ogni 30 ml contiene 0,2 pmol di TAMRA marcata Z33 G4-DNA (preparata al punto 2); il trucco del RAB è la seguente: 0,1 mL di 3x Res Buffer, 0,01 ml di 0,2 pmol / ml G4-Z33-TAM, 0,03 ml di 0,1 M ATP, e 0,16 ml di H ₂ O. In una striscia di 6 PCR tubi, pipetta 40 ml di Rab nel primo tubo e 30 ml di RAB nelle restanti tubi (tenere i tubi in ghiaccio a questo punto).
2. Recuperare una delle 7 aliquote microlitri rG4R1 (dal punto 4.5.11) e posizionarlo sul ghiaccio. Con una pipetta P20 impostato a 5 ml, delicatamente pipetta su e giù un paio di volte per mescolare la rG4R1 nella parte aliquota e trasferimento 5 ml per il primo tubo della striscia di 6 provette PCR (quella che contiene 40 ml di RAB). Successivamente, impostare la pipetta di 10 ml e trasferire in modo seriale 10 microlitri ai tubi PCR restanti contenenti RAB.
3. incubare Immediatamente questa striscia di provette per PCR a 37 ° C per 30 minuti in un ciclatore termico, seguito da un C presa 4 °.Aprire i tubi mentre vengono tenute a 4 ° C e aggiungere 2 ml di 0,5 M EDTA pH 8 ad ogni provetta (per arrestare la reazione enzimatica).
4. Versare un gel TBE / 10% glicerolo 10% di acrilammide / 1x. Dopo aver rimosso il pettine, lavare i pozzetti con 1x TBE. Aggiungere 5 ml di una alta massa polisaccaride idrofila (30% Ficoll in H ₂ O) a ciascuna provetta e carico 15 microlitri da ogni provetta (il caricamento di pozzi può ancora essere osservato utilizzando linee Schlieren).
   1. Come controllo per la mobilità G4-DNA, aggiungere 4 ml di una massa elevata, polisaccaride idrofila a 20 l RAB, e carico di 15 ml; come controllo per unwound monomerico Z33, calore 20 ml di RAB a 98 ° C per 10 minuti, aggiungere 4 ml di una massa elevata, polisaccaride idrofila, e il carico 15 microlitri.
5. Attivare il gel a 120 V per 2 ore con 1x TBE come il buffer di esecuzione. Immagine il gel su un imager multimodale con capacità di fluorescenza per immagini utilizzando filtri Tamra-specifico (eccita con un nm laser verde 532 e utilizzare un 58banda 0 nm passare 30 filtro (580 BP 30)).
   NOTA: Una preparazione altamente attiva di rG4R1 produrrà completa risoluzione della TAMRA marcato Z33 nei primi 3 corsie che sono stati caricati sul gel, come mostrato nella Figura 2.

6. Pooling di Highly Active rG4R1 Preps, aliquotandolo e bagagli

NOTA: Questo passaggio richiede 2 persone. Il numero e le esigenze enzimatici dei saggi a valle che il rG4R1 purificato sarà utilizzato in determinerà quanti preparativi necessari prima in aliquote. Un tipico grande preparazione consiste dal cumulo dei 8 preparazioni altamente attivi (utilizzando così un totale di 16 indotti 500 mL colture batteriche), ma questo è un numero arbitrario ed è specifico laboratorio.

1. Calcolare il volume totale, rG4R1 purificati altamente attivi che deve essere aliquotati. Tipicamente, 7 microlitri aliquote sono utilizzati in saggi a valle. Riempire il blocco di un CYCL termicoer impostato a 4 ° C con tubi striscia PCR (questi saranno aliquotati in, come la natura solida del blocco sarà accelerare la rapida chiusura delle strisce PCR).
2. Recuperare le provette PCR contenenti rG4R1 altamente attiva da -80 ° C e rapidamente scongelare i tubi in mano; quando una piccola quantità di ghiaccio viene lasciata nel tubo, posizionare le provette su ghiaccio. Unire tutti i preparativi rapidamente-scongelati in un, 15 tubo prechilled ml e mescolare bene, avendo cura di ridurre al minimo le bolle.
3. L'utilizzo di un pipetta ripetizione automatica, erogare il volume dell'aliquota desiderato nei tubi striscia PCR pre-refrigerati nel termociclatore. Non appena 1 - 2 strisce sono stati completati, hanno la seconda persona chiudere le palpebre e trasferirli a 96 pozzetti wafer che galleggiano in azoto liquido (congelamento flash è necessario per preservare l'attività enzimatica).
   NOTA: Non assumere più di circa 200 ml di rG4R1 nella punta della pipetta automatica alla volta per ridurre il tempo che l'enzima non è 4° C.
4. Una volta che i tubi striscia prechilled PCR nel termociclatore sono stati riempiti con aliquote e adeguatamente congelati, trasferire rapidamente i tubi striscia PCR più pre-raffreddata dal ghiaccio al termociclatore e continuare in aliquote. Continuare in questo modo finché è stato aliquotati il ​​resto dell'enzima, flash congelato in azoto liquido, e trasferito in ghiaccio secco. Infine, trasferire le aliquote a -80 ° C per una conservazione a lungo termine.

7. Quantificazione dei purificata rG4R1 Concentrazione

1. Versare uno standard 5% accatastamento / 12% la risoluzione di acrilammide / SDS gel per la separazione delle proteine.
2. Scongelare circa 50 ml di aliquotati rG4R1, unire in un tubo, e mescolare bene. Misurare il volume esatto con una pipetta e aggiungere una quantità uguale di tampone campione 2x Laemmli (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (w v) glicerolo /, 2,1% SDS, e 0,02% blu di bromofenolo) + BME (50 microlitri / 950 ml di tampone 2x Laemmli). Denaturare la proteina a 98 ° C per 10 min.
3. Preparare le diluizioni dei marcatori MW ad ampio raggio in tampone campione 1x + BME in modo tale che i seguenti importi di proteine ​​possono essere caricati sul gel come standard: 31,3, 62,5, 125, 250, e 500 ng.
   NOTA: Ogni standard proteine contenute nei marcatori MW ad ampio raggio è presente a 0.1 mg / mL, tranne per il kDa 50, che è presente a 0.3 mg / mL. Questi marcatori non devono essere termicamente denaturato.
4. Rimuovere il pettine dal gel e lavare i pozzetti con tampone di corsa / glicina 1x SDS standard. Caricare il equivalente di 25 e 12.5 ml di rG4R1 (che è 50 e 25 ml di proteina denaturata), anche se il volume ottimale di enzima per caricare deve essere determinato dall'utente, come la concentrazione delle preparazioni enzimatiche varierà (ad esempio, 35 ml è stato caricato sul gel in figura 3). Caricare le norme di proteine ​​previste al punto 7.3. Assicurarsi che le pipette siano correttamente calibrate, e assicurarsi di essere il più preciso possibLe con tecnica di pipettamento per garantire la quantificazione precisa.
5. Eseguire il gel a 120 V fino a quando il fronte del colorante ha percorso circa 2/3 del gel (per garantire la corretta separazione delle proteine ​​che compongono i marcatori vasta gamma MW).
6. Rimuovere il gel e smaltire la parte del gel che non contengono proteine ​​tagliando via con una lama di rasoio. Porre il gel in un piatto di vetro casseruola o una presa equivalente. Colorare il gel con colorante Coomassie (50 mg di Coomassie R-250 per 100 ml di 50:10:40 v / v metanolo: acido acetico: H ₂ O che è stata filtrata attraverso un imbuto di carta da filtro) O / N a RT su una serie agitatore orbitale per garantire un'adeguata agitazione del gel.
7. De-macchia il gel con 30:10:60 v / v metanolo: acido acetico: H ₂ O utilizzando appallottolata, carta velina e privo di lanugine per accelerare decolorazione. Modificare la soluzione decolorazione, se necessario. Continuare decolorazione fino a quando il fondo è sufficientemente basso per visualizzare gli standard rG4R1 e proteine; un tipico gel a questofase è mostrato in figura 3.
8. Posizionare il gel decolorato tra un protettore foglio di eseguire la scansione e il gel con una risoluzione di ≥300 dpi. Aprite l'immagine digitalizzata in un programma software di analisi (come ad esempio Fuji Multiguage o equivalente) e preparare curve standard dagli standard di proteine ​​che corrispondono a 75, 100 e 150 kDa (le curve rappresentano valori grammo contro le letture densitometriche). Assicurati di sottrarre il fondo da ogni corsia essere quantificato durante il processo di ottenimento di valori densitometrici.
9. Supponendo che la quantità di volume di rG4R1 che è stato caricato sul gel contiene una quantità di proteina che è all'interno della gamma lineare di tali curve standard, la quantità grammo di proteine ​​per microlitro di rG4R1 caricato può essere estrapolata.
10. Convertire la quantità grammo estrapolato rG4R1 in una quantità molare utilizzando il peso molecolare di G4R1, che è 120.000 g / mol.
    NOTA: Per ogni gel, tre valori estrapolati sarannogenerato (uno per ciascuno dei tre marcatori proteici utilizzati per generare le curve standard: 75, 100, e 150 kDa). Eseguire due ulteriori gel e macchia e quantificare ripetendo i passi 7,1-7,10. Con i risultati della quantificazione il primo gel, l'utente sarà in grado di valutare quanto rG4R1 deve essere caricato su ulteriori gel per produrre una quantità che è all'interno del range lineare degli standard proteiche. Complessivamente, estrapolare i nove valori che rappresentano la concentrazione di altamente attiva, purificata rG4R1. Media i valori per ottenere la concentrazione finale specifico-batch rG4R1, che è tipicamente nell'intervallo di 20-100 nM. Calcolare la deviazione standard da questi valori (n = 9).

Risultati

Questo protocollo (Figura 1) produce ordinariamente quasi puro, rG4R1 cataliticamente attivo. Come misura dell'attività enzimatica, si osserva tipicamente che il 50% di 0,2 pmol di TAMRA marcato G4-DNA tetramolecular viene convertito in monomeri all'interno del 0.2 - gamma ml 0,013 di rG4R1 come dosati con il saggio di attività G4 sopra descritto (Figura 2). Coomassie colorazione dei purificato rG4R1 indica una singola banda al 120 dimensioni kDa previsto, con una banda di con...

Discussione

Questo protocollo rappresenta un'espressione, purificazione e quantificazione schema altamente efficiente per l'isolamento del prodotto genico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36) (Figura 1). Questo protocollo utilizza due fasi di purificazione: His-tag affinità purificazione su perline affinità cobalto e purificazione enzimatica su perline G4-DNA-coniugato. Quest'ultimo passo è unico in quanto sfrutta l'affinità stretta, alta specificità e l'attività catali...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
TriEx4-DHX36 plasmid	Addgene	68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells	Novagen	71403-4
S.O.C medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Difco Terrific Broth	Becton Dickinson	243820
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C1919	35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested)	Sigma-Aldrich	C3416	50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma-Aldrich	I6758
Lysozyme (from chicken egg white)	Sigma-Aldrich	L6876
1 M Tris-HCl pH=8	Universal Scientific Supply Co.	1963-B	or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7	Universal Scientific Supply Co.	1966	or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8			For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8			For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8	Universal Scientific Supply Co.	1981	or From standard source
70% Ethanol			From standard source
Magnesium chloride (1 M solution)	Life Technologies	AM9530G
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750
20x SSC	Universal Scientific Supply Co.	1665	or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME)	Sigma-Aldrich	63689
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8849
Leupeptin hemisulfate	Sigma-Aldrich	L8511
Streptavidin paramagnetic beads	Promega	Z5482
0.5 M EDTA, pH=8	Universal Scientific Supply Co.	0718	or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6	Universal Scientific Supply Co.		From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk)	Sigma-Aldrich	L5385
Cobalt metal affinity beads	Clonetech	635502
L-Histidine	Sigma-Aldrich	H8000
Acetic acid, glacial	Fisher Scientific	A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source)	Sigma	A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1)	Biorad	161-0148
Glycine	Sigma-Aldrich	50046	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate	Universal Scientific Supply Co.	1667	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE	Sigma-Aldrich	11666703001	or From standard source
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1	to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED	Sigma-Aldrich	411019
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Broad Range Protein MW markers	Promega	V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio")	Oligos Etc		5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM")	Oligos Etc		5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate	Life Technologies	AM10110
Ficoll	Sigma-Aldrich	F2637	30% in H2O
Coomassie R-250	Sigma-Aldrich	27816
Methanol	Fisher Scientific	A412
Multiband UV lamp			Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor)			Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge			Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier	Branson		Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath			For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria			For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria			For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer			capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer			From standard source
PCR strip tubes			From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene)			From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml)			From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene)	Thermo Scientific	3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes			From standard source
Gel-loading tips			From standard source
Automatic repeating pipette			For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler			From standard source
Liquid Nitrogen			From standard source
Dry ice			From standard source
Laemlli sample buffer	Biorad	161-0737
Apparatus for running large slab gels	Biorad		We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet	Life Technologies	12301D	We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades			From standard source
Filter paper and funnel			From standard source
Glass casserole dish			From standard source
Orbital shaker			From standard source
Kimwipes			From standard source
Clear sheet protectors			From standard source
Scanner and associated TWAIN software			From standard source
Image analysis software			Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel			Or equivalent