דרך לא פולשנית לבודד תאים פנוטיפ מן הקונגרס

Summary

משטח העין הרגיל שנחשף מורכב קרנית ו הלחמית. תאי אפיתל, תאי גביע ותאי חיסון נמצאים בחניך. הנה, לא פולשנית, טכניקה של cytology הופעת מתואר באמצעות מכשיר cytology הרושם cytometry זרימה לנתח את תאי החיסון ב הלחמית.

Abstract

באופן מסורתי, cytology פני העין נלמד עם טכניקות כגון טכנולוגיית מרית ומברשת הטכנולוגיה. הבעיה עם טכניקות אלה היא שהם עלולים לגרום נגעים טראומטיים על פני העין, אשר יכול להתקדם הצטלקות, עיוות עפעף, חוסר תאי גזע limbal ובמקרים מסוימים, לגרום אי נוחות רבה לנושא. כדי למנוע בעיות קליניות אלו, פיתחה ציטולוגיה של הרושם (IC) לאבחון מחלות עיניים יבשות ומאוחר יותר נאופלזיה, מחלה אטופית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס ורידית וקרטוקו-גונקטיטיס סיקה. בדרך כלל, קלינאים לחתוך ידנית מסננים נייר לתוך צורות הנדרשים וליישם אלה על פני העין. כאן, אנו מתארים כיצד לבצע IC באמצעות מכשיר רפואי זמין מסחרית. טכניקה זו מוסברת כאן ואחריו immunophenotyping על ידי cytometry הזרימה. טכניקה זו דורשת טיפול ידני פחות גורם פחות פציעה על פני העין.

Introduction

Cytology ההופעה (IC) בוצעה לראשונה בשנת 1977 על ידי תאצ'ר ואח ' . הם השתמשו תקליטור פלסטיק כדי לאסוף תאים conjunctival מחולים במקום טכניקות אחרות הזמינות באותו זמן כגון גירוד, swabbing או pipetting ¹ . הטכניקה הנוכחית של IC משתמשת נייר מסנן סופג ² כדי להטביע את הנורה ואת הלחמית palpebral ולאסוף את השכבה השטחית ביותר של תאים conjunctival. תאים אלה, לאחר שהגיעו לשלב הסופי של ההבחנה שלהם, נשפכים ללא הרף בדמעות ³ . שלוש אוכלוסיות גדולות של תאים נמצאים דגימות IC: תאים אפיתל ⁴ , גביע תאים ^{3 , 5} , ואת רירית הלימפוזות הקשורים לימפויז דהינו אפיתל הקשורים המשפיע T תאים או תאים דנדריטים ⁶ . תאים פנימיים של העין ב- IC SamPles ניתן לנתח על ידי מיקרוסקופיה, חיסון סופג לאחור transcriptase פולימראז התגובה שרשרת (RT-PCR) ⁷ . זרימת cytometry שימש לאחרונה כדי לנתח תאים חיסוניים שנאספו על ידי שריטות קרום IC ⁸ . מעניין, IC ^{6 , 9} נעשה שימוש כדי להעריך הרבה מחלות פני השטח של העין כולל ceratoconjunctivitis sicca, מחסור בוויטמין A, pemphigoid cicatricial, מחלה atopic, מעולה keratoconctivivivivitis לימבית, דלקת קרטוקונאנגיוויטיס, ו metaplasia קשקשים אפיתל. IC שימש גם כדי להעריך את ההשפעה של עדשות מגע, גילוי חיידקי משטח העין, ובדיקת יעילות טיפולית וסובלנות של התערבויות טיפוליות במחקרים אורכיים ^{10 , 11 , 12} .

המכשיר הרפואי (EyePrim) נתמך על ידי סוג של פוליEthersulfone (PES) 0.2-מיקרומטר קרום, אשר כבר תוקף בעבר עבור הטכניקה של cytology ההופעה העין עם cytometry זרימה (זרימת OSIC) ופותח הזדמנויות להשתמש דגימה אורך כדי לפקח על התקדמות המחלה בתגובה לטיפול ( למשל , מפורט ניתוח של leukocytes intraepithelial שהוגדרו סמנים מחלה משוערת עבור פיברוזיג המפרק פרוגרסיבי ב פמפיגואיזם ממברנה רירית) ¹³ . חוקרים מוקדמים השתמשו במסנני PES אוטוקלאב הדורשים הופעה ידנית. כתוצאה מכך, התשואה הייתה משתנה ותלויית המשתמש. היתרון של מכשיר רפואי זה הוא קלות שימוש, לחץ סטנדרטי (Pa או N / m ² ), ומאפשר שחזור, שחזור, והתאוששות סלולרית עקבית. טכניקה זו שימושית במרפאת החוץ כי זה לא כירורגי, קל לביצוע מהיר. זהו מכשיר רפואי מסוג I (סטרילי) לפי ההוראה 93/42 / CEE, CE 0499 (SNCH). זה רק דורשS ההרדמה אקטואלי במהלך ההליך, אשר מבטיח שמירה על שלמות של משטח העין. בעקבות IC, תאים ניתן לעבד מיד cytometry הזרימה. יתר על כן, זה אפשרי עבור אופתלמולוגיה טכנאים ואחיות להיות מאומן למדגם את פני העין.

למרות השיפור של IC על פני טכניקות אחרות, נותרו מספר אתגרים. לדוגמה, ייתכן שיש וריאציה עקב אזור הדגימה והבדלים אזוריים של הלחמית bulbar בהתאם למיקום של IC. מקור נוסף של וריאציה נובע מיישום של לחצים שונים במהלך IC. בעיות מתודולוגיות אחרות כרוכות בסטנדרטיזציה של עיבוד התאים: אלה כרוכות בשיטה ובשיטה של ​​קיבוע, ובתנאי אחסון אפשריים, העלולים להשפיע על היציבות של החומר שנדגמו.

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לפתח שיטה של ​​בידוד של דגימות הרושם העין thaT הוא קל לשימוש, לא פולשני והוא יכול להיות מיושם על אפיון אימונולוגי של דגימות קליניות.

Protocol

כל הדגימות העין ששימשו במחקר זה נאספו מהמכון לבריאות העין במרכז הסינגפור הלאומי Eye Eye אושרה על-ידי המועצה המרכזית לבדיקות מוסדיות של סינגה-אינל (NH).

הערה: נבדקים עברו בדיקות קליניות על מנת להעריך את מידת הדלקת ואת חומרת התפקוד לקוי לפני ביצוע IC. המבחנים הקליניים כללו, בין היתר, בדיקות לאבחון פולשני לא-פולשני (NI-TBUT), ¹⁴ ו- Redmology (hyperemia) ^{15 , 16} שהוערכו באמצעות מכשיר אבחון, בדיקה של Schirmer ¹⁷ , בדיקת החולה הסטנדרטית של שאלת יובש העין (SPEED) ¹⁸ וקרנית מכתים ¹⁹ .

1. אוסף של דוגמאות עיניים על ידי IC

1. לאחר קביעת הסטטוס הקליני, להרדיםהעיניים של המשתתף על ידי יישום 1 - 2 טיפות של הרדמה מקומית, proparacaine hydrochloride, כדי הלחמית בולב מעולה נחות. המתן 4 - 5 דקות עבור תחושת עקצוץ של ההרדמה ללבוש.
2. איסוף דגימות משני הלחמית האף הזמני ואת הזרוע עם שני התקני cytology הופעה.
   הערה: מכשיר אחד משמש לאיסוף שני דגימות רושם. כאן, שני מכשירים שימשו אוסף של ארבעה קרום הופעות.
   1. מיקום מכשיר cytology הרושם משיק על הלחמית. לחץ על לחצן הדחיפה בעדינות והחזק ל 2 - 3 שניות.
      הערה: ההתקן מגיע עם הממברנה. הלחץ משוחרר באופן אוטומטי לאחר לחיצה על הכפתור. זה לוקח רק כמה שניות כדי לשחרר את הלחץ להסיר את המכשיר.
3. שחרר את הממברנה לתוך צינור microcentrifuge המכיל 1 מ"ל של התקשורת בתקשורת (Roswell Park Memorial Institute בינוני (RPMI) + 10% בסרום שור עוברית(FBS) + 1% פניצילין סטרפטומיצין (עט דלקת)) על ידי איזמל.
4. תאים לבודד מן הממברנה של המכשיר על ידי שריטות רציפה במשך כ 1 דקות עם עצה 10 פיפטה μL.
   הערה: גירוד הושלמה כאשר פני השטח של הממברנה הופך אחיד. מספרי התא מכל קרום הוא משתנה (100 - 500 תאים / קרום). תהליך דגימות בתוך 2 - 3 שעות של אוסף.

2. תאים Immunophenotyping ידי cytometry זרימה

1. צנטריפוגה התאים ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את התקשורת. Resuspend תא גלולה עם μL 50 של cytometry חיץ מכתים זרימה (פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) + 0.05% אלבומין בסרום שור (BSA)).
2. תאים של כתם עם פאנל של נוגדנים ( למשל , CD3 מבריק violet (BV) 510 (UCHT1), CD4 allophycocyanine-H7 (APC-H7) (SK3), CCR7 phycoerythrin (PE) -A, CD45RO PE- ציאנין 7 (PE- Cy7) -A, ו חי / מת סימן נייד 7-ADD) בטמפרטורת החדר למשך 20 - 30 דקות באפל. השתמש נוגדנים ישירות מהמלאי על פי פרוטוקול של היצרן.
   הערה: עבור ריכוז הנוגדן, השתמש 2.5 μL של CD3-BV510, 1.25 μL של CD4-APC-H7, CD45RO-PE-Cy7, 7-AAD ו 10 μL של CCR7-PE. השתמש בתאי mononuclear דם היקפיים (PBMCs) כדי טיטרציה ריכוזים שונים של נוגדנים. עבור טיטרציה, לקחת את הריכוז נוגדנים המוזכרים בפרוטוקול של היצרן ולהשתמש חצי ורבע הריכוז המומלץ. השתמש ריכוז מינימלי של נוגדנים כדי למנוע-לשפוך על ערוצי fluorochrome אחרים. אותות ברורים נצפו עם הריכוזים הנ"ל של נוגדנים. הפיצוי בוצע על ידי בדיקות PBMCs בתחילה על פי הפרוטוקול שהוזכר ויליאמס et al . ²⁰ לבדיקות, PBMCs הודגרו עם אותה קבוצה של נוגדנים בשימוש כאן פיצוי על ידי השוואת כתמי נוגדנים בודדים מרובים.
3. לאחר הדגירה periעוד, להוסיף 1 מ"ל של חיץ מכתים לצינור, לערבב היטב, צנטריפוגה ב XG 450 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאים Resuspend μL 200 של חיץ מכתים.
4. הפעל דוגמאות על מכונת cytometry זרימה.
   1. לפני רכישת הנתונים, לכייל את המתח זרימת cytometer ערוץ עם הגדרת cytometer ומעקב (CS & T) חרוזים לנרמל את רכישת הנתונים על ימים שונים לפי ההוראות של היצרן.
      1. פתח את זרימת cytometry נתונים אוסף תוכנה, לחץ על "הגדר & QC" כפתור, לבחור את הנכון CS & T חרוז מספר רב, לטעון את החרוזים, ולאחר מכן לחץ על כפתור "התחל".
   2. Resuspend תאים על ידי הקשה עדינה על הצינור לפני טעינת דגימות למכונה. פתח את תוכנת איסוף הנתונים ולחץ על "תצוגה מקדימה". כאשר קצב הסף יציב, לחץ על "רכש". צג רמת המדגם ולחץ על "עצור" כאשר דגימות נגמרים.
      הערה: רכישת 10,000 אירועים לכל מדגם.
   לאחר רכישת 10,000 אירועים, ליצור SSC-A ו FSC-A נקודה העלילה בגליון העבודה.
   1. לחץ על כפתור "מצולע שער" וצייר שער (זה P1) על כל האירועים עם ערך FSC-A> 5 x 10 ⁴ כדי להוציא פסולת. לחץ על "יצירת נקודה עלילה" כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר "מאפיינים" כדי לפתוח את "עורך מגרש", ולאחר מכן לבחור "P1". לחץ על FSC-A על ציר ה- X של מגרש P1 נקודה, לשנות את זה ל- CD3-BV510. צייר '' שער מצולע '' כדי לבחור את האוכלוסייה ⁺ CD3 בשם 'P2' '.
   2. לחץ על "יצירת נקודה עלילה" כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר "מאפיינים" כדי לפתוח את "עורך מגרש" חלון. לחץ על FSC-A על ציר ה- X של מגרש P2 נקודה ולשנות אותו ל -7 AAD. צייר '' שער מצולע '' עבור 7-AAD ^- האוכלוסייה ובחר '' P3 ''. P3 כאן הוא CD3 ⁺תאים חיים.
   3. לחץ על "יצירת נקודה עלילה" כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר "מאפיינים" כדי לפתוח את "עורך מגרש" חלון. לחץ על CD3-BV510 על ציר x ו- CD4-APCH7 על ציר y של מגרש נקודה P3. צייר שערי מלבן על החלק העליון והתחתון של הרבע ובחר 'P4' ו- 'P5' בהתאמה. P4 הוא חי CD3 ⁺ CD4 ⁺ ו P5 הוא חי CD3 ⁺ CD4 ^- T תאים.
   4. לחץ על "יצירת נקודה עלילה" כפתור כדי ליצור מגרש נקודה חדשה, לחץ לחיצה ימנית על כתם נקודה, בחר "מאפיינים" כדי לפתוח את "עורך מגרש" חלון. לחץ על CD45RO PE-Cy7 על ציר x ו- CCR7-PE על ציר ה- y של P4 ו P5 חלקות. צייר '' קוואד שער '' על מגרש זה נקודה.
      הערה: הצד השמאלי השמאלי העליון, הצד הימני העליון, הצד הימני התחתון בצד שמאל והרביע השמאלי בצד שמאל כאן הם נאיביים, זיכרון מרכזי (T _CM ), eזיכרון Ffector (T _EM ), זיכרון _{משפיע מובחן באופן סופי} (T _EMRA ) תאי T, בהתאמה.

תוצאות

IC על ידי מכשיר קליני זה אפשרה לנו לבודד את תאי החיסון של פני העין, תוך שמירה על פני העין ללא פגע. איור 1 מתאר כיצד בוצע ה- IC. האתרים השונים של העין ממקום איסוף הדגימות מסומנים. איור 2 מציג תוצאה נציג של cytometry הזרימה שנאספו 10 פקדים בריאים. עבור gating, להשתמש SSC ו 7-AAD להבחין בין תאים חיים מתים. 7-AAD ^- תאים מזוהים כתאים חיים. תאים חיים אלה מאופיינים עוד יותר על ידי CD3 ⁺ ו CD4 ⁺ סמנים. יתר על כן, CD4 ⁺ ו CD4 ^- אוכלוסיות היו כל עוד מאופיינים כמו Naïve, T _EM , T _CM ו T _EMRA עם CCR7 ו CD45RO סמנים. בין תאי CD3 ⁺ T, זיכרון T ממריץ תאים שולטים על פני העין האנושית. בXperiments, זה הוכח גם כי תאים CD8 ⁺ זיכרון הם האוכלוסיות העיקריות בתאי T אפיתל T בציבור בקרב אנשים בריאים ²⁰ . איור 3 מראה כי CD4 ⁺ ו CD8 ⁺ זיכרון זיכרון תאים T (T _EM ו- T _EMRA ) הם המשנה העיקרית של פני העין האנושית ב -10 בקרות בריא למד. כל האוכלוסייה שהוזכרו בדמות מקבלים הודעה עם הפנוטיפ שלהם ואת השמות שלהם (נאיבי, T _CM , T _EM , T _EMRA ). המספרים באדום מציינים את אחוז האוכלוסייה. הנתונים בנתון זה מיוצגים כ- ± SEM ממוצע

איור 1: אוסף של דגימות IC מן משטח העין על ידי מכשיר cytology ההופעה. דוגמאות נאספו מהנורה הזמניתבאזור ar כמוצג.

איור 2: תרשים גרף נקודה באמצעות cytometry זרימה. Live 7-AAD ^- תאים נבחרו. תאי ה- CD3 ⁺ היו נשלטים תחילה, ואז אוכלוסייה זו נשלטה לתוך תת-מערכות CD4 ⁺ ו- CD4. הפרופורציות של נאיבי (CCR7 ⁺ CD45RO ^- ), זיכרון מרכזי (CCR7 ⁺ CD45RO ⁺ ) וזיכרון זיכרון (CCR7 ^- CD45RO ⁺⁾ ; CCR7 ^- CD45RO ^- ) תת קבוצות נקבעה בעזרת CCR7 ו CD45RO סמנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

FIgure 3: תאים חיסוניים תת סוגי CD4 ⁺ ו CD8 ⁺ T תאים של פני אדם בריאים אנושיים. התפלגות CD4 ⁺ ו CD8 ⁺ זיכרון נאיבי, זיכרון מרכזי (T _CM ), וזיכרון זיכרון (T _EM ו- T _EMRA ) תת שולט בבקרות אנושיות בריאים; כל נקודת נתונים מייצג יחיד בודדת מתכוון ± SEM מוצג. אחוז האוכלוסייה מסומן באדום מתחת לשמה של כל אחת מהאוכלוסיות. האחוז הכולל של האוכלוסייה הוא 98%, משום _{שאוכלוסיית} CD4 ⁺ T _EMRA לא נכללה _במפזר הנ"ל (שונה מ- Bose et al ²¹ ). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

זוהי טכניקה קלה, מהירה ופחות פולשנית, שניתן להשתמש בה במרפאות החוץ של המטופלים לצורך איתור פרופיל החיסוני המהיר יחסית לטכניקות הקונבנציונאליות כגון גירוד, ניסור, פיפטינג או נייר סינון סופג ^{1 , 2} . וריאציה של טכניקה זו כבר בשימוש הגדרות המחקר ²² . היישום העתידי של המתודולוגיה המוצעת הוא עבור ריבוד המטופל בניסויים קליניים עם מחלות עיניים, במיוחד אלו הדורשות אימונופנוטיפינג.

האתגר העיקרי עם טכניקה זו היא תאים חיסוניים מעטים יחסית לאחזר לאחר אוסף רושם ו scraping. המספר הכולל של תאי T3 CD3 התאושש מארבע הופעות לכל אדם מגוון מ ~ 500-1000 תאים. דגימות העין נשטפו לפני ניתוח cytometry זרימה עבור מספר מינימלי של פעמים, כדי למנוע אובדן נוסף של התאS. צעדים קריטיים ואתגרים שנותרו בפרוטוקול הם אוסף יעיל של דגימות עיניים וגירוד הנכון של הממברנה כדי להשיג מספרי תאים גבוהים יותר. עם זאת, הגבלה זו אינה צפויה הטיה כלפי כל פנוטיפ החיסונית ספציפי. פתרון הבעיות שבוצע כאן כדי למקסם את התשואה של התאים היה להפחית את מספר צעדים כביסה לאחר הדגירה של נוגדנים.

קיימות מגבלות אחרות לשימוש ב- IC. בחולים עם משטח העין הקרטני או קשות, כמו בתסמונת סטיבן ג'ונסון, התשואה הסלולרית עשויה להיות אפילו נמוכה מזו שבמחקר זה. חלקם של תאים החיסון עשוי להשתנות אם הדגימות מאוחסנים במקום לנתח באותו יום. קשה לנבא אם סוגי תאים מסוימים עמידים יותר לאחסון מאשר לאחרים. מחקרים קודמים דיווחו על רמות גבוהות של ביטוי HLA-DR בתאי אפיתל הלחמית ²³ , כך שזה יהיה interEsting כדי להעריך את המתאם בין HLA-DR לבין רמות של תאים חיסוניים ספציפיים. תאים חיסוניים עשויים להיות קשורים גם עם רמת הביטוי של chemokines. יש להתייחס לנושאים אלה במחקרים עתידיים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
anti-human CD3 BV510	BD Biosciences	563109
anti-human CD4 APCH7	BD Biosciences	641398
anti-human CD45RO PECy7	BD Biosciences	337168
7-AAD solution	BD Biosciences	555816
anti-human CCR7 PE	BD Biosciences	552176
Pippetes	Eppendorf	NA
Local Anaesthesia	Alcaine	NA
Fluorescein sodium solution	Bausch & Lomb U.K Limited	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Keratograph 5M	Oculus	NA
Slit lamp BioMicroscope	Haag Streit	BM900
EyePrim	Opia Technologies	NA
FACS Verse	BD BioSciences	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Softwares
GraphPad 6.0	Prism	NA
FACSVerse analysis software	BD	NA