הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Summary

ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.

Abstract

מיקרוטובולים דינמיים הם היסוד תהליכים תאיים רבים, ועל מדידות מדויקות של הדינמיקה microtubule יכול לספק תובנות לגבי האופן שבו תאים מווסתים תהליכים אלה וכיצד הרגולציה ההשפעה הגנטית מוטציות. כימות של דינמיקה microtubule במודלים מטזואניים יש מספר אתגרים הקשורים, כולל צפיפות ומגבלות microtubule גבוהה על מניפולציות גנטיות. לעומת זאת, המודל שמרים הניצנים מציע יתרונות כי להתגבר על אתגרים אלה. פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הדינמיקה של מיקרוטובולים יחיד בתאים חיים שמרים. תאים המבטאים טובולין מתויג fluorescently הם דבקו תאי שקופית התאספו, המאפשר רכישת תמונה יציבה זמן לשגות. מדריך מפורט על מהירות גבוהה, רכישת תמונה ארבע-ממדית מסופק גם, כמו גם פרוטוקול לכימות המאפיינים של מיקרוטובולים דינמי ערימות התמונה confocal. שיטה זו, בשילוב עם גנטיקה שמרים קונבנציונאלי, Provאידו גישה מתאימה באופן ייחודי להערכת ההשפעות כמותית של רגולטורי microtubule או מוטציות המשנים את הפעילות של יחידות משנת טובולין.

Introduction

Microtubules הם פולימרי cytoskeletal עשויים יחידות משנת חלבון αβ טובולין ו משמש במגוון רחב של קשרים הסלולר, כולל הובלה תאית, חלוקת תא, morphogenesis, ואת תנועתיות. כדי לבנות רשתות microtubule לתפקידים מגוונים אלה, תאים חייבים להסדיר בזהירות היכן ומתי טופס מיקרוטובולים. תקנה זו מושגת על ידי שליטה על התגובות כי גם להרכיב יחידות משנה αβ טובולין לתוך פולימרים microtubule או מיקרוטובולים לפרק לתוך תת-יחידות חינם; זה נקרא דינמיקת microtubule.

יעד מרכזי של שדה microtubule הוא להבהיר את המנגנונים המולקולריים מווסתים דינמיקת microtubule, כולל מחקרים של תת-יחידות-טובולין αβ ורגולטורים חיצוניים אשר נקלטים על ידי טובולין ו / או מיקרוטובולים. גישה ניסיונית ומבוססת היא לשקם מערכת זו במבחנה באמצעות חלבון αβ טובולין מטוהר, לעתים קרובות combination עם רגולטורים חיצוניים מטוהרים. למרות שמדובר בגישה שימושי, ברור כי הדינמיקה microtubule במערכות מחדש שונה מאוד מזו שנצפתה תאים חיים. לדוגמה, microtubules לגדול מהר יותר להתכווץ לאט in vivo מ במבחנה. הבדלים אלה ניתן לייחס את הזמינות של רגולטורים חיצוניים ידועים ^1, כמו גם לגורמים-מוגדרים עדיין בתאים. לכן, חשוב לקבוע את פעילות רגולטורי microtubule מוטנטים משבשי דינמיקה בהקשר הסלולר ילידים.

למרות מודלים מטזואניים שהוכחו המערכות מרוויחות על חקירת פונקצית microtubule וארגון מסדר גבוה, כמה חששות מעשיים קשות להגביל את השירות של מודלים אלה עבור המדידה המדויקת של דינמיקת microtubule. ראשית, המספר הגבוה של מיקרוטובולים, החל מעשרות אלפי לכל תא, מקשה בביטחוןלעקוב מיקרוטובולים בודדים לאורך זמן. מחקרים רבים בהתמודדות עם אתגר זה באמצעות הדמיה חלבונים כי למקם באופן סלקטיבי הקצוות microtubule, כגון חלבונים במשפחה מחייב-סוף (EB). עם זאת, חלבונים אלה ידועים למקם רק עד הקצה גוברת מיקרוטובולים ב metazoans ^2. לכן, השירות של חלבונים אלה מוגבלים מדידה ישירות שיעורי צמיחה, תוך עקיפה בלבד למדידת היבטים אחרים של דינמיקה, כגון תדירות הקטסטרופה. שנית, למרות ההתקדמות הטכנולוגית העריכה בגנום, יצירת תאים ביציבות להביע fluorescently שכותרתו טובולין או החדרת מוטציות לתמרן טובולין או microtubule הרגולטורים סלקטיבי עדיין מהווה אתגר משמעותי. יתר על כן, נוכחותם של isotypes טובולין רב metazoans מקעקע החקר כיצד מוטציות להשפיע גני טובולין פרט.

מערכת שמרי הניצנים מספקת מספר יתרונות חשובים למדידה ב microtubu vivoדינמיקת le. שמרים יש רשת microtubule פשוטה המאפשרת הדמיה של מיקרוטובולים הפרט. בשמרים, microtubules נובע ארגון מרכזי המכונה גופי מוט ציר (SPBs), אשר מוטמעים מעטפת גרעין ^3. SPBs לשמש פיגומי מתחמים קטנים טובולין γ כי nucleate מיקרוטובולים ^{4, 5.} SPBs nucleate שתי כיתות של מיקרוטובולים, microtubules ציר ו microtubules האסטרלי. Microtubules ציר הפרויקט לתוך nucleoplasm והם חשובים עבור הצמדת הכרומוזומים באמצעות מיקרוטובולים קינטוכור לייצוב ציר דרך חופפים מיקרוטובולים interpolar ^6. בניגוד לכך, פרויקט מיקרוטובולים אסטרלי החוצה לתוך cytosol והם נדירים יחסית בהשוואה לרשת הצפופה של microtubules ציר. במהלך מיטוזה, תאים טרום anaphase יש רק 1-2 מיקרוטובולים אסטרלי הבוקע משני SPB; אלה קיימים כמו שאנימיקרוטובולים ndividual ולא כמו חבילות ^7. תפקידיו של מיקרוטובולים אסטרלי במהלך מיטוזה הוא להעביר את הגרעין ואת הציר לתוך הצומת בין תאי אמא ניצן, המכונים צוואר הניצן. תנועה זו כרוכה מסלולים מוגדרים היטב שיוצרים כוח על מיקרוטובולים אסטרלי, מושכים את הגרעין ואת הציר כלפי ובסופו של דבר לתוך ניצן הצוואר ^8.

יתרון נוסף של המערכת שמרים הוא כלי הגנטיקה שלה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לחקור הרגולטורים microtubule ואת יחידות משנה טובולין עם דיוק ללא תחרות. שמרים גם בעלי רפרטואר פשוט של isotypes טובולין: סינגל β טובולין גן (TUB2) ושני גני α-טובולין (TUB1 ו TUB3). מוטציות יכולות להיות הציגו בקלות לתוך הגנים הללו ולמדו ובכך באוכלוסיית טובולין הומוגנית ^{9, 10.} ישנם מספר נרחבבונה זמינה עבור microtubules תיוג, והוא יכול להיות ממוקד אלה לשילוב בבית הלוקוסים כרומוזומליות לביטוי יציב (ראה דיון).

המטרה הכוללת של שיטה זו היא מיקרוטובולים יחיד תמונה בתאים חיים שמרים בארבעה ממדים (X, Y, Z, ו- T) למדידות ברזולוציה גבוהה של דינמיקת microtubule. שיטות לשילוב בונים עבור הביטוי המכונן, ברמה הנמוכה של טובולין שכותרתו fluorescently בתאי שמרים מתוארות. לפני הדמיה, תאים חיים הם רכובים לתוך תאי שקופיות מצופה לקטינים concanavalin א לייצב את התאים עבור הדמיה לטווח ארוך. הפרמטרים האופטימליים לרכישת תמונה, כמו גם עבודה לניתוח נתונים, מתואר גם.

Protocol

1. הכנת צלחות נשירה -LEU

1. מוסיפים 800 מ"ל מים סטריליים, ללא יונים (DiH ₂ O) בבקבוק L 2. להוסיף 26.71 גרם של בסיס נשיר אבקה (תאריך הלידה), 0.69 גרם של CSM-Leu, ו 20 גרם של אגר. מערבבים עם בר ומערבבים מגנטי. מביאים 1 L עם DiH ₂ O.
2. חיטוי ב 121 ° C ו 19 psi עבור 30 דקות.
3. הסר את הבקבוק מן החיטוי ולאפשר לו להתקרר ~ 65 ° C עם ערבוב עדין.
4. יוצקים 30 מ"ל / צלחת לתוך צלחות בקוטר 100 מ"מ. תנו אלה לשבת בטמפרטורת החדר למשך 36-48 שעות לפני אחסון ב- C ° 4.

2. שילוב GFP-Tub1 עבור ביטוי המכונן של טובולין GFP שכותרתו

1. מרתיחים ריכוז מלאי של 10 מ"ג / מ"ל ​​חד-גדילי דנ"א (ssDNA) עבור 3 דקות.
2. שלב 2 μL של ssDNA המבושל עם 400 ננוגרם של DNA פלסמיד ה- GFP-Tub1 המטוהר ^11.
   הערה: יש מגוון של פלסמידים שיכולים לשמש עבור התיוג היציב, פלורסנטשל מיקרוטובולים בשמרים כי לנצל fluorophores חלופה וסמנים לבחירה. כמה חלופות אלה מתוארים בסעיף הדיון.
3. מוסיף את תערובת DNA כדי aliquot 50 μL של תאי שמרים מוסמכים.
   הערה: הכן תאים שמרים המוסמכות עם פתרון סורביטול (SORB; 100 מ"מ LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 מ"מ EDTA pH 8, ו 1 M סורביטול, מותאם עם חומצה אצטית מדוללת ל- pH 8). לתיאור מפורט של הפיכת תאי שמרים מוסמכים, ראה התייחסות ^12.
4. וורטקס ביסודיות.
5. להוסיף 6x הנפח הכולל של פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון (100 מ"מ LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, ו 40% PEG3350) לתערובת DNA תאים.
6. וורטקס ביסודיות.
7. דגירה של 1 h לפחות 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
8. להוסיף sulfoxide דימתיל (DMSO) כדי 10% מנפח מערבולת הכולל.
9. לדגור על 42 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
10. צנטריפוגה ב 2500 XG במשך 5 דקות.
11. הסר את supernatant להשעות את התאים 100 μL של DiH ₂ O.
12. תאי פלייט על צלחת נשירה -LEU.
    הערה: מבנה GFP-Tub1 מכיל סמן auxotrophic לאוצין, בעוד מבנים אחרים יכולים להשתמש סמן חלופה. מדיום הנשירה צריך להיות ספציפי סמן auxotrophic של המבנה.
13. אפשר התאים שינו לגדול במשך 3-5 ימים ב 30 מעלות צלזיוס.
14. Re-פס מושבות טרנספורמציה יחידות על צלחת נשירה -LEU טריה על ידי העברת מושבות באמצעות קיסם לעקר. דגירה את צלחת הלילה ב- C ° 30.
15. מבחינה ויזואלית במסך בכל transformant עבור אות GFP ידי השעיית כ 1 μL של תאים ממושבה אחת מהצלחת בשלב 2.14 ב 2 μL של מים בשקופית נקיה. מכסים את התאים מושעה עם coverslip ולבחון באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
    1. להלהיב את transformants עם אור 488 ננומטר ולחפש בנוכחות אות ה- GFP.
       הערה: שלב זה יכול להשתמש במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב, אבל מיקרוסקופ widefield מצויד מטרה 100X ואופטיקה מתאים הדמיה GFP יספיק. תאים ללא מיקרוטובולים GFP שכותרתו גלוי, או אלו עם קרינה גבוהה באופן חריג, להידחות. אחרי זה, זני שמרים מוכנים להיות מתורבת עבור הדמיה.

3. תרבית שמרים נוזלי Growing

1. לחסן ~ 1 μL של תאים שמרים ממושבה יחידה על צלחת ב 3 מיליליטר של מדיום להשלים סינטטי. אפשר התאים לגדול לילה בשעה 30 ° C עם רועד ב 250 סל"ד.
2. לדלל את התרבות הרוויה למחרת כדי OD ₆₀₀ של <0.1 במדיום. מחזירים את התרבות מדולל על שייקר C 30 ° 3-4 שעות או עד OD ₆₀₀ הוא בין 0.4 לבין 0.8, כאשר התאים מוכנים להיות טעון לתוך תאי הדמיה.

4. הכנת תזרים לשכת שקופיות

1. גזירהגיליון של הסרט פרפין לתוך חתיכת 4 ב רחב 7 ב ארוך.
2. מקום שקופית מיקרוסקופ רגיל לאורכם על רוחב 4 אינץ של סרט פרפין לעטוף את הסרט סביב המגלשה 3-4 פעמים כאלה כי השקופית מכוסית בסרט כי הוא עבה 3-4 שכבות. מהדק את השכבות יחד כדי להבטיח ישנו חותם סביר; זה יקל לחתוך. הימנע לחיצה קשה מדי או גרימת הסרט להתקמט.
3. חותכים את הסרט פרפין בשולי מחוץ לשקופית באמצעות גילוח חותך תיבת נקי. להשתמש בשקף אחר כדי לספק קצה ישר לחיתוך.
4. מקלף את הסרט העודף מעל השקופית עובדת וזורקים. הערימות הנותרות של סרט תכסינה הפנים לאחד השקופיות תשמשנה על מנת להפוך את הקירות בין תאי הדמיה.
5. באמצעות השקופית השנייה בתור קצה ישר, לחתוך את שכבות סרט המוערמות לאורך ציר זמן של השקופית לתוך כעשר רצועות, כל 2-4 מ"מ הרוחב.
6. חותכים את שכבות הסרט פרפין מוערמים בניצבהקיצוצים שנעשו בשלב 4.5, לאורך הציר הקצר של השקופית, כדי ליצור רצועות 2-4 מ"מ רוחב, 23-24 מ"מ אורך, ו 3-4 שכבות עבות.
7. קולפים את רצועות לחתוך באמצעות סכין גילוח בזווית 45 מעלות. בעזרת מלקחיים, שווה להפיץ את רצועות סרט לגזור על שקופיות מיקרוסקופ נקיות כדי ליצור את המספרים הרצויים של תאי. עד 3 תאים (עשו עם 4 רצועות פרפין סרט) ניתן ליצור בשקופית אחת.
8. מניחים coverslip יחיד על גבי רצועות של הסרט ולהעביר אותה במקומה באמצעות מלקחיים.
9. מניחים את השקף מוכן, coverslip עד, על פלטה חמה להגדיר ב ~ 95 ° C (זה בערך ההגדרה נמוכה בינונית ברוב כיריים). מחממים את השקופית עד רצועות הסרט הם שקופים (כ 3 דק ') ולאחר מכן לאטום את שקופיות coverslip יחד על ידי לחיצה בעדינות על coverslip עם פינצטה.
   הערה: חשוב לעיתונות רק על האזורים של coverslip כי הם ישירות מעל רצועות סרט פרפין, כמו גירוד באזורים מעל גhambers יכול להקטין את איכות התמונה. יש להקפיד לא לחמם יותר מדי את השקופית; הסרט יהיה מתאדה המעיל הפנימי של החדר עם סרט הידרופובי שמונע את התאים מפני הדבקות.
10. שימוש במלקחיים כדי להסיר את השקופית מן הפלטה החשמלית (המגלשה תהיה חמה) ולהגדיר אותו בצד להתקרר עם צד coverslip פונה כלפי מעלה; כשקופית מקררת, הסרט יחזור גוון לבן, אטום.
    הערה: בשלב זה, את השקופיות מוכנות להיות עמוסים תאיים שמרים מתורבתים. שקופיות נוספות יכולות להתבצע בשלב זה ומאוחסנים במיקום נקי ויבש יותר ללא הגבלת זמן.

5. בתאי שמרים טוענים לתוך שקופיות לשכת תזרים הוכנו

1. הפשרה aliquot קפוא, 200 μL של concanavalin A (2 מ"ג / מ"ל ב DiH ₂ O סטרילי).
2. להוסיף כ 100 μL של A concanavalin מופשר לכל תא של השקופית שהוכן על ידי pipetting לתוך אחד הקצוות הפתוחים. להוסיף מספיק concanavalin א למלא את התא. בשביל זה זהTEP, א concanavalin יימשך דרך התא באמצעות כוח הנימיות.
3. לתלות את השקופית, למטה coverslip, בין שני מתלים microfuge צינור או עטים עבור 5 דקות כדי לאפשר א concanavalin לדבוק coverslip (כלומר, התא).
4. חזרה לשקופית למיקום coverslip-אפ. שטפו את החדר עם 2x נפח תא (שנקבע בשלב 5.2, לעיל; כ 200 μL) של המדיום להשלים סינתטי להסיר את א concanavalin
   1. זרימת המדיום דרך התא, או באמצעות בפינה של מגבת נייר או נייר פילטר מקופל לשניים, כדי לשאוב נוזל מתוך בקצה אחד של החדר תוך pipetting נוזל טרי זמנית לתוך השני. לחלופין, להשתמש aspirator ואקום כדי לשאוב נוזל בקפידה מתוך בקצה אחד בעוד pipetting נוזל טרי לתוך השני.
5. תאי עומס ידי זורם 2x נפח התא (כ 200 μL) של השעית תא (משלב 3.4) באמצעות metho הזרימה המכוונתד שמתואר בשלב 5.4.1.
   הערה: המטרה היא תמונת שכבת תאים אחת על coverslip. לכן, חשוב לטעון ריכוז של תאים קטנים מספיק שהם לא להעמיס על גבי זו, אבל גדולים מספיק תאים מספיק נוכחים בתחום לאסוף את הסכום המקסימאלי של נתונים לרכישת תמונה. הריכוז האופטימלי של תאים בתוך החדר יכול להשתנות וצריך להיקבע באופן אמפירי. כדי להגדיל את הריכוז של תאים בתא הזרימה, בעדינות גלולה תרבית תאי XG ב 1000 עבור 2 דקות ולהסיר חלק supernatant. כדי להקטין את הריכוז של תאים, להוסיף בינוני להשלים סינטטי טרי השעית התא. הריכוז של תאים ניתן להעריך אחרי צעד 5.7 (להלן) באמצעות בדיקת ה- הקאמרית על מיקרוסקופ לעומת שלב. בשלב זה, תאים נוספים ניתן להוסיף לתא ידי זורם השעיה סלולרית יותר. עם זאת, הפחתת צפיפות תאים בשלב זה היא לא ריאלית ולא מושגת הטובה על ידי טעינה קאמרית חדשה עם השעית תא מדוללת.
6. לתלות את coverslip למטה שקופיות, כפי שמתואר בשלב 5.3, עבור 10 דקות כדי לאפשר לתאים לדבוק coverslip.
7. ממאורותיהם תאים unadhered ידי זורם דרך 4x נפח תא (כ 400 μL) של המדיום להשלים סינתטי. זה יבטל תאי "פנויות" בתא, אשר יכול לזהם רכישת תמונה.
8. בזהירות לייבש כל סוף הקאמרי עם פינה נקיה של מגבת נייר, להביא את המניסקוס לקצה של coverslip.
9. חותם בכל קצה של החדר עם חם (75 מעלות צלזיוס) איטום (למשל, VALAP; בחלקים שווים וזלין, צמר שעווה, שעוות פרפין).
   הערה: בשלב זה, את השקופית מוכנה תמונה. התאים ניתן הדמיה של עד 9 שעות, תלוי בצפיפות של תאים בכל תא. התאים ייצרו דו תחמוצת הפחמן (CO ₂₎ לאורך זמן, אשר בהדרגה תיצור בועות כי דוחקות את התאים.

התחת = "jove_title"> 6. רכישת תמונה

1. תביאו את השקופית מיקרוסקופ הפוכה מצויד מטרה 1.45 NA 100X CFI תוכנית Apo, במה פיזואלקטריים, יחידת סורק confocal דיסק מסתובב, לייזר תאורה, ואת המצלמה EMCCD. לשמור על טמפרטורה של השלב בטמפרטורת החדר (25 מעלות צלזיוס) במהלך הרכישה.
   הערה: מספרי הצמצם הגבוה מאפשר רזולוציית תמונה גדולה יותר, ועל הבמה פיזואלקטריים מאפשרת מהירות גבוהה Z- מחסנית רכישה. דרישות מיקרוסקופ המינימום הן מטרת 100X, ליזר התאורה, ואת מצלמת EMCCD.
2. תביאו את התאים אל המוקד. ודא שהשדה הרכישה יש לפחות 5-6 תאים מקובצים יחדיו על ידי חיפוש השקופית עבור תאים מקובצים יחד.
   הערה: למרות שזה לא הכרחי לתמונה יותר מתא אחד בכל פעם, מספר תאי הדמיה באותו השדה משפר את היעילות של רכישת נתונים מבלי לפגוע באיכות נתונים. עם זאת, חשוב כיתאים הם באותו מישור המוקד ולא נערמו על גבי זו.
3. לתכנת רכישה רבה-ממדי כדי לאסוף z-סדרות מרובות לאורך זמן.
   1. התאם את ההגדרות בתוך גדרות רכישה הפעילות הבא: עומק-Z הכולל = 6 מיקרומטר, כדי להקיף את התא שמרים כולו; Z-צעד size = 300 ננומטר, על מנת למקסם את אוסף אור ללא דגימת יתר; משך הזמן הכולל = 10 דקות; זמן במרווחים = Z-series כל 4 s; וזמן חשיפה = 90 מילישניות לכל z-מטוס.
      שים לב: בפעם החשיפה אופטימלית תשתנה בהתאם למצלמה, מקור אור העירור, וגורמים נוספים. באופן כללי, את זמן החשיפה האופטימלי יהיה הפעם המינימאלית הדרושה כדי להשיג 3: יחס 1 של אות מ מיקרוטובולים אסטרלי GFP שכותרתו לאותת מן הציטופלסמה בוסס על ערכי פיקסל נמדדים EMCCD.
4. בגין הרכישה על ידי לחיצה על "הפעל". לאפשר לו לפעול למשך 10 דקות מלאות. שמור את הנתונים כתמונההסדרה (.tiff או .nd2).
5. בחר תחום חדש לתמונה בתוך התא וחזור על שלבי 6.2-6.4.
   הערה: תא יחיד אמור להניב בין 15 ו 20 שדות של תאים, בהתאם לצפיפות התא בתוך התא. צפיפות תא גבוהה תניב שדות כוללים נמוכים, כמו CO ₂ בתא יהיה לבנות מהר.

ניתוח תמונה 7.

1. פתח את קובץ התמונה ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) בתור hyperstack באמצעות תוסף יבואן ביו-פורמטים.
   1. ImageJ פתח לגרור את ערימת התמונה רכשה ממדור 6 ישירות על לוח הבקרה. היבואן ביו-הפורמטים יתחיל באופן אוטומטי. בחר "אוקי" כדי לטעון את המחסנית תמונה בתור hyperstack.
      הערה: ההודעה "ביו-פורמטי אפשרויות יבוא" תפתח ולהבטיח כי תחת "Stack צופה" בסעיף, "צפו מחסנית עם:" מוגדרת "hyperstack"; ו "להזמין מחסנית:" מוגדר "XYCZT."
2. כווץ כל Z-series לתוך בעוצמה מקסימלית, הקרנה 2-ממדית באמצעות הפונקציה פרויקט-Z.
   1. בחרו בתפריט "תמונה", תפריט המשנה "Stack", והתכונה "Z-פרויקט". בחר "הקרנה מקסימלי" מהרשימה הנפתחת ולחץ על "אישור".
3. החל מסנן חציון אל ערימת התמונה כדי להקטין רעש שנקר על ידי בחירת תפריט "התהליך", תפריט המשנה "מסננים", ותכונת "החציון". זן 2.0 פיקסלים לתוך תיבת הרדיוס ולחץ על "אישור".
4. זיהוי תאים טרום anaphase בתחום.
   הערה: אלו מאופיינים ניצני בינוניות ציר המיטוטי קצר, 1-1.5 מיקרומטר אורך (איור 1; נקודות ראש החץ על ציר המיטוטי קצר). תאים בשלב זה הם אידיאליים עבור ניתוח הדינמיקה microtubule משום שהם בדרך כלל מציגים רק Feמיקרוטובולים אסטרלי w נובעת הקטבים ציר ^7. מיקרוטובולים אסטרל ניתן לזהות כמו סיבים ליניארי כי התערוכה עוצמת אות ה- GFP אחידה מסוף מינוס, על SPB, עד סוף פלוס, בציטופלסמה.
5. החל ב timepoint הראשון של סדרת התמונה, השתמש בכלי הקו המפולחים לצייר קו לאורך microtubule יחיד אסטרלי, מסוף מינוס, הממוקם בצומת בין microtubule האסטרלי לבין microtubules ציר שכותרתו ביתר שאת, עד הסוף פלוס , המהווה בציטופלסמה (ראה את הקווים האדומים באיור 1). לחץ פעמיים על סוף microtubule כדי להשלים את קו מפולח.
6. רשום את המדידה בטבלת התוצאות באמצעות התכונה "מידה" על ידי לחיצה על הכפתור "M" במקלדת.
   הערה: תכונות נוספות, כגון עוצמת אפורה, ניתן להקליט על ידי קביעת המדידות בתפריט "לנתח" ו "מדידות Set" תפריט משנה.
7. להתקדם timepoint הבא על ידי לחיצה על החץ ימינה בבר-מחוון Z או לחיצה על המקש "./>" במקלדת. חזור על שלבים 7.5 ו 7.6 עבור כל timepoints ברצף תמונה.
8. העתק את נתוני טבלת התוצאות ולהדביק אותם לתוך גיליון אלקטרוני. שמור את הנתונים על ידי בחירה "שמירה בשם".
   הערה: מדידות אלה תכלולנה ערכים כמה, אבל הערכים החשובים ביותר הם פרוס, אשר מציין את timepoint בסדרה, ואת האורך, אשר מציין את אורך הקו (כלומר, את microtubule האסטרלי). עמודות המכילות מדידות אחרות (למשל, באזור, אומר ערך פיקסל, זווית, וכו ') יכול להשאיר או מושלך.
9. צור עמודה חדשה בגיליון האלקטרוני על ידי לחיצה ימנית ו באמצעות הפונקציה "הכנס". קלט את הזמן (ים) של כל timepoint.
10. צור עלילת פיזור XY של אורך microtubule (מיקרומטר) כפונקציה של זמן (ים) באמצעות "הקו הכנסתרשים" תכונה; לבחור את מדידות האורך כמו 'Y', וטור הזמן כמו 'איקס'
    1. לזהות אזורים של פילמור, depolymerization, ואת הפסקה ידי מחפש שינויים חיוביים ושליליים באורך לאורך זמן על פיזור העלילה משלב 7.10.
       הערה: אירועים פלמור להגדיל אורך microtubule ידי לפחות 0.5 מיקרומטר פני מינימום של 3 timepoints ולהשתלב רגרסיה ליניארית עם R ² ≥ 0.9 ו R-ערך> 0 (איור 1B ו- D, נקודות ירוקות). אירועי Depolymerization להקטין אורך microtubule ידי לפחות 0.5 מיקרומטר פני מינימום של 3 timepoints ולהשתלב רגרסיה ליניארית עם R ² ≥ 0.9 ו R-ערך <0 (איור 1B ו- D, נקודות ורודות). אירועים השהה נפרדים פילמור depolymerization. השהיות מוגדרות שינויים נטו באורך microtubule פחות מ 0.5 מיקרומטר פני מינימום של 3 timepoints;מתאים רגרסיה ליניארית עם ערך R בין -0.4 ו 0.4; ויש מדרון כי אינו שונה סטטיסטית מאפס, כפי שנקבע על ידי מבחן F.
    2. באמצעות פיזור העלילה כמדריך, לזהות את החלקים של זמן כאשר השינוי באורך חיובי ולהאיר אותם בצבע ירוק. דגש אזורים של זמן כאשר השינוי באורך שלילי בצבע ורוד.
    3. חשב את רגרסיה ליניארית של כל מסומן סעיף ולהקליט את -Value ² R- ו R עבור כל מקטע בעמודות הפרוקסימלי אזורים. לסווג כל אזור בצבע כמו גם אירוע פילמור או אירוע depolymerization.
11. חשב את שיעורי פילמור על ידי חלוקת השינוי נטו אורך ידי שינוי זמן עבור כל אירוע צמיחה. רשום תוצאות אלה בעמודה בצמודה לערכי רגרסיה ליניארית משלב 7.10.3.
12. חשב את שיעורי depolymerization ידי חלוקת השינוי נטו אורך ידי שינוי זמן לכל shrinkinהאירוע גרם. רשמו תוצאות אלה בעמודה בצמוד לערכים שיעור פילמור משלב 7.11.
13. חשב את תדר הקטסטרופה ידי חלוקת מספר מעברי פילמור אל depolymerization לפי הזמן הכולל של כל אירועי הצמיחה ^13. רשמו תוצאות אלה בעמודה בצמוד לערכים שיעור depolymerization משלב 7.12.
14. חשב את תדר ההצלה על ידי חלוקת מספר מעברי depolymerization-אל-פילמור על ידי הזמן הכולל של כל אירועי ההצטמקות ^13. רשמו תוצאות אלה בעמודה סמוך ערכי תדר קטסטרופה משלב 7.13.
15. חשב את dynamicity ידי חלוקת סכום הערך המוחלט של כל השינויים באורך של משך הזמן הכולל של רכישת התמונה, המחושבים בשלב 7.10.1, ומכפיל אותו 27.0833 להשיג יחידות משנה טובולין לכל ¹⁴ שניים. רשמו תוצאות אלה בעמודה בסמוך Val תדירות הצלהUES משלב 7.14 ולשמור בטבלת התוצאות.
    הערה: אפשר להפוך את תהליך הניתוח המתואר צעדים 7.10-7.15 באמצעות תוכנית מחוייט (. Estrem, et al, כתב היד שהוגשה). התוכנית נועדה לזהות תקופות של פילמור depolymerization של מדידות אורך ידי ביצוע הפרמטרים שפורטו לעיל.

תוצאות

מדידת דינמיקת microtubule בתאים חיים שמר מספקת כלי משכנע להעריך כיצד מוטציות בגני מקודדי רגולטורי microtubule או טובולין יחידות משנת פילמור השפעה ושיעורי depolymerization, כמו גם את תדירות המעבר בין המצבים הללו. איור 1 מציג סדרה עתית של הדינמיקה microtubule אסטרל?...

Discussion

המודל שמרים הניצנים מציע יתרונות גדולים לאיסוף מדיד ברזולוציה גבוהה של דינמיקת microtubule בסביבת in vivo, כולל היכולת מיקרוטובולים יחיד תמונה לאורך זמן ואת היכולת לתפעל tubulins ורגולטורי microtubule באמצעות הכלים של גנטיקת שמרים.

תאי-מצופ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)