Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Özet

Maya tomurcuklanan nedeniyle güçlü genetik ve mikrotübül hücre iskeletinin basitliği için in vivo olarak mikrotübül dinamiklerinin çalışmak için avantajlı bir modeldir. Aşağıdaki protokol dönüşümü ve kültür maya hücreleri eş odaklı mikroskopi görüntü elde ve kantitatif maya hücrelerini canlı mikrotübül dinamiklerini analiz etmek açıklamaktadır.

Özet

Dinamik mikrotübülüsler birçok hücresel süreçlere temeldir ve mikrotübül dinamiklerinin doğru ölçümler hücreleri bu süreçleri düzenleyen nasıl içine ve nasıl genetik mutasyonlar darbe düzenleme öngörü sağlayabilir. metazoan modellerinde mikrotübül dinamiklerinin miktar genetik manipülasyonlara yüksek mikrotübül yoğunluğu ve ilişkin kısıtlamalar da bulunmaktadır ilişkili zorluklar, bir dizi vardır. Buna karşılık, tomurcuklanan maya modeli bu zorlukların üstesinden avantajlar sunuyor. Bu protokol, maya hücreleri, canlı bir mikrotübül dinamiklerinin ölçmek için bir yöntemi tarif etmektedir. floresan etiketli tubulin ifade eden hücreler, sabit zaman atlamalı görüntü elde etmek için izin monte kayar odalarına yapıştırılır. Yüksek hız için ayrıntılı bir rehber, dört boyutlu görüntü elde etme de eş odaklı görüntü yığınlarının dinamik mikrotübül özelliklerinin ölçülmesi için bir protokol, hem de temin edilmektedir. Bu yöntem, geleneksel maya genetik ile birlikte, atakantitatif tübülin alt-birimleri aktivitesini değiştiren mikrotübül regülatörleri veya mutasyonların etkilerini değerlendirmek için çok uygundur bir yaklaşım IdeS.

Giriş

Mikrotübüller αβ-tübülin proteini alt ünitelerinin yapılmış iskelet polimerlerdir ve hücre içi ulaşım, hücre bölünmesi, morfojenez ve motilite içeren hücresel bağlamlarda çeşitli kullanılmaktadır. nerede ve ne zaman mikrotubuller formu bu çeşitli roller için mikrotübül ağları oluşturmak için, hücreler dikkatle düzenleyen gerekir. Bu düzenleme, serbest alt-birimler halinde mikrotübül polimerler veya demonte mikrotübüllere αβ-tübülin alt-birimleri monte ya da bu reaksiyonların kontrol edilmesi ile elde edilir; Bu mikrotübül dinamiklerinin olarak bilinir.

mikrotübül alanının önemli bir amacı, tübülin ve / ya da mikro tüpler bağlanan αβ-tübülin alt-birimleri ve dışsal düzenleyiciler çalışmalar dahil olmak üzere mikrotübül dinamiklerine, düzenleyen moleküler mekanizmalarını etmektir. Ve iyi bilinen bir deneysel yaklaşım com genellikle, saflaştırılmış αβ-tübülin proteini kullanılarak, in vitro olarak, bu sistem tekrar oluşturmak için olanSaflaştırılmış dış düzenleyicileri ile bileflimini. Bu yararlı bir yaklaşım olsa da, yeniden oluşturulmuş bir sistemde mikrotübül dinamikleri canlı hücrelerde gözlenen olandan kuvvetle farklılık olduğu açıktır. Örneğin, mikrotübüller daha hızlı büyür ve in vitro in vivo daha yavaş küçültmek. Bu farklılıklar, hücreler bilinen dış düzenleyiciler ¹ mevcudiyeti, aynı zamanda, henüz tanımlanmamış-faktörlere bağlı olabilir. Nedenle, mikrotübül düzenleyiciler ve bir yerli hücresel bağlamda dinamiklerini bozacak mutantların faaliyetlerini belirlemek için çok önemlidir.

metazoan modelleri mikrotübül fonksiyonunu ve üst düzey örgüt araştırmak için geçerli olan sistemler olduğu kanıtlanmış olmasına rağmen, birkaç pratik kaygılar ciddi mikrotübül dinamiklerinin hassas ölçümü için bu modellerin yarar sınırlar. İlk olarak, hücre başına binlerce onlarca arasında değişen mikrotübül yüksek sayıda, güvenle etmek zorlaştırırzamanla bireysel Mikrotübülleri izlemek. Birçok çalışmada seçici böyle uç bağlayıcı (EB) ailede proteinler gibi mikrotübül uçlarına lokalize proteinler görüntüleme yoluyla bu sorunu aşmak. Bununla birlikte, bu proteinler, sadece Metazoan'da ² mikrotübülleri büyüyen uçları lokalize bilinmektedir. Bu nedenle, bu proteinlerin programı yalnızca dolaylı olarak felaket sıklığı dinamikleri diğer yönleri, ölçüm yaparken doğrudan büyüme oranları ölçümü ile sınırlıdır. İkincisi, genom düzenleme teknolojisindeki gelişmeler rağmen kararlı bir şekilde floresan etiketli tubulin veya selektif tübülin veya mikrotübül düzenleyiciler işlemek için mutasyonlar tanıtarak ifade eden hücreleri oluşturarak önemli bir sorun olmaya devam etmektedir. Üstelik Metazoan'da birçok tübülin izotiplerinin varlığı mutasyonları bireysel tübülin genleri nasıl etkilediğini çalışma boşa çıkarıcıdır.

Çiçek mayası sistemi in vivo microtubu ölçüm için çeşitli önemli avantajlar sağlarle dinamiği. Maya bireysel mikrotübül görselleştirme izin basitleştirilmiş mikrotübül ağı bulunmaktadır. Mayada, mikrotübüller çekirdek zarfına ³ gömülü mil kutup gövdelerinin (SPBs) olarak bilinen merkezi organize kaynaklanmaktadır. SPBs mikrotübül ^{4, 5} çekirdeklenmesi γ-tübülin küçük kompleksleri için iskelet olarak hizmet vermektedir. SPBs mikrotübül, mil mikrotübül ve astral mikrotübül iki sınıfları çekirdekleştirmek. Nükleolazma içine Mil mikrotubuller projesi ve kinetochore mikrotübül aracılığıyla kromozomların bağlayabilmek için ve interpolar Mikrotübülleri ⁶ örtüşen yoluyla mil stabilize için önemlidir. Buna karşılık, astral mikrotübül dışa sitozol içine proje ve iğ mikrotübüller yoğun ağına nispeten nadir karşılaştırılır. Mitoz sırasında önceden anafaz hücreler SPB ya çıkan sadece 1-2 astral mikrotübülleri sahiptir; Bu i olarak varyerine ⁷ demetleri olarak daha ndividual mikrotübüller. mitoz sırasında mikrotübüllerin Astral rolü tomurcuk boyun olarak bilinen anne ve tomurcuk bölmeleri arasındaki birleşme içine çekirdeği ve mil taşımaktır. Bu hareket, doğru ve en sonunda tomurcuk boyun ⁸ içine çekirdeği ve mil çekme astral mikrotübüller üzerindeki kuvvet üretir iyi tanımlanmış yolları kapsar.

maya sisteminin bir diğer avantajı, eşsiz bir hassasiyetle mikrotübül düzenleyiciler ve tübülin alt-birimleri araştırmak için kullanılabilir olan genetik bir programı. Tek bir β-tübülin geni (TUB2) ve iki α-tubulin genleri (TUB1 ve TUB3): Maya da bir tübülin izotiplerinin basitleştirilmiş repertuar sahiptirler. Mutasyonlar hali hazırda bu genlerin sokulur ve böylece homojen bir tübülin nüfus ^{9, 10} olarak incelenebilir. yaygın bir dizi vardırMevcut etiketleme mikrotübül için yapılar ve bu kararlı ifadesi için kromozom lokuslarındaki entegrasyon için hedeflenebilir (Tartışma).

Bu yöntemin genel amacı, mikrotübül dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ölçümler için dört boyutta (X, Y, Z ve T), maya hücreleri, canlı görüntü tek mikrotübüllere etmektir. maya hücrelerinde floresan etiketli tubulin konstitütif, düşük seviyeli bir ekspresyon için yapıları birleştirmek için yöntemler tarif edilmiştir. görüntüleme önce, canlı hücreler uzun süreli görüntüleme için hücrelerini kararlı hale lektin Concanavalin A ile kaplanmış kayar odalarına monte edilmiştir. görüntü elde etmek için en uygun parametreler, hem de veri analizi için bir iş akışı, ayrıca açıklanmıştır.

Protokol

1. Hazırlama -Leu Çıkarma Plakalar

1. 2 L'lik bir şişeye steril deiyonize su, 800 mL (O dihidro ₂₎ ekleyin. Bırakma baz (DOB) toz 26.71 g, CSM-Leu 0.69 g, ve agar 20 g ekleyin. bir manyetik karıştırma çubuğu ile karıştırın. Dihidro ₂ O ile 1 L'ye getir
2. 121 ° C'de otoklav ve 30 dakika 19 psi.
3. otoklavdan balon çıkarın ve yumuşak bir şekilde karıştırma ile ~ 65 ° C'ye soğumasını sağlayın.
4. 100 mm çaplı plakalara 30 ml / plaka dökün. Bu, 4 ° C'de depolamadan önce, 36-48 saat boyunca oda sıcaklığında bekletin.

2. GFP etiketli tubulin bünyesel anlatımı için, GFP-Tub1 entegre

1. 3 dakika boyunca, 10 mg / ml tek kordonlu DNA (ssDNA) bir stok konsantrasyonu kaynatın.
2. Saflaştırılarak GFP Tub1 plazmid DNA ¹¹ 400 ng ile kaynatılır ssDNA 2 uL birleştirin.
   NOT: stabil, floresan etiketleme için kullanılabilecek plazmid çeşitli vardırAlternatif florofor ve seçilebilir işaretleyiciler kullanan maya içinde mikrotübül. Bu alternatiflerin bazıları Tartışma bölümünde açıklanmıştır.
3. kompetan maya hücreleri 50 uL alikot DNA karışımı ekleyin.
   Not: sorbitol solüsyonu ile kompetan maya hücreleri hazırla (SORB 100 mM LiOAc, pH 8'e sulandırılmış asetik asit ile ayarlanmış 10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA, pH 8, 1 M sorbitol,). Kompetan maya hücreleri yapma ayrıntılı bir açıklaması için, referans ¹² bkz.
4. Girdap iyice.
5. DNA hücre karışımı, polietilen glikol (PEG) çözeltisi (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, ve% 40 PEG3350) toplam hacmine 6x ekleyin.
6. Girdap iyice.
7. yumuşak çalkalama ile 30 ° C'de en az 1 saat süreyle inkübe edin.
8. toplam hacmi ve vorteks% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyin.
9. 15 dakika boyunca 42 ° C'de inkübe edilir.
10. 5 dakika boyunca 2500 x g'de santrifüjleyin.
11. Süpernatantı ve dihidroksi ₂ O 100 uL hücrelerin askıya
12. Bir -Leu bırakma plakası üzerinde plakası hücreleri.
    Not: diğer yapılar alternatif işaretleyici kullanır ama GFP Tub1 yapı, bir lösin okzotrofik işaretleyici içerir. Bırakma ortamı yapısının oksotrofik işaretleyiciye özgü olmalıdır.
13. dönüştürülmüş hücreler 30 ° C'de 3-5 gün süreyle büyümeye izin verin.
14. otoklavlanıp kürdan kullanarak koloniler aktararak taze Leu bırakma plakasında Yeniden çizgi tek dönüştürme koloniler. 30 ° C 'de bir gece boyunca inkübasyona bırakılır.
15. Görsel olarak temiz bir slayt üzerine su 2 uL aşama 2.14 plakadan tek bir koloni, hücrelerin yaklaşık olarak 1 uL asılmasıyla bir GFP sinyali için her transformant ekran. Bir lamel ile süspansiyon halinde duran hücreleri Kapak ve floresan mikroskobu kullanılarak dikkate alınmalıdır.
    1. 488 nm ışık sahip transformasyon heyecan ve bir GFP sinyali olduğunda arayın.
       Not: dönen bir disk konfokal mikroskop kullanabilirsiniz Bu adım, ama bir 100X objektif ve GFP yeterli olacaktır görüntüleme için uygun optik ile donatılmış bir geniş açılı mikroskop. Görünür GFP etiketli mikrotübüllerin, veya anormal düzeyde yüksek floresan olan olan hücreler, reddedilmelidir. Bundan sonra, maya suşları görüntüleme için kültürlü olmaya hazırız.

3. Artan sıvı Maya Kültür

1. sentetik tam orta 3 mL bir levha üzerinde tek bir koloniden maya hücrelerinin ~ 1 uL inoküle. Hücreler 250 rpm'de 30 ° C'de gece boyunca büyümeye izin verin.
2. Ortam içinde 0.1 600 Ertesi gün, doymuş kültür seyreltin. 3-4 saat için ya da hücreler, görüntüleme için odalarına yerleştirilir hazır olduğunda _OD600 0.4 ve 0.8, arasında olana kadar 30 ° C çalkalayıcı seyreltilmiş kültür dönün.

4. Akım odası Slaytlar hazırlanması

1. kesimUzun geniş bir parça 4 içine parafin film tabakası ve 7.
2. parafin film 4 inç genişliğinde uzunlamasına standart bir mikroskop lamı yerleştirin ve slayt 3-4 katmanları kalın film kaplıdır 3-4 kez bu şekilde bütün slaydın etrafına bir film sarılır. Makul bir mühür olmadığından emin olmak için katmanları bir araya basın; Bu kesmek için daha kolay hale getirecek. Çok sert basarak veya kırışmasına filmi neden kaçının.
3. Temiz bir kutu kesici tıraş makinesi kullanarak slaydın dış kenarları boyunca parafin filmi kesin. kesme için düz bir kenar sağlamak için başka bir slayt kullanın.
4. Peel aşırı çalışma slayt kapalı sinema ve atın. filmin geri kalan yığınları sürgünün bir yüzünü kapsamaktadır ve görüntüleme odalar arasında duvarlar yapmak için kullanılır.
5. bir düz kenar, ikinci bir slayt kullanılarak, yaklaşık on şeritleri, her birinin genişliği 2-4 mm içine sürgünün uzun ekseni boyunca yığılmış film katmanları kesti.
6. dikey olarak istiflenmiş parafin film tabakalarının Kesmesürgünün kısa ekseni boyunca, aşama 4,5 yapılan kesiklerin, şeritleri genişliği 2-4 mm, uzunluğu 23-24 mm, ve kalın 3-4 katmanları oluşturmak için.
7. 45 ° 'lik açıyla, bir jilet kullanılarak şeritler kesilmiş soyun. Forseps kullanarak, eşit bölmelerin istenen numaraları oluşturmak için temiz bir mikroskop lamı üzerine kesik film şeritlerini dağıtın. (4 parafin film şeritleri ile yapılan) kadar 3 bölmeler, bir slayt üzerinde oluşturulabilir.
8. Filmin şeritlerinin üzerine tek bir lamel yerleştirin ve forseps ile pozisyona taşımak.
9. (Bu, yaklaşık en ocak üzerinde, düşük-orta ayardır), hazırlanan slayt yerleştirin ~ 95 ° C'ye ayarlanmış bir sıcak plaka üzerinde, yukarı lamel. Film şeritleri (yaklaşık 3 dk) saydam kadar slayt ısıtılması ve daha sonra slayt mühür ve yavaşça cımbız ile lamel üzerine baskı ile bir arada lamel.
   NOT: Bu c yukarıdaki bölgeler çizilmeye olarak, parafin film şeritleri hemen üzerindedir; lamel bölgeler üzerinde tek basına önemlidirHambers görüntü kalitesini azaltabilir. slaytı aşırı ısınmasına vermemeye özen; buharlaşmış bir film olacak kat yapışmasını hücreleri engelleyen bir hidrofobik film ile haznenin iç.
10. (Slayt sıcak olacaktır) ocak slayt kaldırmak ve kapak tarafı yukarı bakacak şekilde soğumaya kenara ayırın için forseps kullanır; slayt soğudukça film beyaz, opak renklenmeye dönecektir.
    NOT: Bu noktada, slaytlar kültürlü maya hücreleri ile yüklenecek hazırdır. Ekstra slaytlar bu noktaya yapılmış ve süresiz tutar için temiz ve kuru bir yerde saklanabilir.

Hazırlanan Akış Odası Slaytlar içine 5. Yükleme Maya Hücreleri

1. Concanavalin A (2 mg / ml steril dihidro ₂ O) 'in bir dondurulmuş, 200 uL alikot çözülme.
2. açık uçlarından birine pipetleme hazırlanan slayt her bölmeye çözülmüş Concanavalin A yaklaşık olarak 100 uL ekleyin. odasını dolduracak kadar Concanavalin A'yı ekleyin. Bu s içinTEP, Konkanavalin A kapilar etkisi ile bölme ile çekilir.
3. Konkanavalin A lamel (yani odası) uymak için girmesi için 5 dakika için iki mikrofüj tüpü raflar veya kafesler arasında slayt, lamel-aşağı, asın.
4. Bir lamel yukarı pozisyona slayt dönün. Konkanavalin A kaldırmak için sentetik tam orta; 2x ile odacık hacmi haznesi yıkayın (yaklaşık 200 uL yukarıda adım 5.2 belirlenmiştir)
   1. aynı anda diğer taze sıvı pipetleme ise bölmenin bir ucundan dışarı sıvı çekmek için, bir kağıt havlu köşesini veya ikiye katlanmış bir filtre kağıdı kullanarak, hazne içindeki orta akış. Alternatif olarak, diğer taze sıvı pipetleme sırasında dikkatli bir şekilde bir ucundan dışarı sıvı çekmek için bir vakum aspiratör kullanın.
5. yönlendirilen bir akış meto kullanılarak (adım 3.4) hücre süspansiyonu oda hacmi (yaklaşık 200 uL) 2x akan Yük hücreleriAdım 5.4.1 tarif d.
   NOT: Hedef görüntüye lamel de hücrelerin tek tabakasıdır. Nedenle, onlar birbirinin üstünde kazık olmadığını yeterince küçük, ama yeterli hücreler görüntü edinme başına maksimum veri miktarını toplamak için alanda mevcut olduğu kadar büyük bir hücre konsantrasyonunu yüklemek için önemlidir. bölme içindeki hücrelerin optimum konsantrasyonu değişebilir ve deneysel olarak tespit edilmelidir. , Akış odacağı içinde hücre konsantrasyonunu arttırmak yavaşça, 2 dakika boyunca 1000 x g'de hücre kültürünün pelet yüzer bazılarını kaldırmak için. Hücre konsantrasyonunu azaltmak hücre süspansiyonuna taze sentetik tam orta ekleyin. hücrelerin konsantrasyonu, bir faz kontrast mikroskop odası incelenmesi ile (aşağıdaki) adım 5.7 sonrası değerlendirilebilmektedir. Bu noktada, ek hücreler daha fazla hücre süspansiyonu içinde akan odasına ilave edilebilir. Bununla birlikte, bu noktada hücre yoğunluğunu azaltmak mümkün değildir ve en iyi elde edilirBir seyreltilmiş hücre süspansiyonu ile yeni bir bölme yüklenerek.
6. Hücreler lamel yapışmasına izin vermek için 10 dakika boyunca, aşama 5.3'te tarif edildiği gibi, kaydırma lamel sarkar.
7. 4x yoluyla sentetik tam orta odacık hacmi (yaklaşık 400 uL) akan bir yapışmamış olan hücreleri yıkayın. Bu görüntü edinimini kirletebilir odasında serbest yüzen hücreleri, ortadan kaldıracaktır.
8. Dikkatle lamel kenarına menisküs getiren, bir kağıt havlu kullanılarak temiz bir köşesi ile bölmenin her iki ucunu kurutun.
9. Sıcak (75 ° C), sızdırmazlık maddesi ile odasının her uç kapatıcı kısım (örneğin, valap; eşit parçaya vazelin, yün mumu ve parafin balmumu).
   NOT: Bu noktada, slayt görüntüsüne hazırdır. bölmelerinin her biri, bölme içindeki hücrelerin yoğunluğuna bağlı olarak, en fazla 9 saat boyunca görüntülenebilir. Hücreler, hücreleri yerinden kabarcıklar oluşturacaktır karbondioksit zamanla _(CO2), üretecektir.

6. Görüntü edinme

1. Bir 1.45 NA 100X CFI Planı Apo hedefi, bir piezoelektrik aşamada, dönen bir disk konfokal tarayıcı biriminin, bir aydınlatma lazer ve bir EMCCD kamera ile donatılmış bir inverted mikroskop slaytı getirin. edinimi sırasında oda sıcaklığı (25 ° C) aşamasının sıcaklığı muhafaza edin.
   Not: yüksek sayısal açıklık daha büyük bir görüntü çözünürlüğü sağlar, ve piezoelektrik aşama yüksek hızlı z yığın toplama sağlar. Asgari mikroskop gereksinimleri 100X objektif, aydınlatma lazer ve EMCCD kamera bulunmaktadır.
2. odak haline hücreleri getirin. edinim alan gruplanmış hücreler için slayt arayarak araya kümelenmiş en az 5-6 hücrelerini sahip olduğundan emin olun.
   NOT: Bir seferde birden fazla hücre görüntüsüne gerekli olmamasına rağmen, aynı alanda görüntüleme birden çok hücre verilerin kalitesini bozmadan veri toplama verimliliğini artırır. Ancak, bu kritiktirHücreler aynı odak düzlem üzerinde ve birbirine üstüne yığılmış değildir.
3. Zamanla çoklu z serisi toplamak için çok boyutlu bir satın alma programlayın.
   1. Aşağıdaki aktif alıcı ayarları içinde ayarlar ayarlama: toplam Z derinlik = 6 um, tüm maya hücresi kapsaması; Z adım boyutu = 300 nm, yüksek hızda örnekleme olmayan ışık toplama maksimize etmek; toplam zaman süresi = 10 dak; Zaman aralıkları = Z serisi her 4 s; Pozlama süresi = her bir z-düzlemi 90 ms.
      NOT: Optimal maruz kalma süresi kamera, uyarma ışık kaynağı ve diğer faktörlere bağlı olarak değişir. EMCCD ile ölçülen piksel değerlerine tabi olan sitoplazmadan sinyal GFP etiketli astral mikrotübül sinyalin: 1 oranını Genel olarak, optimum maruz kalma süresi 3 elde etmek için gerekli olan minimum süre olacaktır.
4. 'Çalıştır' tıklayarak edinimini başlayın. tam 10 dk süresince çalışmasına izin verin. bir görüntü olarak verilerini kaydetserisi (tiff veya .nd2).
5. odasının içinde görüntüye yeni bir alan seçin ve tekrar 6.2-6.4 adımları tekrarlayın.
   NOT: Tek bir bölme odası içinde hücre yoğunluğuna bağlı olarak, hücre 15 ile 20 alanları vermelidir. Odasında _CO2 daha hızlı inşa edecek şekilde daha yüksek hücre yoğunlukları, daha düşük toplam alanları verecektir.

7. Görüntü Analizi

1. ImageJ (görüntü dosyasını açın https://imagej.nih.gov biyo-biçimleri ithalatçı eklentisi kullanarak bir hyperstack gibi).
   1. Açık ImageJ doğrudan kontrol paneli üzerine bölümünden 6 alınan görüntü yığını sürükleyebilir. biyo-biçimleri ithalatçı otomatik olarak başlayacaktır. Bir hyperstack olarak görüntü yığını yüklemek için "Tamam" ı seçin.
      NOT: "Biyo-biçimleri İthalat Seçenekler" istemi açın ve "Yığın Görüntüleme" bölümünde, altında sağlayacaktır "isimli yığını:" ayarlandığında için "hyperstack"; ve "Yığın Sipariş:" ayarı "XYCZT."
2. Z-proje fonksiyon kullanılarak, maksimum yoğunlukta, 2 boyutlu projeksiyon her bir Z serisi kapa.
   1. "Resim" menüsüne "Yığın" alt menüsünü ve "Z-proje" özelliğini seçin. Açılır listeden "Maksimum projeksiyonu" ı seçin ve "Tamam."
3. "Süreç" menüsünü, "Filtreler" alt menüsünü ve "Medyan" özelliği seçerek beneklenme gürültüsünü azaltmak için görüntü yığını bir medyan filtresi uygulayın. yarıçap kutuya 2.0 piksel yazın ve "Tamam."
4. alanında ön anafaz hücreleri tanımlamak.
   Not: Bu orta boy tomurcukları ve kısa bir mitotik iğ uzunluğunda 1-1.5 um (Şekil 1, bir kısa mitotik ok ucu noktası) ile karakterize edilir. bunlar tipik olarak sadece bir fe göstermesinden dolayı, bu aşamada hücreler, mikrotübül dinamiklerinin analiz edilmesi için idealdirMil uçlarına ⁷ çıkan ağırlık astral mikrotübüller. Astral mikrotübül sitoplazmada artı ucuna, SPB de eksi ucundan homojen bir GFP sinyali yoğunluğu sergilerler doğrusal filamanlar halinde tespit edilebilir.
5. artı ucuna astral mikrotübül ve daha yoğun olarak etiketlenmiş mil mikrotübül arasındaki kavşakta konumlandırılmışlardır eksi uçtan başka, tek bir astral mikrotübül boyunca bir çizgi çizmek segmentli hattı aracını kullanarak, görüntü dizisinin ilk zaman noktasında başlayan sitoplazmada olan (Şekil 1 'de kırmızı çizgiler bakınız). segmentli çizgiyi tamamlamak için Mikrotubullerin ucunda çift tıklayın.
6. klavyede "M" düğmesine basarak "tedbir" özelliğini kullanarak sonuçları tabloda ölçümü kaydedin.
   NOT: gri yoğunluğu gibi ek özellikler, "Analiz" menüsündeki ölçümleri ayarlama ve "Set Ölçümleri" alt menüsü ile kaydedilebilir.
7. Z-kaydırma çubuğu sağ oka tıklayarak veya klavyedeki "./>" tuşuna basarak ya sonraki timepoint ilerle. Tekrar görüntü dizisinde her zaman noktasında 7.5 ve 7.6 adımları tekrarlayın.
8. Sonuçlar tablosundaki verileri kopyalayıp bir e-tabloya yapıştırmak. seçerek verileri kaydetme "Farklı Kaydet".
   NOT: çizgi (yani astral mikrotübül) uzunluğunu gösterir serisinin bir zaman noktası gösteren dilim ve uzunluğu, bu ölçümler çeşitli değerleri içerecek, ama en önemli değerlerdir. Diğer ölçümler içeren kolonlar tutulan veya iptal edilebilir ya da (örneğin, alan, piksel değeri, açısı, vb) idi.
9. sağ tıklayarak ve "Ekle" işlevini kullanarak e-tabloda yeni bir sütun oluşturun. Girdi Her bir zaman noktası zamanını (ler) i.
10. "Ekle Hattı kullanarak zaman (lar) bir fonksiyonu olarak mikrotübül uzunluğu (mikron) bir XY dağılım arsa oluşturunGrafik" özelliği; gibi uzunluk ölçümleri seçme 'Y' ve zaman sütun 'X'
    1. adım 7.10 den dağılım arsa üzerinde zamanla uzunluğunda pozitif ve negatif değişiklikleri arayarak polimerizasyonu, depolimerizasyonundan ve duraklama bölgelerini tanımlamak.
       Not: Polimerizasyon olaylar 3 zaman noktasında en az karşı, en azından 0.5 um ile mikrotübül uzunluğunu arttırmak ve R ² ≥ 0.9 ve bir R-değeri> 0 (Şekil 1B, D, yeşil noktası) olan bir doğrusal regresyon uygun. Depolimerizasyon etkinlik 3 zaman noktasında en az karşı, en azından 0.5 um ile mikrotübül uzunluğunu azaltmak ve R ² ≥ 0.9 ve bir R-değeri <0 (Şekil 1B, D, pembe noktası) olan bir doğrusal regresyon uygun. Duraklatma etkinlik polimerizasyon ve depolimerizasyon ayrıdır. Duraklama az 0,5 um 3 zaman noktasında en az boyunca mikrotübül uzunluğu net değişiklik olarak tanımlanır;-0.4 ve 0.4 arasında bir R-değerine sahip bir lineer regresyon uygun; ve F-testi ile tespit edildiği üzere, sıfırdan istatistiksel olarak farklı olmayan bir eğime sahiptir.
    2. Bir kılavuz olarak dağılım çizimi kullanılarak uzunluk değişimi olumlu olduğu zamanda bölümleri belirlemek ve yeşil renkte bunları vurgulayın. uzunluk değişimi pembe renkte negatif olduğunda zamanın bölgeleri vurgulayın.
    3. Her bir lineer regresyon bölümünü vurgulanan hesaplayın ve yakın bölgelere sütun her bölüm için R ve R ^'2-değeri kaydedin. Bir polimerizasyon olayı veya bir depolimerizasyon olayını her renkli bölge sınıflandırır.
11. Her bir büyüme olay için zaman içinde değişim ile uzunluğunda net değişimi bölünmesi ile polimerizasyon oranlarını hesaplayın. Adım 7.10.3 doğrusal regresyon değerlerine sütunda bu sonuçlar bitişik kaydedin.
12. Her shrinkin için zamanında değişiklikten uzunluğunda net değişimi bölünmesiyle depolymerization oranlarını hesaplayıng etkinliği. Adım 7.11 polimerizasyon hızı değerleri için sütundaki bu sonuçlar bitişik kaydedin.
13. Tüm büyüme etkinlikleri ¹³ toplam zaman polimerizasyon için-depolimerizasyon geçiş sayısını bölünmesiyle felaket frekansı hesaplayabilir. Adım 7.12 den depolimerizasyon oranı değerlerine sütunda bu sonuçlar bitişik kaydedin.
14. Tüm çekme etkinlikleri ¹³ toplam zaman depolimerizasyon-için-polimerizasyon geçiş sayısını bölünmesi ile kurtarma frekansı hesaplayabilir. Adım 7.13 felaket frekans değeri sütunundaki bu sonuçlar bitişik kaydedin.
15. Adım 7.10.1 hesaplanan görüntü elde toplam süresi, bütün uzunluk değişiklikleri, mutlak değerinin toplamına bölünmesi ve ikinci ¹⁴ başına tübülin alt-birimleri elde etmek için 27.0833 ile çarpılarak Dinamisitesi hesaplayın. Kurtarma frekans val bitişik sütunda bu sonuçları kaydedinadım 7.14 den ues ve sonuç tablosu kaydedin.
    Not: Bu, özel bir program kullanılarak adımda 7,10-7,15 tarif edilen analiz işlemini otomatikleştirmek için mümkündür (. ESTREM ve arkadaşları, yazma sunulmuştur). Program, yukarıda ayrıntıları aşağıdaki parametreler ile uzunluk ölçümleri polimerizasyon ve depolimerizasyon dönemlerini belirlemek için tasarlanmıştır.

Sonuçlar

maya hücreleri canlı mikrotübül dinamiklerinin Ölçüm mikrotübül regülatörleri veya tubulin kodlayan genlerdeki mutasyonların etki polimerizasyonu ve depolimerizasyon oranları, aynı zamanda bu durumları arasındaki geçişin frekans alt-birimlerini ne kadar değerlendirmek için ilgi çekici bir araç sağlar. Şekil 1'de, bir vahşi tip hücre astral mikrotübül dinamiklerinin bir zaman serisi ve (430Δ tub2-) β-tubulin bir mutasyona sahip b...

Tartışmalar

Tomurcuklanan maya modeli zamanla görüntü tek mikrotüpcüklere yetenek ve maya genetik araçlarını kullanarak tübülinler ve mikrotübül düzenleyicileri manipüle etme yeteneği dahil olmak üzere, bir in vivo ortamda mikrotübül dinamiklerinin yüksek çözünürlüklü ölçümler toplamak için önemli avantajlar sunuyor.

Konkanavalin A ile kaplı bölmeler erimiş agar pedleri de dahil olmak üzere daha önce tarif edilen tertibatlarda, üzerinde bir çok avantaj sağl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)