고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서

요약

효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.

초록

동적 미세 소관은 많은 세포 과정의 기초이며, 미세 소관 역학의 정확한 측정은 세포가 이러한 과정을 조절하는 방법에 대한 방법과 유전자 돌연변이에 미치는 영향 규정 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 후생 동물 모델에서 미세 소관 역학의 정량화는 유전자 조작에 높은 미세 소관 밀도 및 제한 사항을 포함하여 관련 문제의 번호가 있습니다. 반면, 신진 효모 모델은 이러한 문제를 극복 이점을 제공한다. 이 프로토콜은 효모 살아있는 세포에서 단일 미세 소관의 역학을 측정하는 방법을 설명합니다. 형광 태그 튜 불린을 발현하는 세포는 안정한 저속 화상 획득을 가능하게 조립 슬라이드 챔버에 부착되어있다. 고속 대한 상세한 가이드의 4 차원 이미지 획득은 공 초점 화상 스택 동적 미세 소관의 속성을 정량화하는 프로토콜뿐만 아니라, 제공된다. 이 방법은, 종래의 효모 유전자와 결합 잠정량적 튜 불린 소단위의 활성을 변경하는 레귤레이터 미세 소관 또는 돌연변이의 영향을 평가하기위한 유일하게 적합한 접근법을 IDES.

서문

미세 소관은 αβ-tubulin의 단백질 서브 유니트로 이루어지는 골격 중합체이며, 세포 내 운반, 세포 분열, 형태 형성 및 세포 운동성 포함 콘텍스트의 다양한 사용된다. 언제 어디서 미세 소관 양식이 다양한 역할에 대한 미세 소관 네트워크를 구축하기 위해 세포는 신중하게 조절해야합니다. 이 규정은 무료 하부 단위로 미세 소관 폴리머 또는 분해 미세 소관에 αβ-tubulin의 서브 유닛을 조립하거나하는 반응을 제어하여 수행됩니다; 이것은 미세 소관 역학로 알려져 있습니다.

미세 소관 분야의 주요 목표는 튜 불린 및 / 또는 미세 소관에 결합하는 αβ-tubulin의 서브 유닛 및 외부 규제 기관의 연구를 포함하여 미세 소관 역학을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하는 것입니다. 잘 확립 된 실험 방법은 COM 종종 정제 αβ-tubulin의 단백질을 사용하여 시험 관내에서 이러한 시스템을 재구성하는정제 된 외부 레귤레이터 환 경의. 이 유용한 방법이지만, 재구성 된 시스템의 미세 소관의 역 동성이 살아있는 세포에서 관찰 된 것과 크게 다른 것은 분명하다. 예를 들어, 미세 소관은 빠르게 성장하고 체외에 비해 생체 내에서 느리게 수축. 이러한 차이는 세포의 알려진 외부 조절기 ^(1)의 유용성뿐만 아니라, 아직까지 정의되지 않은 요인에 기인 할 수있다. 따라서 미세 소관 규제 및 네이티브 셀룰러 맥락에서 역 동성을 방해 돌연변이의 활동을 결정하는 것이 중요합니다.

후생 동물 모델은 미세 소관 기능과 고차원 조직을 조사하는 일반적인 시스템적일 수 있지만, 몇 가지 실제적인 문제는 심각하게 미세 소관 역학의 정확한 측정을 위해이 모델의 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 첫째, 셀 당 수천 수십 이르기까지 미세 소관의 높은 수는, 자신에 어렵게 만든다시간이 지남에 따라 개별 미세 소관을 추적 할 수 있습니다. 많은 연구는 선택적 같은 최종 결합 (EB) 계열의 단백질과 같은 미세 소관 단부에 지역화 단백질을 묘화함으로써이 문제를 다룬다. 그러나, 이러한 단백질은 후생 동물 ² 미세 소관 성장의 끝을 지역화하는 것으로 알려져있다. 따라서, 이들 단백질의 효용은 간접적 재앙 주파수와 역학의 다른 측면을, 직접 측정하면서, 성장 속도를 측정하기 위해 제한된다. 둘째, 게놈 편집 기술의 발전에도 불구하고 안정적으로 형광 표지 튜 불린 또는 선택적으로 튜 불린 또는 미세 소관 규제를 조작하는 돌연변이를 도입을 발현하는 세포를 만드는 것이 중요한 과제로 남아. 또한, 후생 동물의 많은 튜 불린 아이소 타입의 존재는 돌연변이가 개별 튜 불린 유전자에 미치는 영향을 연구를 혼동.

신진 효모 시스템은 생체 microtubu에서 측정하기위한 몇 가지 중요한 이점을 제공르 역학. 효모는 개별 미세 소관의 시각화를 허용 간략화 미세 소관의 네트워크를 가지고있다. 효모에서 미세 소관은 핵 봉투 ^3에 포함 된 스핀들 극 기관 (SPB는)으로 알려진 센터를 조직에서 발산. SPB는 미세 소관은 ^{4, 5} 핵 γ-tubulin의 작은 착물에 대한 지지체로 작용한다. SPB는 미세 소관은, 스핀들 미세 소관과 별 미세 소관의 두 개의 클래스를 핵. 핵질로 스핀들 미세 소관 프로젝트 및 동원체의 미 세관을 통해 염색체에 부착 및 극간 소관 ^{6 겹치는} 스핀들 비아를 안정화시키는 것이 중요하다. 대조적으로, 미세 소관 별의 바깥 세포질 내로 돌출하고는 스핀들 미세 소관의 밀집 네트워크 비교적 드문 비교된다. 유사 분열하는 동안, 사전 anaphase (핵분열 말기) 세포는 SPB 중 하나에서 나오는 1-2 별 미세 소관이있다; 이 내가로 존재오히려 ^{7 번들로보다} 미세 소관 ndividual. 유사 분열 동안 별 미세 소관의 역할은 꽃 봉오리 목으로 알려진 어머니와 새싹 구획 사이의 접합에 핵 스핀들을 이동하는 것입니다. 이 운동으로 결국 꽃 봉오리 목 ^8로 핵 스핀들을 당겨 별 미세 소관에 힘을 생성하는 잘 정의 된 경로를 포함한다.

효모 시스템의 또 다른 장점은 비할 데없는 정밀 미세 소관 규제 및 튜 불린 서브 유닛을 조사하는 데 사용할 수있는 자사의 유전학의 유틸리티입니다. 단일 β-tubulin의 유전자 (TUB2)와 두 개의 α-tubulin의 유전자 (TUB1 및 TUB3) 효모는 또한 튜 불린 동형의 간략화 레퍼토리를 갖는다. 돌연변이 용이 유전자로 도입시켜 균질 튜 불린 인구 ^{(9) (10)에} 조사 될 수있다. 널리 여러 가지가 있습니다가능한 라벨 미세 소관에 대한 구조, 이들은 안정적인 표현 염색체 유전자좌에서 통합의 대상이 될 수있다 (토론 참조).

이 방법의 전반적인 목적은 미소 관 역학 고분해능 측정을위한 네 개의 차원 (X, Y, Z, 및 T) 효모 살아있는 세포에서 단일 이미지 소관이다. 효모 세포의 형광 표지 된 튜 불린의 구성 적, 낮은 수준의 발현 구성체의 통합을위한 방법들이 설명된다. 촬상 전에, 살아있는 세포는 장기 이미징 세포를 안정화 렉틴 콘 카나 발린 A의 코팅 된 슬라이드 챔버에 장착된다. 화상 취득을위한 최적의 파라미터뿐만 아니라, 데이터 분석을위한 플로도 기재되어있다.

프로토콜

1. 준비 -LEU 드롭 아웃 플레이트

1. 2 L 플라스크를 멸균 증류수 800 ㎖ (다이 하이드로 O _2)를 추가한다. 강하베이스 (DOB) 분말 26.71 g, CSM-레우 0.69 g 및 한천 20 g을 추가한다. 자기 교반 막대로 섞는다. 다이 하이드로 ₂ O. 1 L로 가져 오기
2. 121 ℃의 오토 클레이브에서 30 분 동안 19 PSI.
3. 오토 클레이브에서 플라스크를 제거하고 부드러운 교반 ~ 65 ° C로 냉각 할 수 있습니다.
4. 100mm 직경의 판으로 30 ㎖ / 플레이트를 붓는다. 이 4 ℃에서 저장하기 전에 36 ~ 48 시간 동안 실온에서 앉아 보자.

2. GFP - 라벨 튜 불린의 구성 적 표현 GFP-Tub1 통합

1. 3 분 동안 10 ㎎ / ㎖의 단일 가닥 DNA (ssDNA를)의 스톡 농도를 끓인다.
2. 정제 된 GFP-Tub1 플라스미드 DNA ^(11)의 400 NG 삶은 ssDNA를 2 μL의 결합.
   주 : 안정, 형광 라벨에 사용할 수있는 플라스미드에는 여러 가지가 있습니다대안 형광 및 선택 마커를 이용하여 효모의 미세 소관의. 이러한 대안 중 일부는 토론 섹션에 설명되어 있습니다.
3. 관할 효모 세포의 50 μL 나누어지는에 DNA 혼합물을 추가합니다.
   주 : 소르비톨 용액 관할 효모 세포 준비 (흡 장력을 100 mM의 LiOAc, pH가 8을 묽은 아세트산으로 조정 된 10 mM 트리스 -HCl pH를 8, 1 mM의 EDTA pH를 8, 1 M 소르비톨). 관할 효모 세포를 만들기에 대한 자세한 설명은 참조 ^(12)을 참조하십시오.
4. 소용돌이 철저하게.
5. DNA의 세포 혼합물에 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 용액 (100 mM의 LiOAc, 10 mM 트리스 - 염산 pH를 8, 1 mM의 EDTA / NaOH로 pH를 8, 40 % PEG3350)의 총량 6X 추가.
6. 소용돌이 철저하게.
7. 교반과 함께 30 ℃에서 적어도 1 시간 동안 인큐베이션.
8. 총 부피 및 와류의 10 % 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)를 추가한다.
9. 15 분 동안 42 ℃에서 인큐베이션.
10. 5 분 동안 2,500 XG 원심 분리기.
상등액을 제거하고 다이 하이드로 ₂ O. 100 μL의 셀을 정지
11. -LEU 강하 접시에 접시 세포.
    참고 : 다른 구조가 다른 마커를 사용할 수있는 반면, GFP-Tub1 구조는, 류신 영양 요 마커가 포함되어 있습니다. 탈락 매체 구조체의 영양 요 구성 마커를 특정해야한다.
12. 형질 전환 된 세포가 30 ° C 3-5 일 동안 성장하도록 허용합니다.
13. 멸균 이쑤시개를 이용하여 콜로니를 전송하여 새로 -LEU 강하 접시에 연속으로 재 변환 단일 콜로니. 30 ℃에서 밤새 인큐베이션 플레이트.
14. 시각적 슬라이드 깨끗한 물 2 μL 단계 2.14 평판에서 단일 콜로니로부터 세포의 약 1 μL 현탁하여 GFP 신호를위한 각 형질 전환 체를 선별. 커버 슬립으로 일시 중단 된 세포를 덮고 형광 현미경을 사용하여 관찰한다.
    1. 488 nm의 광으로 형질 전환을 자극하고 GFP 신호의 존재를보고.
       참고 : 회전하는 디스크 공 초점 현미경을 사용하여이 단계하지만, 100X 목표와 GFP가 충분 이미징에 적합한 광학 장착 된 위드 현미경. 눈에 보이는 GFP 표지 미세 소관, 또는 비정상적으로 높은 형광을 가진 사람들과 세포는 거부되어야한다. 이 후, 효모 균주는 영상 배양 할 준비가 된 것입니다.

3. 성장 액체 효모 문화

1. 완전 배지의 합성 3 ㎖의 플레이트에 단일 콜로니로부터 효모 세포를 ~ 1 μL를 접종한다. 세포가 250 rpm으로 진탕 30 ° C에서 하룻밤 성장하도록 허용합니다.
2. 배지 0.1 <의 OD ₆₀₀ 다음날 포화 배양을 희석. 3-4 시간 동안 또는 세포 이미징을위한 챔버로 로딩 될 준비가되면 _{(600) OD가} 0.4 ~ 0.8 사이가 될 때까지 30 ° C에서 진탕 배양하여 희석을 반환.

4. 유량 용기 슬라이드를 준비

1. 절단장시간의 폭의 부분 (4)에 파라핀 필름 시트 7.
2. 파라핀 필름 4 인치 폭에 길이 표준 현미경 슬라이드를 놓고 슬라이드 3-4 층 두께의 필름으로 피복 3-4 회되도록 슬라이드 주위에 필름을 포장. 적당한 시일가되도록 함께 층을 누르; 이 잘라 쉽게 만들 것입니다. 너무 세게 누르거나 주름에 필름을 유발하지 마십시오.
3. 클린 박스 커터 면도날을 사용하여 슬라이드의 외측 가장자리를 따라 파라핀 필름을 잘라. 절단 직선 가장자리를 제공하기 위해 다른 슬라이드를 사용합니다.
4. 껍질 초과 작업 슬라이드 오프 영화 및 폐기합니다. 막 스택의 나머지는 상기 슬라이드의 일면을 커버하며 촬상 챔버의 벽을 만드는 데 사용된다.
5. 직선 에지와 제 2 슬라이드를 사용하여, 약 10 스트립 폭이 각각 2-4 비어서 슬라이드의 장축을 따라 적층 필름 층을 절단.
6. 수직으로 적층 된 파라핀 막층 컷슬라이드의 단축에 따라, 단계 4.5에서 이루어진 삭감, 스트립 폭을 2-4 mm의 길이는 23-24 mm의 두께 3-4 층을 생성한다.
7. 45 ° 각도에서 면도칼을 사용하여 절단 스트립을 껍질입니다. 집게를 사용하여 균일하게 챔버의 원하는 번호를 만들 깨끗한 현미경 슬라이드에 컷의 필름 스트립을 배포 할 수 있습니다. (4 개 파라핀 필름 스트립 제조) 최대 3 챔버는 하나 개의 슬라이드 상에 생성 될 수있다.
8. 필름 스트립 위에 단일 커버 슬립을 놓고 포셉 위치로 이동.
9. (이 약 핫 플레이트에서 가장 낮은 매체 설정), 준비한 슬라이드를 배치 ~ 95 ℃로 설정된 핫 플레이트상에서 최대 커버 슬립. 필름 스트립 (약 3 분) 반투명까지 슬라이드를 가열하고 밀봉 슬라이드 부드럽게 핀셋 커버 슬립에 의해 함께 가압 커버 슬립.
   참고 :이 C 이상 지역을 긁적로, 파라핀 필름 스트립 바로 위에있는 커버 슬립의 지역에서만 언론에 중요하다hambers 이미지 품질을 감소 할 수 있습니다. 슬라이드를 과열되지 않도록주의; 기화 막 의지 코트 부착 세포를 방지 소수성 필름과 상기 챔버의 내부.
10. (슬라이드가 뜨겁) 열판에서 슬라이드를 제거하고 커버 슬립면이 위를 향하도록 냉각 그것을 따로 설정하는 집게를 사용하여; 슬라이드가 냉각됨에 따라,이 영화는 흰색, 불투명 한 색채로 돌아갑니다.
    참고 :이 시점에서, 슬라이드는 배양 된 효모 세포를로드 할 준비가 된 것입니다. 추가 슬라이드이 시점에 만들어 무기한 금액 깨끗하고 건조한 장소에 저장 될 수있다.

준비 유량 용기 슬라이드로 5.로드 효모 세포

1. 콘 카나 발린 A (2 ㎎ / ㎖ 멸균 다이 하이드로 ₂ O)에서의 고정 된, 200 μL의 분취 량을 해동.
2. 개방 단부 중 하나에 피펫 팅에 의해 제조 된 각각의 슬라이드 챔버 해동 콘 카나 발린 (A)의 약 100 μL를 추가한다. 챔버를 채우기에 충분한 콘 카나 발린를 추가합니다. 이 S에 대한TEP의 콘 카나 발린 A를 모세관 작용을 통해 상기 챔버를 통해 인출된다.
3. 콘 카나 발린 A는 커버 슬립 (즉, 챔버)에 부착 할 수 있도록 5 개의 분 동안 미세 원심 분리 튜브 랙 또는 펜 사이 슬라이드, 커버 슬립 다운을 중단.
4. 커버 슬립 업 위치로 슬라이드를 돌려줍니다. 콘 카나 발린 A를 제거하는 완전 합성 배지, 배와 챔버 부피 챔버 워시 (약 200 μL 상기 단계 5.2에서 판정)
   1. 동시에 다른 신선한 유체로 피펫 팅하면서 상기 챔버의 일단 밖으로 유체 그릴 종이 타월의 모서리 또는 반으로 접은 여과지를 사용하여 상기 챔버를 통해 매질을 흐른다. 또한, 다른에 신선한 액체를 피펫 팅하면서 조심스럽게 한쪽 끝에서 유체를 그릴 진공 흡입기를 사용합니다.
5. 지향 유량 운전 방식을 사용한다 (단계 3.4)에서 세포 현탁액의 챔버 체적 (약 200 μL) 2X 흘려 로드셀단계 5.4.1에서 설명 거라고.
   참고 : 목표는 이미지에 커버 슬립에서 세포의 단일 층이다. 따라서, 이들은 서로의 상부에 쌓아하지 않도록 충분히 작지만 충분한 세포가 화상 전환 당 최대 데이터 량을 수집하기 위해 필드에 존재하는만큼 많은 세포의 농도를로드하는 것이 중요하다. 챔버 내의 세포의 최적 농도는 변할 수 있으며 경험적으로 결정되어야한다. 상기 유동 챔버에서 세포의 농도를 증가 부드럽게 2 분 동안 1,000 XG에서 세포 배양 펠릿, 상층 액의 일부를 제거한다. 세포의 농도를 감소 세포 현탁액에 합성 신선한 완전 배지를 추가한다. 세포의 농도는 위상차 현미경의 챔버를 검사하여 (아래) 5.7 단계 후에 평가 될 수있다. 이 시점에서 추가적인 세포들은 세포 현탁액에 유동시킴으로써 챔버에 첨가 될 수있다. 그러나,이 시점에서 세포 밀도를 감소시키는 것은 가능하지 않으며 가장 달성희석 된 세포 현탁액에 새로운로드하여 챔버.
6. 세포는 커버 슬립에 부착 할 수 있도록 10 분 동안, 단계 5.3에 기재된 바와 같이, 슬라이드 커버 슬립 다운 매달려.
7. 4X 통해 완전 합성 배지 챔버 용적 (약 400 μL)을 흐르는 의한 접착되지 않은 세포를 세척. 이 이미지 수집을 오염시킬 수 챔버 내의 자유 부동 세포를 제거합니다.
8. 조심스럽게 커버 슬립의 가장자리에 메 니스 커스를 가져, 종이 타월의 깨끗한 코너 챔버의 각 단부를 건조.
9. 따뜻한 (75 ° C)와 밀봉 챔버의 각각의 단부를 밀봉 (예 VALAP; 등분 바셀린, 양모 왁스, 파라핀 왁스).
   참고 :이 시점에서, 슬라이드 이미지에 대한 준비가되어 있습니다. 챔버는 각각의 챔버에서 세포의 밀도에 따라서, 최대 9 시간 동안 이미지화 될 수있다. 세포를 서서히 세포를 변위 기포를 생성한다 이산화탄소 시간 경과 (CO _2)를 생성한다.

6. 이미지 획득

1. 1.45 NA 100X CFI 플랜 아포 목적, 압전 단, 회전 디스크 공 초점 스캐너 유닛, 조명 레이저 및 EMCCD 카메라를 구비 한 반전 된 현미경 슬라이드를 준비한다. 획득 동안 상온 (25 ° C에서)에서, 스테이지의 온도를 유지한다.
   주 : 높은 개구가 더 큰 이미지 해상도를 허용하고, 압전 단 고속 Z 스택 획득을 가능하게한다. 현미경 최소 요건은 100X 대물 렌즈, 조명, 레이저 및 EMCCD 카메라이다.
2. 초점 세포를 가져와. 획득 필드가 그룹화 셀 슬라이드를 검색하여 모여 적어도 5-6 셀이 있는지 확인.
   참고 : 한번에 하나의 셀보다 더 많은 화상으로 필요한 것은 아니지만, 동일한 필드에 화상 복수의 셀 데이터의 품질을 손상시키지 않고, 데이터 수집의 효율을 향상시킨다. 그러나, 그 중요세포는 같은 초점면에있는 서로의 위에 쌓여 없습니다.
3. 시간이 지남에 따라 다중 Z 시리즈를 수집하는 다차원 취득 프로그램.
   1. 다음 활성 취득 설정 내의 설정을 조정 : 총 Z 심도 = 6㎛의은 전체 효모 세포를 포함하는 단계; Z-스텝 크기 = 300 nm 인은 오버 샘플링없이 광의 수집을 최대화하는 단계; 총 지속 시간 = 10 분; 시간 간격 = Z 시리즈의 모든 4; 노출 시간 = 각각의 Z 평면에 대한 MS (90)와.
      주 : 최적의 노출 시간은 카메라, 여기 광원 및 기타 요인에 따라 달라집니다. EMCCD 측정 화소 값에 기초하여 신호를 세포질에서 GFP 표지 랄 미세 소관에서 신호 : 1의 비율로 일반적으로 최적 노출 시간은 3을 달성하기 위해 필요한 최소한의 시간이 될 것이다.
4. '실행'을 클릭하여 인수를 시작합니다. 는 전체 10 분 동안 실행할 수 있습니다. 이미지로 데이터를 저장시리즈 (티파니 또는 .nd2).
5. 챔버 내 이미지에 새로운 필드를 선택하고를 반복 6.2-6.4 단계를 반복합니다.
   주 : 하나의 챔버는 챔버 내의 세포 밀도에 따라 세포의 15 내지 20 필드를 수득한다. 챔버 내의 CO _2가 더 빨리 구축 할 예정으로 높은 세포 밀도는 낮은 총 필드를 얻을 것입니다.

7. 이미지 분석

1. ImageJ에 (에서 이미지 파일 열기 https://imagej.nih.gov 바이오 형식 가져 오기 플러그인을 사용하여 hyperstack 등을).
   1. ImageJ에 열기와 직접 제어 패널 상에 (6)에서 취득 된 화상 스택 드래그. 바이오 형식의 수입이 자동으로 시작됩니다. hyperstack로 이미지 스택을로드 "확인"을 선택합니다.
      참고 : "바이오 형식 가져 오기 옵션"프롬프트를 열고 "스택보기"섹션에서 다음을 확인합니다 "를보기 스택 :"설정을 "Hyperstack"; 그리고 "스택 순서"로 설정되어 "XYCZT."
2. Z 축 프로젝트 함수를 사용하여 최대 강도의, 2 차원 투영으로 각각 Z 시리즈 축소.
   1. "영상"메뉴의 "스택"하위 메뉴, 그리고 "Z-프로젝트"기능을 선택합니다. 드롭 다운 목록에서 "최대 투사"을 선택하고 "확인"을 클릭하십시오.
3. "프로세스"메뉴에서 "검색"메뉴와 "중간"기능을 선택하여 반점 소음을 줄이기 위해 이미지 스택에 중간 필터를 적용합니다. 반경 상자에 2.0 픽셀을 입력하고 "확인"을 클릭하십시오.
4. 현장에서 사전 anaphase (핵분열 말기) 세포를 식별합니다.
   주 : 이들은 중형 새싹 및 짧은 방추사, 1.5 μm의 길이 (도 1; 짧은 유사 분열 스핀들 화살촉 점)을 특징으로한다. 그들은 일반적으로 단지 철을 전시하기 때문에이 단계에서 세포는 미세 소관 역학 분석에 이상적입니다스핀들 극 ⁷ 발산 w 랄 소관. 별이 미세 소관은 세포질에서 더하기 위해, SPB에 마이너스 측에서 균일 한 GFP 신호 강도를 나타내는 선형 필라멘트로 식별 될 수있다.
5. 더하기 위해, 별의 미세 소관과 더 강하게 표지 스핀들 미세 소관의 접합부에있는 마이너스의 끝에서, 단일 랄 미세 소관을 따라 선을 그리 분할 선 도구를 사용하여, 화상 시리즈의 첫 번째 평가시기부터 세포질에있는 (도 1의 적색 선을 참조). 분할 선을 완료하기 위해 미세 소관의 말을 두 번 클릭합니다.
6. 키보드의 "M"버튼을 눌러 "측정"기능을 사용하여 결과 테이블의 측정 값을 기록합니다.
   참고 : 같은 회색 강도와 같은 추가 기능은 "분석"메뉴에서 측정을 설정하고 "설정 측정"메뉴에서 녹음 할 수 있습니다.
7. Z 축 슬라이더 막대의 오른쪽 화살표를 클릭하거나 키보드의 "./>"키를 눌러 중 하나에 의해 다음 평가시기 진출. 반복 이미지 시퀀스의 모든 시점들에 대한 7.5 및 7.6 단계를 반복합니다.
8. 결과 테이블에서 데이터를 복사하여 스프레드 시트에 붙여 넣습니다. 선택하여 데이터를 저장 "으로 저장합니다."
   참고 : 라인 (즉, 별 미세 소관)의 길이를 나타내는 일련의 평가시기를 나타내는 조각, 및 길이를, 이러한 측정은 여러 값을 포함하지만, 가장 중요한 가치이다. 다른 측정을 포함하는 열 유지 또는 폐기 될 수있는 하나 (예를 들면, 영역은, 화소 값, 각도 등을 의미한다).
9. 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 '삽입'기능을 사용하여 스프레드 시트에 새 열을 만듭니다. 입력 각 시간 지점의 시간 (s).
10. "삽입 라인을 사용하여 시간 (들)의 함수로 미세 소관의 길이 (μm의)의 XY 분산 플롯 만들기차트 "기능, 같은 길이 측정 선택"Y "를하고 시간 열"X. "
    1. 단계 7.10의 산점도 시간에 걸쳐 길이 포지티브 및 네거티브 변화를 보면, 중합, 탈 중합, 및 일시의 영역을 식별한다.
       주 : 중합 사건 3 개 시점들 최소 걸쳐 적어도이 0.5㎛로 미세 소관의 길이를 증가 및 R ² ≥ 0.9 및 R 값> 0 (도 1b 및 D, 녹색 점)과 선형 회귀를 장착한다. 해중합 이벤트 시점들 (3)의 최소 가로 질러 적어도 0.5 ㎛의 미세 소관으로의 길이 감소 및 R ≥ 0.9 ⁽²⁾ 및 R 값 <0 (도 1b 및 D, 핑크 점)과 선형 회귀를 장착한다. 일시 정지 이벤트는 중합 및 해중합 별개입니다. 일시가 0.5㎛ 미만인 시점들 (3)의 최소 길이에 걸쳐 미세 소관 순 변화로서 정의된다;-0.4 0.4 사이의 R 값과의 선형 회귀 적합; 및 F 테스트에 의해 결정되는 0과 유의 한 차이가 아닌 기울기를 갖는다.
    2. 가이드로 산포도를 사용하여 길이 변화가 긍정적 인 경우 시간의 부분을 파악하고 녹색 색상을 강조. 길이 변화가 핑크 컬러에 부정적 일 때 시간의 영역을 강조 표시합니다.
    3. 각각의 선형 회귀 섹션 강조 계산하고 근위 영역에 열의 각 섹션의 R- 및 R ² - 값을 기록한다. 중합 이벤트 또는 해중합 이벤트 중 각 색 영역을 분류.
11. 각 성장 이벤트에 대한 시간의 변화에 ​​의해 길이의 순 변화를 나누어 중합 속도를 계산합니다. 단계 7.10.3에서 선형 회귀 값 열의 결과 인접한 기록한다.
12. 각 shrinkin 시간의 변화에 ​​의해 길이의 순 변화를 나누어 해중합 속도를 계산g 이벤트. 7.11 단계에서 중합 속도 값을 열의 결과 인접한 기록한다.
13. 모든 성장 이벤트 ^(13)의 총 시간 중합 투 해중합 천이의 수를 분할함으로써 재난 주파수를 계산한다. 단계 7.12의 해중합 속도 값 열의 결과 인접한 기록한다.
14. 모든 수축 이벤트 ^(13)의 총 시간으로 해중합 투 중합 천이의 수를 나눈 구조 주파수를 계산한다. 단계 7.13의 대참사 주파수 값 열의 결과 인접한 기록한다.
15. 7.10.1 단계에서 산출 된 화상 취득의 총 길이를 기준으로 모든 길이 변화의 절대 값의 합을 분류하고, ¹⁴ 초마다 튜 불린 서브 유닛을 얻었다 27.0833 곱해서 동성을 계산한다. 복구 주파수 브로 인접한 열에있는 이러한 결과를 기록단계 7.14에서 단말 및 결과 테이블을 저장합니다.
    참고 : 사용자 정의 만든 프로그램을 사용하여 단계 7.10-7.15에서 설명한 분석 과정을 자동화 할 수 있습니다. (Estrem, 등을, 원고 제출). 프로그램은 위에서 설명 된 파라미터에 따라 길이를 측정에서 중합 해중합 기간을 식별하도록 설계된다.

결과

효모 살아있는 세포에서 미세 소관의 역학을 측정하는 것은 미세 소관 규제 또는 튜 불린를 코딩하는 유전자의 돌연변이가 영향을 중합 및 해중합 속도뿐만 아니라, 이러한 상태 간의 전환의 주파수를 소단위 방법을 평가하기위한 강력한 도구를 제공합니다. 그림 1 표시 야생형 세포에서 별 미세 소관 역학의 시간 시리즈 (430Δ tub2-) β-tubulin에 돌연변이...

토론

신진 효모 모델은 시간이 지남에 이미지 하나의 미세 소관의 능력과 효모 유전학의 도구를 사용하여 tubulin의와 미세 소관 규제를 조작 할 수있는 기능을 포함하여, 생체 내 환경에서 미세 소관 역학의 고해상도 측정을 수집하기위한 주요 이점을 제공한다.

콘 카나 발린 A-코팅 챔버 용융 아가 패드를 포함하여 전술 한 장치들상에서 다수의 이점을 제공한다. 챔버와 슬?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)