כלי אולטראסוניות גיאן לחסום במודלים עכברים סוכרתיים

Summary

עבודה זו מציגה את המתודולוגיה של החלת אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה כדי לחסום את פוטנציאל פעולה של עצבים נוירופתי סוכרתי.

Abstract

עצב בלוק בהולכה עם מתמר אולטרסאונד ממוקד בעוצמה גבוהה (HIFU) בוצעה במודלים של בעלי חיים נורמליים, סוכרת לאחרונה. HIFU הפיכה לחסום את הולכה של העצבים ההיקפיים ללא פגיעה בעצבים תוך שימוש פרמטר אולטראסוניות המתאים. בלוק זמני וחלקי פוטנציאל פעולה של עצבים מראה כי HIFU יש פוטנציאל להיות טיפול קליני יעיל להקלה בכאבים. עבודה זו ממחישה את נהלי לדכא את פוטנציאל פעולה של עצבים נוירופתי עכברים סוכרתיים ויוו באמצעות מתמר HIFU. השלב הראשון הוא ליצור למבוגרים זכר חולדות נוירופתי סוכרתי בזריקה streptozotocin (STZ). השלב השני הוא להעריך את נוירופתיה סוכרתית בחולדות סוכרת הנגרמת STZ על ידי בדיקה אלקטרונית של פון פריי צלחת חמה. השלב הסופי הוא שיא ויוו חוץ-תאית פעולה פוטנציאל של עצב חשוף HIFU sonication. השיטה שהראתי כאן יכולים ליהנות המחקר של יישומים כאבים אולטרסאונד.

Introduction

תרופות דרך הפה, דיקור סיני¹, גירוי עצבי חשמלי² שימשו לטיפול של פולינוירופתיה של סוכרתית כואבת. עם זאת, תופעות לוואי של תרופות דרך הפה, פעולה פולשנית של דיקור סיני, גירוי עצבי חשמלי ה"בלתי את היעילות הטיפולית ואת הדבקות של המטופל. אולטרסאונד בלוק של העצבים ההיקפיים במודלים של בעלי חיים נחקר במשך עשרות שנים-^3,-^4,-⁵. הולכה של במבחנה ממוגלה עצבים של הצפרדע הירוקה גדול היה עכבות הפיכה לאחר הטיפול של 10-20 פולסים של אולטרסאונד חשיפה של 0.4 - 1.0 s⁶. גורם אחד כדי לחסום גיאן הוא עליית הטמפרטורה המושרה על ידי אולטרסאונד⁷. עבור חולי פולינוירופתיה של, הדיכוי של פוטנציאל פעולה השריר מורכבים (CMAPs) בוצעה ב שיתוק נחשפים אולטרה סאונד בעוצמה נמוכה 2 דקות⁸. הפעם החלמה מלאה הייתה בתוך 5 דקות.

לאחרונה, מינהל המזון והתרופות של ארצות הברית אישרה HIFU לטיפול פולשני גידולים שרירנים ברחם⁹, כאב palliations של עצם גרורות¹⁰וסרטן הערמונית¹¹. מתמר HIFU פולט קרני אקוסטית מחוץ לגוף, ואת הקורות לשדר במדיומים שונים של רקמות מתכנסים הגידול היעד על המוקד. אזור מוקד נוצר באופן מיידי כדי ליצור אפקטים מותאמים לשפות אחרות על גידולים היעד מבלי לפגוע ברקמות שמסביב. HIFU הוחל גם לעכב את הובלת העצבים או לגרום עצב denervation ויוו ניסויים של חולדות רגילה ספראג-Dawley (SD)¹². בנוסף, ההשפעות לטווח קצר ולטווח ארוך של HIFU על העצבים נוירופתי כבר ובדוקים¹³. התוצאות הקודמות הפגינו הבלוק הפיך או קבועה של הובלת העצבים החישה יכולה להיות מושגת על ידי HIFU עם פרמטרים מתאימים. מלבד יישומים להרגעה, HIFU עשויה לשמש ככלי לחקור את התרומה היחסית של רכיבים היקפיים ומרכזי העצבים המצור הולכה מחקר בסיסי לנוירולוגיה והתפתחות של משכחי כאבים. לכן, נדרשת HIFU חסימה טכנולוגית פלטפורמה ספציפיות עבור העצבים ההיקפיים במודלים של בעלי חיים. מטרת מאמר זה היא כדי להדגים את ההליכים לחסימת באופן חלקי או מלא של פוטנציאל פעולה של העצבים ההיקפיים בחולדות נוירופתי סוכרתי מאת HIFU. עכברים סוכרתיים מודלים והערכת סימפטומים נוירופתי היקפיים הוקמו. פלטפורמה HIFU ותהליכים ניסיוני ספציפי לטיפול בבעיות עצבים ממוגלה עכברוש מוצגים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

טיפול בעלי חיים מוסדיים והוועדה שימוש ממכוני המחקר הבריאות הלאומי בטייוואן אושרו כל הפרוטוקולים בעלי חיים-

1. אינדוקציה דגם סוכרתית ב ספראג למבוגרים זכר - חולדות Dawley (SD)

1. להסיר עכברושים מזון כדורי מן הכלוב חולדות SD מהר זכר (300-350 גר') במשך 6 שעות לפני הגיוס STZ.
מאגר
2. הכן סודיום ציטרט (0.1 M, pH 4.5).
   1. 1.05 להמיס g monohydrate חומצה ציטרית (C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O; mol. wt. 210.14) ב- 50 מ ל מזוקקים מים כדי ליצור פתרון חומצה ציטרית 0.1 M.
   2. 1.47 להמיס g ציטראט trisodium וגופרית והרכבו (ג ₈ H ₅ או ₇ נה ₃ · 2 H ₂ O; mol. wt. 294.12) ב- 50 מ ל מזוקקים מים כדי ליצור פתרון סודיום ציטרט 0.1 M.
   3. להוסיף 25 מ ל חומצה ציטרית פתרון פתרון סודיום ציטרט 25 מ. לנטר את סודיום ציטרט מאגר רמת החומציות (pH 4.5) באמצעות מד pH.
      הערה: המאגר נעשית מול על ידי תוספת של אמצעי אחסון המתאים של הפתרון סודיום ציטרט 0.1 M.
3. לפזר STZ במאגר סודיום ציטרט 0.1 M להניב תשואה 50 מ"ג/מ"ל STZ פתרון.
   הערה: הפתרון STZ הוא רגיש אור, לכן, לכסות את הפתרון STZ ברדיד אלומיניום ולהשתמש תוך 15-20 דק...
4. לצייר את הפתרון STZ 50 מ"ג/ק"ג לתוך מזרק אינסולין או טוברקולין 1 מ"ל עם 26 - 28 מד המחט. נקיים ההזרקה עם רכיב pad אתנול, intraperitoneally להזריק את הפתרון STZ לתוך הרביע הימני. התחתון של הבטן כדי למנוע נזק אברי הבטן.
5. לספק חולדות עם 10% סוכרוז מים כמו מקור המים הבלעדי המשמש 48 שעות לאחר ההזרקה STZ למניעת היפוגליקמיה.

2. אישור של סוכרת בחולדות STZ-induced

1. צג ריכוז הגלוקוז בצום הפלסמה של כל החולדות מוזרק על ידי רופא STZ פוסט 72 h עם מד הסוכר.
   1. מהר העכברושים סוכרת הנגרמת STZ עבור h 15 לפני מדידה צום דם רמת גלוקוז.
   2. לרסן את החולדות בשקית איפוק ולחשוף את הזנב לאיסוף דם במהלך המדידות גלוקוז בדם.
   3. השתמש אזמל מנתחים דם כדי לדקור את קצה הזנב כדי לקבל טיפה קטנה של דם. מניחים את טיפת דם על רצועה בדיקת גלוקוז. להקליט את רמות הגלוקוז בצום פלזמה.
      הערה: מד הסוכר מזהה ומציגה רמת הסוכר בדם ביחידות של mg/dL. אל תכלול את החולדות עם רמות הגלוקוז בדם בצום מתחת 150 מ"ג/ד"ל לאחר 2 שבועות של STZ-אינדוקציה-

3. הערכה של נוירופתיה סוכרתית בחולדות סוכרתית

1. להעריך allodynia מכני עם פריי פון אלקטרונית.
   1. Habituate STZ-induced סוכרתית חולדות בכלוב על רצפת מתכת רשת שינוי בקוטר 1 ס מ במשך 30 דקות לפני הערכת האחוריות כף של תגובת נסיגה.
   2. בדיקה אלקטרונית של פון פריי עם טיפ נוקשה (0.8 מ"מ קוטר) כדי להחיל באופן ידני לחץ פני plantar הכפה האחוריות של החולדות ושימוש בהדרגה להגביר את הלחץ עד לתגובה נסיגה כפת נתפסת.
   3. להקליט את הלחץ זה מראה על המערכת וחזור על המדידה 5 פעמים לכל עכברוש, עם מרווח s 30 בין כל אחת מהמידות.
2. להעריך את hyperalgesia חום עם צלחת חמה.
   1. Habituate העכברושים סוכרתית STZ-induced בצלחת חמים (24 ± 0.5 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות לפני שמעריכים את התגובה לכאב.
   2. להסיר, מקם את החולדות בחזרה לתוך הכלובים אחרי habituation, מחממים את הכיריים ולתחזק את הכיריים ' s טמפרטורה ± 0.5 55 מעלות צלזיוס
   3. במקום העכברוש על פלטה מחוממת בעת הפעלת בו זמנית את הטיימר.
   4. כאשר העכברוש תערוכות התנהגויות שונות, כגון ליקוק כף האחוריות או באופן חריג יתנגש האחוריות כף, לעצור את שעון העצר ולהקליט ההשהיה גמילה.
      הערה: אם עכברוש לא להביע התנהגויות ברורים לאחר 20 s (זמן ניתוק s 20), לסיים את המבחן פלטה ולהסיר את העכברוש הכיריים.

4. אין ויוו עצבים הולכה חסימה עם מתמר HIFU

הערה: הניסוי ויוו מתחיל בשבוע 5 לאחר ההזרקה STZ 50 מ"ג/ק"ג.

1. לבצע הליכים בעלי חיים לפני חסימת CMAPs עם HIFU sonication.
   1. לחטא כלים כירורגיים (אזמל, מספריים, מלקחיים ו זכוכית הוק) ב החיטוי לפני הניתוח.
   2. עזים ומתנגד החולדות עם הזרקת בקרום הבטן של תערובת tiletamine/zolazepam (40 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10 מ"ג/ק"ג) או באמצעות אינהלציה של 1.75% איזופלוריין ויה איזופלוריין מאדה. מניחים את החולדות על כרית החימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף.
   3. למקם את החולדות לניתוח ב- recumbency הגחון. להחיל את המשחה בעין. להרחיב את הרגל של העכברוש וצבטתי השטח plantar של כף הרגל עם הציפורניים כדי לברר את עומק ההרדמה. אם החולדות הצגת התגובות גמילה, להחיל הרדמה נוספים-
   4. להסיר שיער מן הירך והורד האחורי של החולדות עם קוצץ חשמלי. החלת יוד נוזלי עם גזה נקייה באתר כירורגית ולעבור באופן מעגלי הגזה כלפי חוץ של האתר כירורגית. השתמש כרית אלכוהול לנגב יוד נוזלי באותה תנועה מעגלית. ניסוי זה מתבצע באתר כירורגי ישר ושמאלה. חזור על הפעולות באתר כירורגיים אחרים מתי לבצע את השלב הבא של הליך.
   5. השתמש מספריים כירורגיים סטרילי או אזמל לבצע חתך של העור הירך הגבי. שימוש בוטה מספריים כירורגיים בקפידה להפריד את רקמת מתחת לעור ולאבטח את העור עם ווים העור. עצם הירך ניתן לראות בתוך השרירים.
   6. להשתמש המספריים הפרד בזהירות את השרירים במקביל הירך עד הסיבים בעצב הירך אמצע המוטבעות השרירים גלויים. להשתמש בזהירות קרס זכוכית להפריד את אמצע הירך בעצב רקמות החיבור שמסביב ואת השרירים.
2. למקם בעצב באזור מוקד HIFU באמצעות fixator של העצב בהזמנה אישית ( איור 1, איור 3).
   הערה: fixator עצב בהזמנה אישית כולל 3 רכיבים ( איור 3). כל הרכיבים עשויים polymethylmethacrylate שקוף (PMMA). החוט החיצוני של המבנה העליון של רכיב אני נמצא בגובה 2.5 מ"מ ו- M10XP0.7 ( איור 4A). הבאר המרכזית היא 4.0 מ"מ-קוטר חור דרך הרכיב. הפתח התחתון של הבאר חתומה על ידי גיליון של נייר דבק. הקוטר של החריץ הוא 1.2 מ מ, מ מ 3.1. המרחק בין המטוס המרכזי של החריץ המשטח העליון של רכיב אני הוא הרכיב השני מורכב הגוף העיקרי, ארבע רגליים ו המבנה התחתון ( איור 4B). החוט הפנימי של המבנה התחתון הוא בגובה 2.5 מ"מ ו- M10XP0.7 כדי להתאים את החוט החיצוני של רכיב אני. קוטר החור המרכזי הוא זהה לבאר המרכזית של רכיב אני. ממדי הגוף העיקרי הם 32 מ מ קוטר ו- 5.4 מ מ עובי. ארבע רגליים נפרסות באופן סימטרי. שתי רגליים קצרות זהה מיועדים יישור ולעבוד שתי רגליים ארוכות זהים על זנות על הרכיב השלישי. הקוטר החיצוני והגובה של הרכיב השלישי הם 41 מ מ 9.2 mm. החוט הפנימי הוא M36XP1.0 והוא החור עד 27.5 מ מ קוטר (< מחלקה חזקה = "xfig"> 4C איור). קונוס הוא נר חלול עם הפתח העליון של 84 מ מ קוטר, הפתח התחתון של 27.5 מ מ קוטר. הגובה הוא 57.5 מ"מ ( איור 5A).
   1. לפני הניסוי, להשרות את fixator עצב אקריליק מחוייט אקונומיקה-פתרון עבור 30-60 דקות ולאחריו השריה במים סטריליים.
   2. בעזרת וו זכוכית, להרים את העצב בזהירות ושים אותו בחריץ של רכיב א
   3. בורג לרכיב השני רכיב אני מילוי המרכזי טוב של רכיב אני עם צלצול ' s פתרון לשימור הפצת ועצב אולטראסוניות.
   4. בורג לרכיב השלישי HIFU דיור קונוס. Dock הרכיב השלישי עם הרכיב השני דרך ארבע הרגליים של הרכיב השני.
      הערה: המרכז גיאומטרי של שלושת הרכיבים ו המתמר מיושרים. המרחק בין העצב המתמר שווה לאורך המוקד, אשר מבטיח העצב בתוך אזור מוקד HIFU.
3. להוסיף זוג אחד של דיקור מחטים לתוך המקור בעצב את הזוג השני לתוך שריר הסובך. להתחבר לכל זוג מחטים אלקטרופיזיולוגיה רכישת המערכת דרך כבל קואקסיאלי חשמל ( איור 1).
   הערה: על קצה אחד של הכבל הם שני סרטונים אליגטור קליפ שתי מחטים בנפרד, בקצה השני של הכבל הוא מחבר BNC לקשר את המערכת. הזוגות של מחטי אקופונקטורה לעבוד וגם אלקטרודות מגרה-בעצב האלקטרודות הקלטה לשריר הסובך.
   1. להגדיר את קצב הדגימה ואת רוחב הפס של מערכת רכישה אלקטרופיזיולוגיה כדי 50 הרץ ו 70 הרץ - 3 קילו-הרץ, בהתאמה. חלות גירוי העל-מקסימלי עם רוחב הדופק של 0.1 ms האלקטרודות מגרה על המקור של עצב.
   2. להקליט את CMAPs בין האלקטרודות הקלטה ומגבירים את CMAPs עם המגבר המובנה במערכת רכישת אלקטרופיזיולוגיה-
      הערה: השתמש המגבר המובנה במערכת רכישת אלקטרופיזיולוגיה כדי להגביר את המסרים העצביים ולהקליט את CMAPs בין האלקטרודות הקלטה עם מערכת רכישה אלקטרופיזיולוגיה-
4. שימוש מסחרי 2.68 MHz HIFU מתמר לדכא את CMAPs בחולדות נוירופתי סוכרתי.
   הערה: המפרט של המתמר מתוארים כדלקמן: רכיב בודד כדורית קערה עם קוטר הצמצם של 6 ס מ, אורך מוקד של 5 ס מ, ואת אזור מוקד אליפסואיד של 4 מ מ לעומק של 0.8 מ מ רוחב בשטח חינם.
   1. Immerse קונוס כדורית, מתמר HIFU והחרוט מכסה למיכל מלא במים degassed. מכניסים את מתמר HIFU קונוס כדורית ותקן השער חרוט אל הפתח העליון של קונוס כדורית על ידי 6 ברגים ראש ( איור 5B). לאחר בועות קונוס כדורית מגורשים באופן טבעי בשל צפיפות נמוכה של בועות לעומת מים, חותם הפתח החזיתי של קונוס על ידי קלטת מ מ 0.03 נקודות שקוף עבה. בורג הרכיב השלישי על גבי כדורית קונוס.
   2. להוציא את מתמר HIFU עם חרוט כדורית, הרכיב השלישי ממיכל המים degassed.
      הערה: מים אוסמוזה הפוכה השתמשו במחקר זה המים מטוהרת על-ידי התהליך של אוסמוזה הפוכה. מים אוסמוזה הפוכה מורתח לגרש את הגז. לאחר קירור המים degassed מתקבל במיכל אטום בודד.
5. את רכיב אני אל החלל בין העצב לשריר בקפידה, ומקם את העצב בהפער של רכיב א לבצע צעדים 4.2.3 4.2.4 על מנת להבטיח כי העצב בתוך אזור מוקד של HIFU ( איור 3A < / חזק >).
6. קישור מחולל אותות, מגבר כוח גלי רדיו. לחבר מגבר כוח את המתמר HIFU לדור של קרן HIFU. באופן ידני להגדיר הפלט מתח של מחולל HIFU מתמר דרך המגבר כוח. לבטל באופן ידני את הגנרטור פונקציה ברגע נגמר הזמן HIFU-חשיפה. להתבונן זמן שימוש בשעון עצר.
   הערה: עוצמת האנרגיה של קרן HIFU השתמשו במחקר זה הם W/cm 2,810 ² ו- 84 מ"מ/J ², בהתאמה.
7. בו זמנית, לספק את הגירוי דרך מערכת רכישה electrophysiology (שלב 4.3) ואת HIFU קרן דרך מערכת HIFU (שלב 4.6) בעצב בזמן הקלטת את CMAPs. הארך בהדרגה את החשיפה HIFU בעצב 3 s, 5 s כדי 8 s עד נצפית ירידה או עיכוב של משרעת של CMAPs.
   1. שיא CMAPs פעם אחת לשניה במהלך מסירת HIFU קרן. לאחר התבוננות בשינוי משרעת של CMAPs, כבה את מנגנון HIFU, באופן ידני, לחץ על סמל הרשומה על התוכנה רכישת אלקטרופיזיולוגיה לרשומה CMAPs כל 2 דקות תוך עשר דקות מוקדם, כל 5 דקות 30 דקות רצופות, ואני בכל 10 דקות ב- שלב אחרון עד זמן ההקלטה מגיע ה' 2
8. רכיב נפרד II ו- III של העצבים fixator ( איור 3) להסיר את המתמר HIFU החתך. רכיב נפרד השני ואני לשחרר בעצב מאובטחת. תפר באתר כירורגית של העכברוש סוכרתיים על ידי תפרים כרום 4-0 לאחר הקלטת את CMAPs. חלות יוד נוזלי באתר כירורגית למניעת זיהום.
   1. מקום הכלובים על כרית החימום ולאפשר העכברושים לשחזר בכלובים שלהם לפני החזרתם למתקן בעלי חיים. לספק את החולדות איבופרופן במי השתייה למשך 3 ימים או הזרקה בקרום הבטן של הבופרנורפין (0.05 - 0.1 מ"ג/ק"ג).
9. להוסיף אלקטרודות מגרה, הקלטה ב המקור בעצב את שרירי הסובך ומורדמת חולדות נוירופתי סוכרתי כפי שתואר בשלבים 4.1.2 ו- 4.3 בימים 7, 14, ו- 28 לאחר sonication HIFU הראשונית. חזור על שלבים 4.3.1 ל 4.3.2.
   1. מקום הכלובים על כרית החימום ולאפשר העכברושים לשחזר בכלובים שלהם לפני העברת הכלובים למתקן בעלי חיים-
10. המתת חסד העכברושים לאחר הניסוי. מקם את החולדה בחדר פחמן דו-חמצני. המתן כ 5 דקות על החולדות. תפסיק להתנשם. להבטיח כי הלב הפסיק לפעום.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

אין ויוו המחקר הראה כי, עם מנה HIFU של 3 s sonication בעוצמה W/cm 2,810², CMAPs דוכאו על-ידי 20% של הבסיס, אבל הם היו התאושש לגמרי לאחר 30 דקות (איור 2 א, יהלומים) והיו כמעט קבוע בתקופה של 28 ימים (איור 2B, יהלומים). 5 s HIFU החשיפה מעוצמת אותה, CMAPs ירד ל- 65.4% (9.5%)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

חלקית, זמנית דיכוי של action potentials של העצבים נוירופתי עכברים סוכרתיים ויוו , מופע מיידית של השפעת החסימה לאחר הטיפול HIFU שניהם נצפו. מחקר מעקב 28 יום על CMAPs הוכיח כי מצור בטוח של תסמונת גיאן יכול להתבצע בדלפק חשיפה HIFU המתאים. כתוצאה מכך, הפרוטוקול הנ של הטיפול HIFU יכול לספק פתרון חלופי עבור הב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
streptozotocin	Sigma	85882
citric acid monohydrate	Sigma	C1909
trisodium citrate dihydrate	Sigma	W302600
glucose meters	Roche Accu-Check Active	GC
electronic von Frey device	IITC Life Science	2390
hot plate	IITC Life Science
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
HIFU transducer	Sonic Concepts	H108
function generator	Agilent	33250A
power amplifier	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vet ointment	Dechra
isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurance	Attane
Restraint bag (Decapicones)	Braintree Scientific	DC 200