당뇨병 쥐 모델에서 신경 전도 대 한 초음파 도구 차단

요약

이 작품 당뇨병 neuropathic 신경의 활동 전위를 차단 하 고 강도 집중 된 초음파를 적용 한 방법론을 제공 합니다.

초록

고 강도 집중 된 초음파 (장내) 변환기와 신경 전도 블록 정상과 당뇨병 동물 모델에서 최근 수행 하고있다. 장내는 적절 한 초음파 매개 변수를 사용 하 여 동안 신경 손상 없이 역 주변 신경의 전도 차단할 수 있습니다. 신경의 활동 전위의 일시적이 고 부분적인 블록이 보여줍니다 장내 통증에 대 한 유용한 임상 치료 될 가능성이 있다. 이 작품에서는 당뇨병 쥐에 에서 vivo 장내 변환기를 사용 하 여에 neuropathic 신경의 활동 전위를 억제 하는 절차를 보여 줍니다. 성인 남성 당뇨병 neuropathic 쥐 streptozotocin (STZ) 주입에 의해 생성 하는 첫 번째 단계가입니다. 두 번째 단계 전자 폰 Frey 프로브와 뜨거운 접시 STZ 유도 된 당뇨병 쥐에서 주변 당뇨병 신경 장 해를 평가 하는 것입니다. 마지막 단계는 세포 외 활동 전위 신경 장내 쥡니다에 노출의 기록 vivo에서 . 여기 보여 메서드 초음파 진통 응용 프로그램의 연구에 혜택을 받을 수 있습니다.

서문

구두 약물,¹, 침술 그리고 전기 신경 자극² 고통 스러운 당뇨 증의 치료를 위해 사용 되었습니다. 그러나, 구두 약물, 침술, 전기 신경 자극의 침략 작전의 부작용 치료 효능과 환자의 준수 방해. 동물 모델에서 말 초 신경의 초음파 블록 수십 년^3,,45에 대 한 조사는. 큰 녹색 개구리의 좌 골 신경 생체 외에서 의 전도 0.4-대 한 초음파 노출의 10-20 펄스의 치료 후 역 저해 1.0 s⁶. 신경 전도 차단 한 요소는 초음파⁷에 의해 유도 된 온도 상승. 증 환자, 복합 근육 활동 전위 (Cmap)의 억제는 2 분⁸에 대 한 저 강도 초음파에 노출 비 골 신경에서 수행 되었다. 전체 복구 시간 5 분 이내 했다입니다.

최근, 식품 및 의약품 안전 청은 미국의 자 궁 유 섬유 종양⁹, 뼈 전이¹⁰, 전립선 암¹¹의 고통 palliations에 대 한 비-침략 적 치료로 장내를 승인. 장내 변환기, 몸 밖에 서 음향 광선 방출 그리고 광선 다양 한 조직 매체에 있는 초점에 대상 종양에 수렴. 초점 영역 즉시 주변 조직 손상 없이 대상 종양에 대 한 지역화 된 효과 생성 하기 위해 형성 된다. 장내는 또한 신경 전도 억제 하거나 정상적인 Sprague-Dawley (SD) 쥐¹²의 비보에 실험에서 신경 denervation에 적용 되었다. 또한, neuropathic 신경에 장내의 단기 및 장기 효과 조사¹³되었습니다. 이전 결과 감각 신경 전도의 가역 또는 영구 블록 장내에 의해 적절 한 매개 변수와 함께 달성 될 수 있다고 설명 했다. 진통 응용 프로그램 외 장내 주변 및 중앙 신경 전도 봉쇄 신경과의 기초 연구 및 진통제의 개발에 대 한 구성 요소의 상대적 기여도 조사 하는 도구로 사용 수 있습니다. 따라서, 장내 차단 기술 플랫폼 동물 모델에서 주변 신경에 대 한 특정 필요 합니다. 이 문서의 목적은 부분적으로 또는 완전히 차단 장내에 의해 당뇨병 neuropathic 쥐에 주변 신경의 활동 전위에 대 한 절차를 설명 하는 것입니다. 당뇨병 쥐 모델 및 주변 neuropathic 증상의 평가 설치 되었다. 장내 플랫폼 및 실험 프로세스 쥐 좌 골 신경 치료에 대 한 특정 표시 됩니다.

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프로토콜

기관 동물 관리 및 사용 위원회 대만에서 국립 건강 연구소의 모든 동물 프로토콜 승인.

1. 남성 성인 Sprague-Dawley (SD) 쥐에서에서 당뇨병 모델 유도

1. STZ 유도 전에 6 h에 대 한 빠른 남성 SD 쥐 (300-350 g)에 쥐 음식 펠 릿 케이지에서 제거.
2. 준비 나트륨 구 연산 염 버퍼 (0.1 m M, pH 4.5).
   1. 분해 1.05 g 구 연산 산 성 일 수화물 (C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O; mol. wt. 210.14) 50ml에 증류수 0.1 M 구 연산 산 성 솔루션.
   2. 분해 1.47 g trisodium 시트르산이 수화물 (C ₈ H ₅ O ₇ 없음 ₃ · 2 H ₂ O; mol. wt. 294.12) 50 mL에 증류수 0.1 M 나트륨 구 연산 염 솔루션.
   3. 25 mL 나트륨 구 연산 염 해결책을 추가 25 mL 연산 솔루션. 나트륨 구 연산 염 버퍼 pH (pH 4.5) 모니터링 pH 미터를 사용 하 여.
      참고: 버퍼 이루어집니다 isotonic 0.1 M 나트륨 구 연산 염 해결책의 적절 한 볼륨의 추가 의해.
3. STZ 솔루션 50 mg/mL를 0.1 M 나트륨 구 연산 염 버퍼의 분해 STZ.
   참고: STZ 솔루션 빛에 민감한 따라서 커버 알루미늄 호 일로 STZ 솔루션 이며, 15-20 분 이내 사용
4. 50 mg/kg STZ 솔루션 1 mL 인슐린 또는 투베르쿨린 주사기로 26-28 게이지 바늘. 클린 에탄올 패드 사출 사이트 그리고 intraperitoneally의 손상을 방지 하려면 복 부의 더 낮은 오른쪽 사분면에 주입 STZ 솔루션 복 부 기관입니다.
5. 저 혈당을 방지 하기 위해 STZ 주입 후 48 h에 대 한 유일한 물 소스로 10% 자당 물으로 쥐를 공급.

2. STZ 유발 쥐에서 당뇨병 확인

STZ에 의해 주입

1. 모니터 모든 단식 플라스마 포도 당 농도 쥐 포도 당 미터와 72 h 게시.
   1. 빠른 금식을 측정 하기 전에 15 h STZ 유도 된 당뇨병 쥐 혈액 포도 당 수준.
   2. 구속 가방에 쥐를 억제 하 고 혈액 포도 당 측정 동안 혈액 컬렉션에 대 한 꼬리를 노출.
   3. 녀석이 작은 한 방울의 피를 꼬리의 끝에는 소모품을 사용 합니다. 포도 당 테스트 스트립에 혈액 방울을 놓습니다. 단식 플라스마 포도 당 수준 기록.
      참고: 포도 당 미터 감지 하 고 혈액 포도 당 수준 mg/dL의 단위로 표시 됩니다. STZ-유도의 2 주 후 150 mg/dl 단식 혈액 포도 당 수준으로 쥐 제외.

3. 당뇨병 쥐에서 주변 당뇨병 신경 병의 평가

평가 기계 용어인 전자 폰 Frey와

.
1. Habituate STZ 유도 된 당뇨병 쥐에는 뒷 다리를 평가 하기 전에 30 분 동안 1 cm 직경 금속 메쉬 바닥에 발 철수 응답.
2. 엄밀한 팁 (직경에서 0.8 m m)와 전자 폰 Frey 프로브를 사용 하 여 수동으로 쥐의 뒷 발의 발바닥 표면에 압력을 적용 하 고 발 철수 응답을 볼 때까지 점차적으로 압력을 증가.
3. 압력 시스템에 표시 하 고 각 측정 사이 30 s 간격으로 쥐 당 5 회 측정 반복 기록.
1. 뜨거운 접시와 열 통을 평가.
   1. 고통 응답을 평가 하기 전에 10 분 동안 핫 플레이트 (24 ± 0.5 ° C)에 STZ 유도 된 당뇨병 쥐를 길 들.
   2. 제거 및 쥐 다시 그들의 감 금 소에 habituation 후, 핫 플레이트를 열 놓고 핫 플레이트 유지 ' 55 ± 0.5 ° c.에 s 온도
   3. 동시에 타이머를 시작 하는 동안 온수 핫 플레이트에 쥐를 놓고.
   4. 별개 행동을 전시 하는 쥐, 핥는 등은 뒷 발 또는 비정상적으로 터치는 뒷 발, 타이머를 중지 하 고 철수 대기 시간을 기록.
      참고: 경우에 쥐 20 후 별개 행동을 표현 하지 않는다 s (20 s 마감 시간), 핫 플레이트 테스트를 종료 하 고 뜨거운 접시에서 쥐를 제거.

4. Vivo에서 장내 변환기와 전도 차단 신경

참고: vivo에서 실험 50 mg/kg STZ 주입 후 주 5에 시작.

수행 동물 절차와 장내 쥡니다 Cmap의 차단 하기 전에

.
1. 수술 전에 압력솥에 수술 도구 (메스가 위, 집게, 및 유리 후크) 소독.
2. Anesthetize tiletamine/zolazepam 혼합 (40 mg/kg) 및 xylazine (10 mg/kg)의 복 주입 또는 흡입을 통해 isoflurane 기화 기를 통해 isoflurane의 1.75%의 쥐. 체온을 유지 하기 위해 생리대에 쥐를 놓고.
3. 는 Recumbency 복 부에 수술에 대 한 쥐를 배치합니다. 눈 연 고를 적용 합니다. 쥐의 다리를 확장 하 고 마 취의 깊이 확인 하는 손톱으로 다리의 발바닥 표면 꼬집어. 쥐 철수 응답을 표시, 추가 마 취를 적용.
4. 는 허벅지에서 머리를 제거 하 고 전기 깎기로 쥐가 다시 낮은. 수술 사이트에 깨끗 한 거 즈로 액체 요오드를 적용 하 고 재생 거 즈 외과 사이트의 바깥쪽에 이동. 알코올 패드를 사용 하 여 동일한 원형 운동으로 액체 요오드를 닦아. 이 실험은 왼쪽과 오른쪽 수술 사이트에서 수행 됩니다. 다른 외과 사이트에서 절차를 반복 절차의 다음 단계를 수행 하는 때.
5. 지 허벅지에 피부 절 개를 만들기 위해 불 임 수술가 위 또는 메스를 사용 합니다. 무딘 수술가 위를 사용 하 여 신중 하 게 피부 밑 조직 분리 피부 후크. 대 퇴 골은 근육 내에서 볼 수 있는 피부를 보호 하.
6. 중반 허벅지 좌 골 신경 섬유는 근육에 포함 된 볼 수 있습니다 때까지 신중 하 게 대 퇴 골에 평행 하 게 근육을 분리 하는 위를 사용 합니다. 신중 하 게 주변 결합 조직 및 근육에서 중반 허벅지 좌 골 신경을 유리 후크를 사용 하 여.
1. 맞춤 신경 fixator ( 그림 1 및 그림 3)를 사용 하 여 장내 초점 영역에서 좌 골 신경 위치.
   참고: 맞춤 신경 fixator 3 부품 ( 그림 3)으로 구성 됩니다. 모든 구성 요소는 투명 한 polymethylmethacrylate (PMMA)으로 이루어져 있습니다. 외부 스레드 컴포넌트의 상위 구조 나 이며 키가 2.5 m m M10XP0.7 ( 그림 4A). 중앙 잘 나 구성 요소를 통해 4.0 m m 직경 구멍은 이다. 우물의 아래 오프닝 테이프의 시트에 의해 밀봉 된다. 슬롯의 직경 1.2 m m 이며 슬롯의 중앙 비행기 및 부품의 위쪽 표면 사이의 거리는 3.1. 구성 요소 II는 본체, 4 개의 다리와 바닥 구조 ( 그림 4B) 이루어져 있다. 아래 구조체의 내부 스레드는 2.5 m m 높이 및 외부 스레드 구성 요소를 맞게 M10XP0.7 나. 중앙 구멍의 직경은 컴포넌트의 중앙 우물 같은 나. 본체의 크기는 직경에서 및 두께에서 5.4 m m 32 m m입니다. 4 개의 다리가 대칭으로 배포 됩니다. 두 개의 동일한 짧은 다리는 맞춤 설계 및 구성 III에 연결에 대 한 두 개의 동일한 긴 다리 작동. 외부 직경 및 구성 III의 높이 41 m m와 9.2 m m를 있습니다. 내부 스레드 M36XP1.0 이며 통해 구멍 직경에서 27.5 m m (< 강한 클래스 = "xfig"> 그림 4C). 원뿔 84 m m 직경에서의 최고 오프닝과 직경에서 27.5 m m의 아래쪽 오프닝 빈 테이퍼입니다. 높이 57.5 m m ( 그림 5A)입니다.
   1. 실험 전에 30-60 분 살 균 물에 몸을 담근 뒤 표 백제 솔루션에 맞춤 아크릴 신경 fixator 담가.
   2. 유리 후크를 사용 하 여 신경 신중 하 고 구성 요소 나의 슬롯에 넣어
   3. 나사 구성 요소 II I. 채우기는 중앙 구성 요소를 잘 구성의 난 벨 ' 초음파 전파 및 신경 보존을 위한 s 솔루션.
   4. 나사 구성 요소 III 장내 주택 콘입니다. 독 구성 요소 구성 요소 II의 4 개의 다리를 통해 구성 요소 II와 III.
      참고: 3 부품의 기하학적 중심과 변환기 정렬 됩니다. 신경 및 변환기 사이의 거리가 신경은 장내 초점 영역 안에 보장 초점 길이.
2. 좌 골 신경 및 gastrocnemius 근육에 다른 쌍의 기원에 침술 바늘의 한 쌍을 삽입. 전기 동축 케이블 ( 그림 1)을 통해 전기 생리학 수집 시스템에 바늘의 각 쌍을 연결.
   참고: 케이블의 한쪽 끝에 두 개의 바늘을 별도로 하 고 케이블의 다른 쪽 끝에 클립을 2 개의 악어입 클립은 BNC 커넥터 시스템을 연결 하는. 침술 바늘의 쌍 좌 골 신경에 자극 전극과 기록 전극을 gastrocnemius 근육에서 작동합니다.
   1. 샘플링 속도 전기 생리학 수집 시스템의 대역폭을 50 kHz 및 70 Hz-3 kHz, 각각 설정. 좌 골 신경의 근원에 자극 전극에 펄스 폭 0.1 ms의 위에 최대한 자극을 적용.
   2. 기록 전극에서 Cmap을 기록 하 고 전기 생리학 수집 시스템에 내장 된 앰프는 Cmap을 증폭.
      참고: 사용 하 여 내장 앰프 전기 생리학 수집 시스템에서 신경 신호를 증폭 하 고 전기 생리학 수집 시스템과 기록 전극에서 Cmap 기록.
3. 상업 2.68 MHz 장내 변환기를 사용 하 여 당뇨병 neuropathic 쥐에 Cmap 억제.
   참고: 변환기의 사양을 다음과 같이 설명 되어 있습니다: 단일 요소 구형 그릇 조리개 직경 6 cm, 5 cm의 초점 거리와 깊이 무료 분야에서 폭에서 0.8 m m 4mm의 둥글지 초점 영역.
   1. 구형 원뿔, 장내 변환기 및 콘 커버는 탱크에 담가 degassed 물으로 가득 합니다. 구형 콘으로 장내 트랜스듀서를 넣고 6 헤드 나사 ( 그림 5B)에 의해 구형 콘의 최고 오프닝 콘 덮개를 해결. 물에 비해 거품의 낮은 밀도 인해 자연스럽 게 거품 구형 콘에 퇴 학, 후 투명 0.03 m m 두꺼운 테이프에 의해 원뿔의 프런트 엔드 오프닝 인감. 구형 원뿔에 나사 부품 III.
   2. Degassed 물 탱크에서 구형 콘와 부품 III 장내 변환기에 밖으로.
      참고: 역방향 삼 투 물 연구에 사용 되는 역삼 투의 과정에 의해 순화 하는 물입니다. 역방향 삼 투 물 가스를 추방 하기 위해 삶은입니다. 냉각 후, degassed 물 개별 밀폐 탱크에서 얻은 것입니다.
4. 구성 요소를 넣어 신경와 근육 사이의 공간으로 내가 신중 하 게, 및 구성 요소 I. 수행 단계 4.2.3 되도록 신경은 장내의 초점 영역 안에 4.2.4의 격차에 신경 ( 그림 3A < / 강력한 >).
5. 함수 발생기 및 고주파 전력 증폭기 연결합니다. 장내 빔의 세대에 대 한 장내 변환기를 전력 증폭기를 연결 합니다. 수동으로 설정 함수 발생기의 전압 출력은 장내 변환기를 통해 전력 증폭기. 수동으로 해제 함수 발생기 장내 노출 시간이 되 면. 타이머를 사용 하 여 시간을 관찰.
   참고: 강도 및 장내 빔이 연구에 사용 된 에너지는 2810 W/c m ²와 84 m J/m ², 각각.
6. 동시에, 제공 전기 생리학 수집 시스템 (4.3 단계)를 통해 자극과 장내 빔 장내 시스템 (4.6 단계)을 통해 좌 골 신경에는 Cmap을 기록 하는 동안 합니다. 점차적으로 증가 3에서 좌 골 신경에 장내 노출 s, 5 8 s s Cmap의 진폭의 억제 또는 감소 관찰 때까지.
   1. 레코드는 장내 전달 중 초당 한 번씩 Cmap 빔. Cmap의 진폭에 있는 변화를 관찰 한 후 장내 시스템을 해제 하 고 수동으로 기록 Cmap 초기 10 분, 연속 30 분에서 마다 5 분에서에서 2 분 마다 전기 생리학 수집 소프트웨어에 기록 아이콘을 클릭에 모든 10 분에서 마지막 녹화 시간 2 헤에 도달할 때까지 단계
7. 개별 구성 요소 II 및 III 신경 fixator ( 그림 3)의 절 개 사이트에서 장내 변환기를 제거 하. 별도 구성 II 그리고 난 출시 보안된 좌 골 신경. 4-0는 Cmap을 기록한 후 크롬 다 봉합으로 봉합 당뇨 쥐의 외과 사이트. 액체 요오드 수술 부위의 감염을 방지 하기 위해 적용 됩니다.
   1. 난방 패드에 새 장을 놓고 쥐 동물 시설에 그들을 반환 하기 전에 그들의 감 금 소에 복구를 허용 합니다. 3 일 또는 buprenorphine (0.05-0.1 mg/kg)의 복 주사에 대 한 식 수에이 부 프로펜 쥐 제공.
8. 4.1.2 단계와 단계 7, 14, 28 일에는 4.3 초기 장내 쥡니다 후에 설명 된 대로 좌 골 신경 마 취 당뇨병 neuropathic 쥐의 gastrocnemius 근육의 기원에 자극 및 기록 전극 삽입. 4.3.1 4.3.2 단계를 반복 합니다.
   1. 새 장을 열 패드에 놓고 쥐 동물 시설에 감 금 소를 이동 하기 전에 그들의 감 금 소에 복구할 수 있도록.
9. 실험 후 쥐를 안락사. 이산화탄소 챔버에 쥐를 놓습니다. 호흡 중지를 쥐에 대 일 분 정도 기다립니다. 심장 박동을 중지 되었습니다 확인 하십시오.

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결과

Vivo에서 학문, 2810 W/c m²의 3 s 쥡니다 강도에 한 장내 복용량으로는 Cmap 기준선의 20%에 의해 억제 된 하지만 그들은 (그림 2A, 다이아몬드) 30 분 후 완전히 회복 했다 거의 시연 (그림 2B, 다이아몬드) 28 일 기간에 상수. 같은 강도로 5 s 장내 노출는 Cmap 4 분 기준의 65.4% (9.5%)로 감소 및 120 분 (그림 2A

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토론

당뇨병 쥐에 에서 vivo에서 neuropathic 신경의 action potentials 및 장내 치료 둘 다 관찰 된 후 차단 효과의 즉시 발생의 부분 및 임시 억제 Cmap에 28 일 후속 연구는 신경 전도의 안전 봉쇄 적절 한 장내 노출에서 실시 수 증명. 그 결과, 장내 치료의 위의 프로토콜 당뇨병 쥐에서 좌 골 신경의 가역 유도 블록에 대 한 대체 솔루션을 제공할 수 있습니다.

이 방법에서는, 아무 신경...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
streptozotocin	Sigma	85882
citric acid monohydrate	Sigma	C1909
trisodium citrate dihydrate	Sigma	W302600
glucose meters	Roche Accu-Check Active	GC
electronic von Frey device	IITC Life Science	2390
hot plate	IITC Life Science
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
HIFU transducer	Sonic Concepts	H108
function generator	Agilent	33250A
power amplifier	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vet ointment	Dechra
isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurance	Attane
Restraint bag (Decapicones)	Braintree Scientific	DC 200