Ein Ultraschall Werkzeug für die Nervenleitung blockieren in diabetischen Ratten Modelle

Zusammenfassung

Dieses Werk stellt die Methodik der Anwendung hoher Intensität fokussierten Ultraschall um die Aktionspotentiale der diabetischen neuropathischen Nerven zu blockieren.

Zusammenfassung

Wärmeleitung Nervenblockade mit einer hohen Intensität fokussierten Ultraschall (HIFU) wurde vor kurzem im normalen und diabetischen Tiermodell durchgeführt. HIFU kann reversibel die Leitung der peripheren Nerven blockieren, ohne Beschädigung der Nerven während der Verwendung eines entsprechenden Ultraschall-Parameters. Temporäre und teilweise Block von Aktionspotentialen der Nerven zeigt, dass die HIFU hat das Potenzial, eine nützliche klinische Behandlung zur Schmerzlinderung. Diese Arbeit zeigt die Verfahren für die Unterdrückung der Aktionspotentiale der neuropathischen Nerven in diabetischen Ratten in Vivo eine HIFU-Wandler verwenden. Der erste Schritt ist es, Erwachsene männlichen diabetische neuropathische Ratten durch die Streptozocin (STZ) Injektion zu generieren. Der zweite Schritt ist, die diabetische Neuropathie bei diabetischen Ratten STZ-induzierte durch eine elektronische von Frey-Sonde und einer heißen Platte zu bewerten. Der letzte Schritt ist es, Rekord in Vivo extrazellulären Aktionspotentialen des Nervus HIFU Beschallung ausgesetzt. Die hier gezeigten Methode kann das Studium der analgetische Ultraschallanwendungen profitieren.

Einleitung

Orale Medikamente, Akupunktur¹und elektrische Nerven Stimulation² für die Behandlung der schmerzhaften diabetischen Polyneuropathie verwendet worden. Allerdings behindern die Nebenwirkungen der oralen Medikamenten, invasive Betrieb von Akupunktur und elektrische Nervenstimulation die therapeutische Wirksamkeit und Einhaltung des Patienten. Ultraschall-Block der peripheren Nerven in Tiermodellen untersucht worden ist, für Jahrzehnte^3,4,5. Die Durchführung von in-vitro- Ischias Nerven von der großen grünen Frosch war reversibel gehemmt, nach der Behandlung von 10-20 Impulse von Ultraschall Belichtung für 0,4 - 1,0 s⁶. Ein Faktor, Nervenleitung zu blockieren ist die Temperaturerhöhung induziert durch Ultraschall-⁷. Für Patienten mit Polyneuropathie erklang die Unterdrückung der zusammengesetzten Muskel Aktionspotentiale (CMAPs) in der peroneus geringer Intensität Ultraschall für 2 min⁸ausgesetzt. Die vollständige Genesung war innerhalb von 5 Minuten.

Vor kurzem der Food and Drug Administration der USA HIFU als eine nicht-invasive Behandlung für uterine faserartige Tumoren⁹, Palliations Schmerzen der Knochen Metastasen¹⁰und Prostatakrebs¹¹genehmigt. Eine HIFU-Wandler stößt akustische Balken außerhalb des Körpers und der Balken in verschiedenen Gewebe Medien übertragen und konvergieren auf den Ziel-Tumor im Mittelpunkt. Der Fokuszone ist sofort gebildet, um lokalisierte Auswirkungen auf Ziel Tumoren zu erzeugen, ohne das umliegende Gewebe zu beschädigen. HIFU wurde auch angewendet, um Nervenleitgeschwindigkeit hemmen oder Nerv Denervation in in Vivo Experimente von normalen Sprague-Dawley (SD) Ratten¹²verursachen. Darüber hinaus wurden die kurz- und langfristigen Auswirkungen der HIFU auf neuropathischen Nerven untersuchten¹³. Bisherige Ergebnisse gezeigt, dass die reversible oder dauerhafte Block von sensorischen Nervenleitgeschwindigkeit durch HIFU mit geeigneten Parametern erreicht werden könnte. Neben schmerzstillende Anwendungen könnte HIFU als Werkzeug verwendet werden, um den relativen Beitrag des peripheren und zentralen Komponenten Nerv Wärmeleitung Blockade für Grundlagenforschung der Neurologie und Entwicklung von Schmerzmitteln zu untersuchen. Daher ist eine HIFU blockierende Technologie-Plattform speziell für periphere Nerven in Tiermodellen erforderlich. Der Zweck dieses Artikels ist, die Verfahren für die ganz oder teilweise Sperrung der Aktionspotentiale der peripheren Nerven bei diabetischen neuropathischen Ratten durch HIFU demonstrieren. Diabetischen Ratten Modelle und Beurteilung der peripheren neuropathischen Symptome wurden eingerichtet. Eine HIFU-Plattform und experimentelle Prozesse spezifisch für die Behandlung von Ratte Ischias Nerven werden vorgestellt.

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Protokoll

der institutionellen Animal Care und Use Committee des National Health Research Institutes in Taiwan genehmigt alle tierischen Protokolle.

1. Induktion von diabetischen Modell in männlichen Erwachsenen Sprague - Dawley (SD) Ratten

1. Ratte essen Pellets aus dem Käfig entfernen, um schnell männlichen SD-Ratten (300-350 g) für 6 h vor der STZ Induktion.
2. Vorbereiten Natriumcitrat Puffer (0,1 M, pH 4,5).
   1. Auflösen 1,05 g Zitronensäure Monohydrat (C ₆ H ₈ O ₇ · H ₂ O; Mol WT 210.14) in 50 mL destilliertem Wasser um eine 0.1 M Zitronensäure-Lösung machen.
   2. Auflösen 1,47 g Trinatrium Citrat Dihydrat (C ₈ H ₅ O ₇ Na ₃ · 2 H ₂ O; Mol WT 294.12) in 50 mL destilliertem Wasser um eine 0,1 M Natriumcitrat Lösung machen.
   3. Fügen Sie 25 mL Zitronensäurelösung 25 mL Natriumcitrat Lösung. Überwachen den Natrium-Citrat Puffer pH-Wert (pH 4,5) mit dem pH-Meter.
      Hinweis: Der Puffer erfolgt isotonische durch Zugabe einer entsprechenden Menge von Natriumcitrat Lösung 0,1 M.
3. Auflösen STZ in 0,1 M Natriumcitrat Puffer um 50 mg/mL STZ Lösung erzielen.
   Hinweis: Die STZ-Lösung ist lichtempfindlich, daher die STZ-Lösung mit Alu-Folie abdecken und innerhalb von 15-20 min.
4. Ziehen die 50 mg/kg STZ-Lösung in eine 1 mL Insulin oder Tuberkulin-Spritze mit 26 - 28-Gauge Nadel reinigen der Injektionsstelle mit einem Ethanol-Pad und intraperitoneale injizieren die STZ-Lösung in der unteren rechten Quadranten des Abdomens zur Vermeidung von Schäden Bauchorgane.
5. Liefern Ratten mit 10 % Saccharose-Wasser als die einzige Wasserquelle für 48 h nach der Injektion der STZ Hypoglykämie zu verhindern.

2. Bestätigung der Diabetes bei STZ-induzierte Ratten

1. Monitor Fasten Plasma Glukosekonzentration aller Ratten injiziert durch STZ post 72 h mit einem Blutzuckermessgerät.
   1. Schnell die STZ-induzierte diabetischen Ratten für 15 h vor der Messung das Fasten Blut Glukoseniveau.
   2. Die Ratten in einem Beutel Zurückhaltung zügeln und setzen die Schwänzen zur Blutentnahme während der Blut-Glukose-Messungen.
   3. Verwenden eine Blutlanzetten, stechen die Schwanzspitze, einen kleinen Tropfen Blut zu erhalten. Legen Sie den Blutstropfen auf einen Blutzucker-Teststreifen. Aufzeichnen der Fastende Plasma Glukoseniveaus.
      Hinweis: Das Blutzuckermessgerät erkennt und zeigt den Blutzuckerspiegel in Einheiten von mg/dL. Die Ratten mit Fasten Blutzuckerspiegel unter 150 mg/dL nach 2 Wochen der STZ-Induktion auszuschließen.

3. Bewertung der diabetischen Neuropathie bei diabetischen Ratten

1. Beurteilung der mechanischen Allodynie mit elektronischen von Frey.
   1. Gewöhnen die STZ-induzierte diabetische Ratten in einem Käfig auf einem 1 cm Durchmesser Metallgewebe Boden für 30 min vor der Bewertung der Hind Pfote Rückzug Antwort.
   2. Verwenden eine elektronische von Frey-Sonde mit starrer Spitze (0,8 mm Durchmesser) für manuell Druck auf die plantar Oberfläche der Hinterpfote der Ratten, und allmählich den Druck erhöhen, bis eine Pfote Rückzug Reaktion gesehen wird.
   3. Den Druck, der auf dem System und wiederholen Sie die Messung 5 Mal pro Ratte mit einer 30 s-Intervall zwischen den einzelnen Messungen aufzeichnen.
2. Die Hitze-Hyperalgesie mit einer Heizplatte zu beurteilen.
   1. Gewöhnen die STZ-induzierte diabetischen Ratten auf der Heizplatte (24 ± 0,5 ° C) für 10 min vor der Bewertung der Schmerzen Antwort.
   2. Entfernen und setzen Sie die Ratten wieder in ihren Käfigen nach Gewöhnung, die Kochplatte erhitzen und pflegen die Heizplatte ' s Temperatur bei 55 ± 0,5 ° C.
   3. Legen Sie die Ratte auf der beheizten Herdplatte während gleichzeitig Timer starten.
   4. Wenn die Ratte unterschiedliche Verhaltensweisen zeigt, wie lecken der hinteren Pfote oder ungewöhnlich flimmernden Hirschkuh Pfote, stoppen Sie die Zeitmessung und Rückzug Latenz aufnehmen.
      Hinweis: Wenn eine Ratte nicht unterschiedliche Verhaltensweisen nach 20 ausdrückt s (20 s-Cut-off-Zeit), den heißen Platte Test beenden und entfernen Sie die Ratte aus der heißen Platte.

4. In Vivo Nerve Conduction Blockade mit der HIFU-Wandler

Hinweis: die in-Vivo-Experiment startet am 5. Woche nach 50 mg/kg STZ Injektion.

1. Perform Tier Verfahren vor der Blockade von CMAPs mit HIFU-Beschallung.
   1. Die chirurgischen Werkzeuge (Skalpell, Schere, Pinzette und Glas Haken) im Autoklav vor der Operation sterilisieren.
   2. Betäuben die Ratten mit intraperitonealer Injektion von Tiletamin/Zolazepam Gemisch (40 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) oder über Inhalation von 1,75 % Isofluran über Isofluran Vaporizer. Legen Sie die Ratten auf ein Heizkissen auf die Körpertemperatur aufrechtzuerhalten.
   3. Positionieren Sie die Ratten für Chirurgie im ventralen liegen. Anwendung der Augensalbe. Erweitern Sie das Bein der Ratte und Kneifen der plantaren Oberfläche des Fußes mit den Fingernägeln zu prüfen, die Tiefe der Narkose. Wenn die Ratten Rückzug Antworten zeigen, gelten zusätzliche Anästhesie.
   4. Entfernen Haare aus dem Oberschenkel und hinten die Ratten mit einer elektrischen Haarschneidemaschine zu senken. Wenden Sie flüssiges Jod mit sauberen Gaze an der Operationsstelle und kreisförmig bewegen Sie die Gaze, die außen an der Operationsstelle. Verwenden Sie eine Alkohol-Pad auf um der flüssigen Jod mit der gleichen Kreisbewegung zu wischen. Dieses Experiment ist auf der Website Links und rechts OP durchgeführt. Wiederholen Sie den Vorgang auf der anderen Operationsstelle beim Durchführen des nächste Schrittdes des Verfahrens.
   5. Verwenden eine sterile chirurgische Schere oder Skalpell einen Einschnitt der Haut am dorsalen Oberschenkel zu machen. Verwenden Sie stumpfe chirurgische Schere sorgfältig trennen das Gewebe unter der Haut und schützen die Haut mit Haut Haken. Femur innerhalb der Muskeln sichtbar werden.
   6. Verwenden Sie die Schere, um die Muskeln, die parallel zum Femur sorgfältig zu trennen, bis die Mitte des Oberschenkels Ischias-Nervenfasern, die in den Muskeln eingebettet sind sichtbar sind. Sorgfältig einen Glas Haken verwenden, um die Mitte des Oberschenkels Ischiasnerv aus dem umliegenden Bindegewebe und Muskulatur trennen.
2. Positionieren Sie den Ischiasnerv in der fokalen HIFU-Zone mit einer maßgeschneiderten Nerv Fixateur ( Abbildung 1 und Abbildung 3).
   Hinweis: Die maßgeschneiderte Nerv Fixateur besteht aus 3 Komponenten ( Abbildung 3). Alle Komponenten bestehen aus durchsichtigen Polymethylmethacrylat (PMMA). Das Außengewinde der oberen Struktur der Komponente I ist 2,5 mm groß und M10XP0.7 ( Abb. 4A). Der zentrale Brunnen ist ein Durchmesser von 4,0 mm Loch durch Komponente ich. Die untere Öffnung des Brunnens wird durch ein Blatt von Klebeband abgedichtet. Der Durchmesser des Schlitzes ist 1,2 mm und der Abstand zwischen der Zentralebene des Schlitzes und die obere Fläche der Komponente I ist 3,1 mm. Komponente II besteht aus einem Grundkörper, vier Beine und die Bodenstruktur ( Abbildung 4 b). Das Innengewinde der Bodenstruktur ist 2,5 mm groß und M10XP0.7 auf das Außengewinde der Komponente passen ich. Der Durchmesser der zentralen Bohrung ist identisch mit dem zentralen Brunnen Komponente ich. Die Abmessungen des Hauptteils sind 32 mm Durchmesser und 5.4 mm Dicke. Vier Beine sind symmetrisch bereitgestellt. Zwei identische kurze Beine sind für Ausrichtung und zwei gleich lange Beine arbeiten zum Einhängen auf Komponente III. Der Außendurchmesser und die Höhe der Komponente III sind 41 bis 9,2 mm. Das Innengewinde ist M36XP1.0 und die Durchgangsbohrung ist 27,5 mm Durchmesser (< starke Klasse = "Xfig"> Abbildung 4). Der Kegel ist eine hohle Kegel mit der oberen Öffnung von 84 mm Durchmesser und die untere Öffnung von 27,5 mm Durchmesser. Die Höhe beträgt 57,5 mm ( Abb. 5A).
   1. Vor dem Experiment, maßgefertigte Acryl Nerv Fixateur in Bleichmittel-Lösung für 30-60 min, gefolgt von einweichen in sterilem Wasser einweichen.
   2. Mit einem Glas Haken heben Sie vorsichtig den Nerv und steckte sie in den Schlitz der Komponente I.
   3. Schraubenkomponente II an Komponente I. füllen die zentrale Komponente gut ich mit Ringer ' s Lösung für Ultraschall Ausbreitung und Nerven Erhalt.
   4. Schraube Komponente III, der HIFU-Gehäuse-Kegel. Dock-Komponente III mit Bauteil II durch die vier Beine des Bauteil II.
      Hinweis: Der geometrischen Mitte der drei Komponenten und der Wandler ausgerichtet sind. Der Abstand zwischen den Nerv und der Wandler ist die Brennweite, sorgt der Nerv im Inneren der HIFU Fokuszone.
3. Fügen Sie ein paar von Akupunkturnadeln in die Entstehung der Ischiasnerv und das andere Paar in den Gastrocnemius Muskel. Schließen Sie jedes Paar von Nadeln an das Erfassungssystem Elektrophysiologie durch einen elektrischen Koaxialkabel ( Abbildung 1).
   Hinweis: An einem Ende des Kabels sind zwei Krokodilklemmen, zwei Nadeln separat und am anderen Ende des Kabels clip ist ein BNC-Stecker, das System zu verknüpfen. Die Paare von Akupunkturnadeln Arbeit als anregende Elektroden an den Ischiasnerv und die Aufnahme Elektroden an den Gastrocnemius Muskel.
   1. Die Sampling-Rate und die Bandbreite der Elektrophysiologie-Erfassungssystem auf 50 kHz und 70 Hz - 3 kHz, "bzw." festgelegt. Anwenden einer supra-maximale Impulse mit einer Pulsbreite von 0,1 ms zu den stimulierenden Elektroden am Ursprung des Nervus ischiadicus.
   2. Die CMAPs von den Aufnahme-Elektroden aufnehmen und verstärken die CMAPs mit eingebautem Verstärker in der Elektrophysiologie Erfassungssystem.
      Hinweis: Verwenden den eingebauten Verstärker in der Elektrophysiologie-Erfassungssystem CMAPs von den Aufnahme-Elektroden mit Elektrophysiologie-Erfassungssystem zu verstärken die Nervensignale.
4. Einen kommerziellen 2,68 MHz-HIFU-Wandler verwenden, um die CMAPs bei diabetischen neuropathischen Ratten unterdrücken.
   Hinweis: Die Spezifikationen des Wandlers werden wie folgt beschrieben: ein Single-Element kugelförmigen Schale mit Öffnungsdurchmesser von 6 cm und 5 cm Brennweite und ein Ellipsoid Fokuszone von 4 mm in der Tiefe und 0,8 mm in der Breite in das freie Feld.
   1. Untertauchen der sphärischen Kegel, der HIFU-Wandler und den Kegel in den Tank zu decken mit entgastem Wasser gefüllt. Die HIFU-Wandler in den kugelförmigen Konus und befestigen Sie die Kegel-Abdeckung, um die obere Öffnung des Kegels sphärische durch 6 Schrauben ( Abbildung 5 b). Nach Luftblasen in den kugelförmigen Kegel natürlich aufgrund der niedrigen Dichte Blasen im Vergleich mit Wasser vertrieben werden, verschließen Sie die Front-End-Öffnung des Kegels mit einem transparenten 0,03 mm dicken Band. Schraubenkomponente III auf den kugelförmigen Kegel.
   2. Herausnehmen der HIFU-Wandler mit den sphärischen Kegel und Komponente III aus dem entgastem Wassertank.
      Hinweis: In der Studie verwendeten Umkehr-Osmose-Wasser ist das Wasser durch den Prozess der Umkehrosmose gereinigt. Die Umkehr-Osmose-Wasser wird gekocht, um das Gas zu vertreiben. Nach dem Abkühlen entgastem Wasser erhält man in einem einzelnen geschlossenen Tank.
5. Komponente legte ich in den Raum zwischen den Nerv und Muskel sorgfältig, und positionieren Sie die Nerven in den Spalt der Komponente I. durchführen Schritte 4.2.3 und 4.2.4 um sicherzustellen, dass der Nerv im Inneren der Fokuszone die HIFU ist ( Abbildung 3A < / starke >).
6. Link einen Funktionsgenerator und ein Radiofrequenz-Endstufe. Verbinden Sie die Endstufe mit der HIFU-Wandler für die Generation der HIFU-Strahl. Manuell einstellen der Ausgangsspannung der Funktionsgenerator, der HIFU-Wandler über die Endstufe. Manuell schalten Sie der Funktionsgenerator, sobald die HIFU-Belichtung Zeit abgelaufen ist. Zeit mit Hilfe eines Timers beobachten.
   Hinweis: Die Intensität und die Energie der HIFU-Strahl in dieser Studie verwendeten sind 2.810 W/cm ² 84 J/mm ², bzw..
7. Liefern gleichzeitig den Reiz über die Elektrophysiologie-Erfassungssystem (Schritt 4.3) und HIFU Strahl über HIFU-System (Schritt 4.6) an den Ischiasnerv während der Aufnahme die CMAPs. Schrittweise Erhöhung die HIFU-Exposition auf den Ischiasnerv von 3 s, 5 s bis 8 s bis Abnahme oder Hemmung der Amplitude des CMAPs beobachtet wird.
   1. Rekord CMAPs einmal pro Sekunde während der Entbindung von der HIFU-Strahl. Nach der Feststellung der Änderung der Amplitude der CMAPs, die HIFU-Anlage abschalten und manuell klicken Sie auf das Aufnahmesymbol auf die Elektrophysiologie Datenerfassungs-Software zum Datensatz CMAPs alle 2 min in den frühen 10 min alle 5 min in den aufeinander folgenden 30 min und alle 10 min in der letzten phase bis die Aufnahmedauer 2 h. erreicht
8. Separate Komponente II und III des Nervs Fixateur ( Abbildung 3), die HIFU-Wandler von der Einschnitt-Website zu entfernen. Separate Komponente II und ich den gesicherten Ischiasnerv freizugeben. Naht der Operationsstelle diabetischen Ratten durch 4-0 Chromsäure Catgut Nähte nach der Aufnahme die CMAPs. Gelten Sie flüssiges Jod an der Operationsstelle um Infektionen zu vermeiden.
   1. Die Käfige auf das Heizkissen und die Ratten in ihren Käfigen zu erholen, vor der Rückgabe an die Tierstation. Die Ratten mit Ibuprofen im Trinkwasser für 3 Tage oder intraperitoneale Injektion von Buprenorphin (0,05 - 0,1 mg/kg) zur Verfügung zu stellen.
9. Fügen Sie anregende und Aufnahme Elektroden in das Herkunftsland der Ischiasnerv und die Gastrocnemius Muskeln der narkotisierten diabetischen neuropathischen Ratten, wie in den Schritten 4.1.2 und 4.3 auf 7, 14 und 28 Tagen nach der ersten HIFU-Ultraschall beschrieben. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1, 4.3.2.
   1. Die Käfige auf das Heizkissen und ermöglichen die Ratten in ihren Käfigen zu erholen, bevor die Käfige mit der Tierstation.
10. Einschläfern die Ratten nach dem Experiment. Legen Sie die Ratte in eine Kohlendioxid-Kammer. Warten Sie ca. 5 min. für die Ratten zu atmen aufhören. Stellen Sie sicher, dass das Herz aufgehört hat zu schlagen.

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Ergebnisse

Die in-Vivo -Studie zeigte, dass mit einer HIFU-Dosis von 3 s-Beschallung mit einer Intensität von 2.810 W/cm², die CMAPs wurden um 20 % der Grundlinie unterdrückt, aber sie waren nach 30 min (Abbildung 2A, Diamanten) vollständig erholt und waren fast Konstante in der Frist von 28 Tagen (Abb. 2 b, Diamanten). Für die 5 s-HIFU-Belichtung mit der gleichen Intensität die CMAPs sank auf 65,4 % (9,5 %) der Bas...

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Diskussion

Teil- und vorübergehenden Unterdrückung von Action potentials der neuropathischen Nerven von diabetischen Ratten in Vivo und sofortige auftreten die Sperrwirkung nach der HIFU-Behandlung, die beide beobachtet wurden. Die 28-Tage-Follow-up-Studie auf CMAPs gezeigt, dass eine sichere Blockade der Nervenleitung am eine angemessene HIFU-Belichtung durchgeführt werden kann. Infolgedessen bieten das obige Protokoll der HIFU-Behandlung eine alternative Lösung für die reversible Wärmeleitung Block des Ischias-Nerv...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
streptozotocin	Sigma	85882
citric acid monohydrate	Sigma	C1909
trisodium citrate dihydrate	Sigma	W302600
glucose meters	Roche Accu-Check Active	GC
electronic von Frey device	IITC Life Science	2390
hot plate	IITC Life Science
Biopac MP36 acquisition system	Biopac Systems, Inc.
HIFU transducer	Sonic Concepts	H108
function generator	Agilent	33250A
power amplifier	Electronics & Innovation	1040L
Rats	Biolasco taiwan	Sprague-Dawley
Puralube vet ointment	Dechra
isoflurane vaporizer	Parkland Scientific	V3000PS
Isoflurance	Attane
Restraint bag (Decapicones)	Braintree Scientific	DC 200