JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בגישה מודולרית הסינתזה של N- glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.

Abstract

אנו מציגים דרך יעילה במיוחד עבור הכנה מהירה של מגוון רחב של N-מקושרים oligosaccharides (מוערך יעלה על 20,000 מבנים) אשר נמצאים בדרך כלל על אדם glycoproteins. כדי להשיג את הגיוון מבניים הרצוי, האסטרטגיה החל הסינתזה כימותרפיה-אנזימטי של שלושה סוגים של מודולים פלואוריד oligosaccharyl, ואחריו שלהם stepwise glycosylations α-סלקטיבית של 3-O ו 6-O עמדות של מנוז שאריות trisaccharide ליבה משותפת שיש חיבור אמיתי מכריע β-mannoside. בהמשך קשרנו את N- glycans השטח של שקופיות זכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד (ACG) כדי ליצור מערך מעורב קוולנטיות לניתוח של הטרו-ליגנד אינטראקציה עם נוגדן HIV. בפרט, הקלד התנהגות מחייב שזה עתה מבודד HIV-1 נטרול בהרחבה נוגדנים (bNAb), PG9, לתערובת של האיש צפופים5GlcNAc2 (אדם5) ומורכב 2, 6-di-sialylated דו-antennary N- glycan (SCT ) על מערך ACG, פותח שדרה חדש כדי להנחות את העיצוב immunogen יעיל עבור פיתוח החיסון HIV. בנוסף, מערך ACG שלנו מגלם כלי רב עוצמה כדי ללמוד אחרים נוגדנים HIV להתנהגות הטרו-ליגנד מחייב.

Introduction

N- glycans על glycoproteins covalently מקושרים של אספרגין (Asn) שאריות של sequon Asn-Xxx-Ser/חמישי הקונצנזוס, אשר משפיעים על מספר תהליכים ביולוגיים כגון זיהוי חלבונים קונפורמציה, antigenicity, המסיסות, לקטין 1 , 2. סינתזה כימית של N-oligosaccharides מקושר מייצג סינתטי אתגר משמעותי בשל הטרוגניות מיקרו מבני ענק ואדריכלות מסועף מאוד שלהם. בחירה זהירה של הגנה על קבוצות לכוון תגובתיות של אבני הבניין, להשגת סלקטיביות מרכזי anomeric, ועל שימוש נכון יזם / activator(s) הם רכיבי מפתח של סינתזה של oligosaccharides מורכבים. כדי לפתור בעיה זו של מורכבות, כמות גדולה של עבודה כדי לקדם סינתזה - glycan Nדווח לאחרונה3,4. למרות הגישות האלה חזקים, מציאת שיטה יעילה עבור הכנת מגוון רחב של N- glycans שרידים (~ 20,000) תואר אתגר.

קצב מוטציה מהירה של HIV-1 כדי להשיג את מגוון גנטי מקיף ואת יכולתו לברוח מן לנטרל תגובת נוגדנים, הוא בין האתגרים הגדולים ביותר כדי לפתח את החיסון בטוח, אמצעי מניעה נגד HIV-15,6 , 7. אחד טקטיקה יעילה HIV משתמש כדי למנוע את התגובה החיסונית של המארח הוא גליקוזילציה post-translational של המעטפה gp120 גליקופרוטאין עם מגוון N-מקושרים glycans נגזר מארח גליקוזילציה מכונות8, 9. דו ח זה התבצעה לגבי ניתוח מדויק של גליקוזילציה gp120 HIV-1 monomeric רקומביננטי מתאי 293T כליה אנושית עובריים (HEK) מרמז על המופע של microheterogeneity מבניים עם תבנית ספציפית תא אופיינית10 , 11 , 12. לפיכך, הבנה specificities glycan של HIV-1 bNAbs דורש טוב מאופיין gp120 הקשורים N- glycan מבנים בכמות מספקת לצורך ניתוח.

גילוי glycan microarray טכנולוגיה בתנאי חקר מבוססות תפוקה גבוהה של specificities של מגוון רחב של חלבונים פחמימות-כריכה, וירוסים/בקטריאלי adhesins, רעלים, נוגדנים lectines13,14 . הסידור glycans שיטתית בתבנית ערוכים מבוססי שבב יכול לקבוע זיקה נמוכה בעייתי אינטראקציות חלבון-glycan דרך המצגת multivalent15,16,17,18. סידור glycan מבוססי שבב זה מופיע בנוחות לחקות ביעילות תאים תאים ממשקים. כדי להעשיר את הטכנולוגיה להתגבר על הבעיה לא אחידה המשויך מערך קונבנציונאלי תבניות, הקבוצה שלנו פותח לאחרונה מערך glycan שקופית הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד (ACG) באמצעות glycans הסתיימה חומצה phosphonic כדי לשפר את עוצמת האות, הומוגניות, רגישות19,20.

כדי לשפר את ההבנה הנוכחית על glycan epitopes של לאחרונה מבודד HIV-1 בהרחבה נטרול נוגדנים (bNAbs), פיתחנו אסטרטגיה מודולרי יעילה במיוחד עבור הכנת מערך רחב של N-מקושרים glycans21 ,22 יודפס על ACG שקופית (ראה איור 1). ירידה לפרטים מחקרים פרופיל של HIV-1 bNAbs על מערך ACG הציע זיהוי חריג הטרו-glycan מחייב התנהלות חזק מאוד bNAb PG9 שהיה מבודד HIV נגוע יחידים23,24,25.

Protocol

1. הכנת D1/D2 זרוע מודולים22

  1. הכנת ביניים 2
    1. שוקל החל גשמי 1 (ראה איור 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 מ ג, 0.204 mmol)) לתוך צינור 15 מ"ל ו להמיס טריס המכיל מאגר (25 מ מ, pH 7.5) dichloride מנגן (MnCl2, 10 מ מ) כדי להשיג ריכוז glycan הסופי של 5 מ מ.
    2. להוסיף 2 במקבילות של גלקטוז diphosphate uridine (UDP-גל).
    3. להוסיף 150 יחידות של האנזים β-1, 4 transferases galactosyl מחלב פרה, דגירה התערובת ב 37 oC עבור 15 h.
    4. לאחר 15 h, לבצע שכבה דקה כרומטוגרפיה (TLC) כדי לציין הצריכה הכוללת של החל חומר על-ידי איתור תערובת התגובה על צלחת TLC, פיתוח ב- n-חומצה אצטית/butanol/מים (H2O) ב- 1:1:1 יחס, צביעת על-ידי פתרון של 0.25 M צריום אמוניום molybdate ואחריו חימום. ואז להרוות את התגובה על ידי חימום-90 oC למשך 5 דקות.
    5. Centrifuge את תערובת התגובה במהירות של g x 2,737 למשך 3 דקות, וטען את תגובת שיקוע בחלק העליון של עמודה לזיהוי ג'ל (ראה טבלה של חומרים). Elute את העמודה באמצעות מים מיוננים מזוקקים, ולאסוף את המוצר עם שברים של 1-2 מ.
    6. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC26, פיתוח ב- n-butanol: H2o: חומצה אצטית ב- 1:1:1 יחס, צביעת על-ידי פתרון של molybdate אמוניום צריום ואחריו חימום. Lyophilize27 המוצר המכיל שברים להשיג ביניים 2 (מ ג 115, 86%) כמו אבקה לבנה. לאפיין את המוצר על ידי NMR28 ו לספקטרומטרית29 (ראה קובץ הנתונים המשלימים).
  2. הכנת 3 ביניים
    1. שוקל החל גשמי 2 (המוצג באיור 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 מ ג, 0.122 mmol)) צינור 15 מ"ל, לפזר זאת בתוך טריס מאגר (25 מ מ, pH 7.5) המכיל MnCl2 (10 מ מ) להכין את ריכוז glycan הסופי של 5 מ מ.
    2. להוסיף 2 במקבילות של מלח 5'-diphospho-β-L-fucose ניתרן guanosine (התוצר המקומי הגולמי-Fuc).
    3. להוסיף 150 יחידות של האנזים α-1, 3 fucosyl transferases של הליקובקטר פילורי (Hp1-3FTΔ26695), וכן דגירה התערובת ב 37 oC עבור 15 h.
    4. בצע את שלב 1.1.4.
    5. בצע את שלב 1.1.5.
    6. בצע את שלב 1.1.6 להשיג ביניים 3 (מ ג 82, 84%) כמו אבקה לבנה. לאפיין את המוצר על ידי NMR לספקטרומטרית מסות (ראה קובץ נתונים משלימים).
  3. הכנה של מודולים 4 ו- 5
    1. שוקל מתחם 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.230 g, 0.360 mmol) או במתחם 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0.100 g, 0.125 mmol) לתוך 25 מ ל יחיד-צוואר עגול-תחתית הבקבוק ויבש תחת ואקום למשך 30 דקות.
    2. להסיר את הבקבוקון של ואקום, למלא אותו גז חנקן, להוסיף פס מגנטי stir, מכסה אותה עם מחיצת גומי ולאחר לצרף בלון חנקן.
    3. להזריק mL 7 של פירידין יבש ו- 3 מ"ל של אנהידריד אצטי (Ac2O) לתוך הבקבוק מונחת אמבטיית קרח ב 0 oC. מערבבים התגובה שנוצר עבור 12 שעות בטמפרטורת החדר באמצעות של פגים-600-700 סל ד. להתאדות ממיסים את השימוש של רוטרי המאייד, בלחץ ואקום של 0 - 10 mbar-50 oC.
    4. לדלל את התערובת גולמי באמצעות 30 מ של דיכלורומתאן (DCM) ואת תמצית עם רוויה מימית נתרן מימן פחמתי (NaHCO3) (עונה 2 פרק 20 מ"ל) לתוך משפך 50 מ ל.
    5. לחלץ מחדש את שכבה מימית עם DCM (3 x 15 מ"ל) ויבש הרבדים אורגני משולב מעל נתרן גופרתי. הסר את נתרן גופרתי על-ידי סינון, לשטוף עם DCM (5 מ"ל). להתאדות הממס באמצעות המאדה בלחץ 400 mbar ואקום-40 oC.
    6. לטעון את הפתרון של תערובת גסה לתוך 2 מיליליטר DCM על המיטה סיליקה.
    7. Elute את העמודה עם תערובת המכילה טולואן, אצטון של 0 - 20% אצטון ב טולואן ולאסוף שברים של 5-10 מ.
    8. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC (שלבים 1.1.4 ו 1.1.6), פיתוח עם טולואן/אצטון (7/3), ואחריו מכתים עם פתרון של molybdate אמוניום צריום חימום על פלטה חמה.
    9. להתנדף המוצר המכיל שברים בעזרת המאדה לקבל מוצרים להזמנה כמו קצף לבן ב- 72% ל- 85% בתשואות, בהתאמה.
    10. להמיס את המוצרים בתוך 7 מ של acetonitrile: טולואן: H2O ב- 4:2:1 יחס בבקבוקון סיבוב המדרגה 25 מ ל.
    11. הוסף צריום אמוניום חנקתי (2 מקבילות) תוך קירור כדי 0 oC באמצעות אמבטיית קרח. מערבבים את התגובה בטמפרטורת החדר במשך 3 h ~ 500-800 סל ד.
    12. לאחר TLC מצביע על הצריכה הכוללת של החל חומר (TLC פיתוח עם טולואן/אצטון (7/3) והצגה על ידי ספיגת UV-254 ננומטר או על-ידי מכתימה עם פתרון של molybdate אמוניום צריום ואחריו חימום), לדלל את התערובת התגובה עם אתיל אצטט (30 מ ל), תמצית ב H2O (15 x 2 מ"ל).
    13. לחלץ את השכבות אורגני בשילוב עם 5 מ של פתרון רווי נתרן כלורי (NaCl).
    14. להתאדות הממס באמצעות המאדה בלחץ 240 mbar ואקום-40 oC.
    15. לטעון את הפתרון של המוצר גסה לתוך 2 מיליליטר DCM על המיטה סיליקה. Elute את העמודה עם תערובת המכילה טולואן, אצטון (0 - 20% אצטון ב טולואן) ולאסוף שברים של 5-10 מ. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC, פיתוח עם טולואן/אצטון (7/3).
    16. להתנדף מוצרים המכילים שברים בעזרת המאדה של ואקום mbar 77 ו- 40 oC כדי לקבל את המוצרים הרצויה כמו קצף לבן.
    17. התמוססות של כהלים בהתאמה לתוך 10 מ"ל של DCM 25-mL יחיד-צוואר עגול-תחתית הבקבוק וקריר ל-30 oC.
    18. הוסף diethylaminosulfur ניכר (אעיז, ושווי 2). מערבבים את תערובת התגובה ב-30 oC כבר שעתיים.
    19. לאחר TLC מציין צריכת החל חומר (TLC פיתוח עם טולואן/אצטון (4/1) והצגה על ידי ספיגת UV-254 ננומטר או על-ידי מכתימה עם פתרון של molybdate אמוניום צריום ואחריו חימום), לדלל את התערובת התגובה עם DCM (30 מ ל) , ולא לשטוף עם רווי NaHCO3 (15 x 2 מ"ל).
    20. לחלץ את השכבה אורגני בשילוב עם 5 מיליליטר רווי פתרון NaCl לייבש אותו על-ידי הוספת נטול מים מגנזיום גופרתי, לסנן את התערובת לאחר שטיפה עם DCM (5 מ"ל), לאסוף את זה לתוך בקבוקון 100-mL יחיד-צוואר עגול-התחתון.
    21. להתאדות הממס באמצעות המאדה בלחץ 400 mbar ואקום-40 oC.
    22. לטעון את הפתרון של מוצר גס 2 מיליליטר DCM על המיטה סיליקה. Elute את העמודה עם תערובת של טולואן אצטון (0-20% אצטון ב טולואן) ושברים אוספים של 5-10 מ.
    23. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC, פיתוח עם טולואן/אצטון (7/3).
    24. להתאדות המוצר המכיל שברים בעזרת המאדה כדי לקבל מוצרים להזמנה 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl פלואוריד (54% מעל 2 צעדים) ו- 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl פלואוריד (67% מעל 2 צעדים) כמו לבן מוצקים.
    25. לאפיין את המוצר על ידי NMR לספקטרומטרית מסות (ראה קובץ נתונים משלימים).

2. הכנת Glycan 10

  1. הכנת intermidiate 7
    1. שוקל את כסף triflate (AgOTf) (0.039 g, 0.155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride (Cp2HfCl2) (0.041 גרם, 0.108 mmol) לתוך בקבוקון סיבוב המדרגה יחיד-צוואר 25-mL, לייבש אותו תחת schlenk ב קו ואקום במשך 30 דקות, להסיר ממנו ואקום, ולמלא אותו גז חנקן.
    2. להעביר את טרי מיובשים 4 Å מולקולרית הנפות (0.2 גרם) לתוך הבקבוק המכיל את AgOTf ו Cp2HfCl2, להוסיף בר מערבבים מגנטי, כובע עם מחצה מיד והוסף חנקן בלון.
    3. העברת 3 מ ל טולואן יבש לתוך הבקבוק עם מזרק זכוכית יבשה. מערבבים את תערובת התגובה לשעה בטמפרטורת החדר, ואז צנני כדי 0 oC.
    4. להזריק פתרון של התורם 4 (איור 2, 0.043 g, 0.046 mmol) ואני מקבל 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (איור 3, 0.045 גרם, 0.031 mmol) ב- 3 מ ל טולואן לתוך הבקבוק דרך מחצה באמצעות מזרק 10 מ"ל ב 0 o ג. מערבבים את תערובת התגובה בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות.
    5. לאחר TLC מציין צריכת חומרי מוצא (TLC, פיתוח עם DCM/אצטון (8.5/1.5) והצגה על ידי ספיגת UV-254 ננומטר או על-ידי מכתימה עם פתרון של molybdate אמוניום צריום ואחריו חימום), להרוות את התגובה על ידי 10 שהזרקת מקבילות triethyl אמין.
    6. לסנן את הנפות מולקולרית דרך מיטת celite לתוך בקבוקון עם תחתית עגול 50-mL, לשטוף נוספת עם 10 מ"ל של אתיל אצטט. לחלץ את השכבות אורגני בשילוב עם תמיסה רוויה של מימית NaHCO3 (עונה 2 פרק 20 מ"ל) במשפך 50 מ. לחלץ את שכבה מימית עם אתיל אצטט (3 x 15 מ"ל).
    7. לחלץ את השכבות אורגני בשילוב עם NaCl רווי פתרון (5 מ"ל), לייבש אותו באמצעות מגנזיום גופרתי נטול מים, לסנן את התערובת כדי להסיר את מגנזיום גופרתי, לשטוף עם אתיל אצטט (3 x 15 מ"ל), ולאסוף את פילטרט של בקבוקון עם תחתית עגול 100-מ.
    8. להתאדות הממס באמצעות המאדה בלחץ 240 mbar ואקום-40 oC.
    9. לטעון את הפתרון של המוצר הגולמי ב- DCM על העמודה מיטה סיליקה. Elute את העמודה עם תערובת המכילה DCM ו אצטון (0-10% אצטון ב- DCM) ולאסוף את השברים של 5-10 מ.
    10. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC, פיתוח עם DCM/אצטון (8.5/1.5). להתאדות שברים המכיל המוצר באמצעות המאדה כדי להשיג [5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7, intermidiate 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0.052 ז, 70%), כמו קצף לבן.
    11. לאפיין את המוצר על ידי NMR לספקטרומטרית מסות (ראה קובץ נתונים משלימים).
  2. הכנת intermidiate 8
    1. שוקל hexasaccharide 7 (איור 3, 0.040 g, 0.016 mmol) לתוך בקבוקון 25-mL יחיד-צוואר עגול-התחתון לייבש אותו תחת ואקום עבור 1 h, להסיר אותו ואקום, למלא אותו גז חנקן, להוסיף פס מגנטי מערבבים, מכסה אותה עם מחיצת גומי.
    2. להעביר 3 מ"ל של acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 יחס) לתוך הבקבוק.
    3. להוסיף p-טולואן sulfonic monohydrate חומצה (0.001 גרם, 0.008 mmol) לתוך הבקבוק התגובה ומערבבים התגובה-800 סל ד במשך 5 שעות.
    4. לאחר TLC מציין הצריכה של הפעלת חומר (TLC, פיתוח עם DCM/אצטון (8.5/1.5) והצגה על ידי ספיגת UV-254 ננומטר או על-ידי מכתימה עם פתרון של molybdate אמוניום צריום ואחריו חימום), להרוות את התגובה על ידי 10 שהזרקת מקבילות triethyl אמין.
    5. להתאדות הממס באמצעות המאדה בלחץ 337 mbar ואקום-40 oC.
    6. לפזר את תערובת גסה עם-2 מ ל DCM ולטעון אותו על המיטה סיליקה.
    7. Elute את העמודה עם תערובת של DCM אצטון (0 - 10% אצטון ב- DCM) ושברים אוספים של 5-10 מ. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC, פיתוח עם DCM/אצטון (8.5/1.5). להתאדות הממס בעזרת המאדה של ואקום mbar 400 ו- 40 oC.
    8. יבש את שאריות תחת לחץ מופחת לתת ביניים 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-אצטיל-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (איור 3, 0.022 גרם, 57%) כמו מוצק לבן. לאפיין את המוצר על ידי NMR לספקטרומטרית מסות (ראה קובץ נתונים משלימים).
  3. הכנת intermidiate 9
    1. הכנת intermidiate 9 (איור 3) הושג באמצעות תורם 5 (0.015 גרם, 13.2 µmol) ומקבל 8 (איור 3, 0.020 g, 8.80 µmol).
    2. AgOTf (0.011 גרם, 44.1 µmol) ו- Cp2HfCl2 (0.012 g, 30.8 µmol) שימשו של באמרגנים.
    3. בצע את השלבים 2.1.1 כדי 2.1.10 להגיע ביניים 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-ממד-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-שתיים-acetamido-שתיים-deoxy-β-ממד-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-ממד-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as קצף לבן.
  4. Deprotection הכללית של intermidiate
    1. שוקל מתחם 9 (0.010 g, 2.9 µmol) לתוך בקבוקון סיבוב המדרגה יחיד-צוואר 25-mL, להוסיף פס מגנטי stir, כיפה עם מחצה גומי, וצרף בבלון חנקן.
    2. העברה מ 2 ל 1, 4 dioxane: H2O (4:1) לתוך הבקבוק. להוסיף הידרוקסיד ליתיום (LiOH) (0.005 גרם, 50% על-ידי wt.) לתוך הבקבוק. מערבבים את תערובת התגובה ב- 90-100 oC במשך 12 שעות ולאפשר לה להתקרר-RT.
    3. להתאדות של ממיסים באמצעות המאדה לייבש את הבקבוקון תחת ואקום עבור 1 h, למלא אותו עם חנקן, להסיר אותו יריעה ואקום ו מכסה אותה עם מחצה גומי.
    4. להזריק 4 מ"ל של פירידין יבש, 2 מיליליטר אנהידריד אצטי לתוך הבקבוק דרך מחצה באמצעות מזרק 10 מ ל- 0 oC. מערבבים תערובת התגובה עבור 12 h RT.
    5. להתאדות של ממיסים בעזרת המאדה לחץ ואקום mbar 0-10-50 oC.
    6. לפזר את תערובת גסה באמצעות 30 מ של DCM ולחלץ את הפתרון עם רוויה מימית NaHCO3 (עונה 2 פרק 20 מ"ל) במשפך 50 מ.
    7. מחדש לחלץ את שכבה מימית עם DCM (3 x 15 מ"ל). להתנדף הממס באמצעות המאדה.
    8. לטעון פתרון של מוצר כ 2 מ ל DCM על המיטה סיליקה סי18. Elute את העמודה עם תערובת של מים מתנול (0 - 100% של מתנול במים) לאסוף את השברים של 5-10 מ ל.
    9. לאסוף את השברים המוצר, מתאדים תחת לחץ מופחת כדי לקבל את המוצר הרצוי כמו קצף לבן.
    10. להמיס את המוצר לתוך 5 מ של מתנול יבש ב mL 25 סביב הבקבוק. התחתון, מכסה אותה עם מחיצת גומי.
    11. להעביר 0.1 מ"ל של נתרן methoxide (NaOMe) מתנול וקריר 0 oC באמצעות אמבטיית קרח ומערבבים את התערובת במשך 12 שעות.
    12. להסיר את הממס באמצעות המאדה ויבש את המוצר תחת ואקום גבוה.
    13. להמיס את המוצרים גס 5 מ של מתנול: H2o: חומצה אצטית (6:3:1).
    14. להוסיף פלדיום הידרוקסיד (Pd(OH)2) (50% על ידי wt) ומערבבים את התגובה תחת האווירה מימן באמצעות בלון מימן 15 h.
    15. לסנן את התגובה דרך מיטת celite ולשטוף עם מתנול 2 mL ואחריו 2 מיליליטר מים dd.
    16. להתנדף ממיסים את המאדה באמצעות.
    17. לפזר את תערובת גסה עם-1 מ ל מים ולטעון אותו על המיטה לזיהוי ג'ל (ראה טבלה של חומרים). Elute את המוצר עם מים ולאסוף את השברים של 1-2 מ.
    18. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC, לפתח עם n-butanol: H2o: חומצה אצטית (1:1:1).
    19. לאסוף את השברים המוצר ואת lyophilize כדי לקבל את המוצר הרצוי 10, (5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)- α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a אבקה לבנה.
    20. לאפיין את המוצר על ידי NMR לספקטרומטרית מסות (ראה קובץ נתונים משלימים).

3. הכנת Glycans עם הזנב חומצה Phosphonic19,22

  1. שוקל glycan בהתאמה (2-5 µmol) בבקבוקון סיבוב למטה מ ל, להוסיף פס מגנטי מערבבים, מכסה אותה עם מחצה גומי.
  2. העברת µL 400 של dimethylformamide מיובשים טריים.
  3. הוסף [2 (2 (ethoxyethoxy (bis (benzyloxy) phosphoryl) 2) פחמתי אתיל (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (µmol 10-25, שהוכנו בבית) לפתרון של glycan. מערבבים את התערובת במהירות של 800 סל ד במשך 5 שעות.
  4. להתאדות של ממיסים באמצעות המאדה ב 5-10 mbar לחץ ואקום-40 oC.
  5. לפזר את תערובת התגובה ב- 0.5 מ ל מים ולטעון בחלק העליון של המיטה לזיהוי ג'ל (ראה טבלה של חומרים). Elute את המוצר באמצעות מים ולאסוף את השברים של 1-2 מ.
  6. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC26. לזהות את תערובת התגובה על צלחת TLC, ולהוסיף הכתם פתרון של 0.25 M צריום אמוניום molybdate; בצע על ידי חימום באמצעות צלחת חמה. לאסוף את המוצר המכיל שברים, lyophilize כדי לקבל את המוצר הרצוי כמו אבקה לבנה.
  7. להמיס את המוצר 2 מיליליטר מים ולהוסיף Pd (OH)2 (50% לפי משקל). מערבבים את התגובה-800 סל ד תחת האווירה מימן באמצעות בלון מימן 15 h.
  8. לסנן את התגובה דרך מיטת calcined השטף ולשטוף עם מתנול 2 mL ואחריו 2 מ ל מים מזוקקים מיונן. להתאדות של ממיסים באמצעות המאדה בלחץ 300 mbar ואקום-40 oC.
  9. לפזר את תערובת גסה עם-1 מ ל מים ולטעון אותו על המיטה לזיהוי ג'ל (ראה טבלה של חומרים).
  10. Elute את המוצר עם מים ולאסוף את השברים של 1-2 מ. לפקח על שברים שנאספו על ידי TLC26. Lyophilize השברים (להקפיא את המוצר בעזרת חנקן נוזלי אז במקום על איזה שהוא לופילייזר תחת ואקום) כדי לקבל את המוצר הרצוי כמו אבקה לבנה. לאפיין את המוצרים באמצעות NMR לספקטרומטרית (ראה קובץ נתונים משלימים) באמצעות D2O כמו הממס.

4. Glycan מערך

  1. הכנת אלומיניום מצופה זכוכית שקופיות (ACG שקופיות) 19 , 20 , 22
    הערה: ייצור של השקופיות מצופה אלומיניום זכוכית בוצע חטיבת טכנולוגיות סרט דק, כלי מחקר מרכז לאומי מוחל מעבדות מחקר, שער המזרח, טייוואן.
    1. חבילת שקופיות מצופה, ואקום-חותם אותם כדי למנוע היווצרות של נאו, ולשמור אטום עד התגובה אלקטרוכימיות לקבלת משטח anodization.
  2. Anodization משטח אלומיניום מצופה זכוכית שקופיות 19 , 20 , 22
    1. להגדיר טמפרטורה מבוקרת החממה ב 4 º C. הכן תמיסה מימית של חומצה אוקסלית 0.3 M ולשמור אותו באמבט קרח. קח את הספל 500 מ"ל, להוסיף פס פגים.
    2. להעביר הספל 500 מ"ל חומצה אוקסלית 0.3 M, ולאחר מכן מקם מוט ארוך פלטינה 10 ס מ כמו הקתודה בתוך תמיסת. . תמשיך לערבב (ב 300 סל ד) חומצה אוקסלית לאורך כל תהליך anodization
    3. להפעיל את תוכנת מעקב מעבדה, לחץ על כפתור "להגדיר" ואז "הפונקציה הבחירה לטאטא מתח". להגדיר את ההתחלה, תפסיק מתח כדי 25.8 V, מספר נקודות ל- 100, תאימות ל- 1, ואת לטאטא עיכוב עד 1,200 ms לחץ על "אישור".
    4. תהדק את הזכוכית מצופה אלומיניום בצד הפונה לכיוון הקתודה. לחץ על לחצן "בדיקה לרוץ". לבחון את המידה הנוכחית (mA ~ 8-10).
    5. לאחר anodization פני השטח, לשטוף את השקופית ביסודיות עם מים מזוקקים כפול, ניקוי יבש עם גז חנקן ולאחר מכן לאחסן בחדר 30% לחות יחסית עד להמשך השימוש.
  3. ייצור של ACG glycan microarray 22
    1. להכין בנפרד 100 µL של כל monovalent glycans (I-XI) באתילן גליקול-ריכוז 10 מ מ.
    2. לדלל את glycan הנ ל באמצעות מאגר ההדפסה (80% אתילן גליקול ו-20% מיוננים מים) כדי להפוך 100 מיקרומטר ריכוז.
    3. במחקר הטרו-ליגנד, להכין 5 µL של הפרט אני-XI glycans, וכן לכל אחד להוסיף 5 µL של האיש5GlcNAc2 (יחס 1:1).
    4. מיקרו-מערכים ההדפסה על-ידי רובוטית להצמיד (ראה טבלה של חומרים) על-ידי בתצהיר של 0.6 nL של glycans מוכן בעבר על גבי ACG שקופיות31.
    5. לאחסן בשקופיות המודפסות בתיבת לחות הנשלט יבש לפני איגוד וזמינותו.
  4. מיפוי glycan epitopes של HIV-1 נטרול בהרחבה נוגדן PG9 22
    1. להכין 1 מ"ל BSA הכיל מאגר PBST, 3% w/v.
    2. להכין 70 µL של PG9 (µg 50/mL) במאגר PBST (BSA הכיל מאגר PBST, 3% w/v).
    3. להכין µL 120 של נוגדנים משניים תגית פלורסנט החמור נגד אג (אלכסה עבור חיל הים 647 מצומדת) 50 µg/mL במאגר PBST (BSA הכיל מאגר PBST, 3% w/v) בחושך.
    4. מערבבים נוגדן ראשוני (PG9), נוגדנים תגית פלורסנט משנית ביחס 1:1 (60 µL כל אחד). דגירה מעורבבים מראש נוגדנים במשך 30 דקות ב 4 º C.
    5. טעינת השקופית ACG אל החדר הדגירה שקופיות אשר מחולק ל 16 בארות. להעביר המערך glycan 100 µL מעורבבים מראש נוגדנים, דגירה ב 4 ° C עבור 16 h.
    6. Pipet החוצה נוגדנים מעורבבים מראש. הסר תא הדגירה שקופיות.
    7. לשטוף את השקופית קודם במאגר PBST (PBS ל- 0.05% Tween-20), ואחריו מים מיוננים ו ספין יבש ב 2,000 x g.
    8. פתח את תוכנת ניתוח התמונה microarray (ראה טבלה של חומרים). הוסף שקופית עם התכונות ערוכים פונה כלפי מטה.
    9. לחץ על תפריט "הגדרות", הגדר את רזולוציית התמונה ל 5 מיקרומטר לפיקסל, אורך הגל בעומק 635 nm עם PMT450 וכוח ל- 100%.
    10. לחץ על הכפתור "סרוק" להתחיל הדמיה של השקופית.
    11. לחץ על הסמל 'קובץ' כדי לשמור את התמונה הסריקה בפורמט tif.
    12. לבצע ניתוח תמונות לפי המדריך של המשתמש בתוכנה32.
    13. לחשב את עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכולל ולאייר באמצעות עיבוד תוכנה33 תמונה (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: כאן, השגיאה האחוז הממוצע עבור כל נקודות נתונים מוצגת על-ידי קווי שגיאה.

תוצאות

אסטרטגיה כימותרפיה-אנזימטי מודולרי לסינתזה של מגוון רחב של N -glycans מוצג באיור1. האסטרטגיה היא מבוססת על העובדה כי ניתן ליצור גיוון בהתחלה על ידי כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של המודולים חשוב שלוש, ואחריו את mannosylation ספציפיים α-ה 3-O ו/או 6-O המיקום של...

Discussion

מחלקה של HIV-1 bNAbs כולל PG9, PG16 ו PGTs 128, 141-145 דווחו להיות חזק מאוד בהשמדת 70-80% של מחזורי מבודד HIV-1. Epitopes של bNAbs האלה מאוד נשמרים בין המשתנים של כל הקבוצה HIV-1 מ', ולכן הם להנחות את העיצוב immunogen יעיל עבור חיסון HIV שמעודדים נטרול נוגדנים23,24,25 . כחלק מהמאמצ?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה את חטיבת טכנולוגיות סרט דק, מרכז מחקר טכנולוגיית כלי נגינה (ITRC), לאומי מוחל מעבדות מחקר, שער המזרח, טייוואן. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע (מענק. לא. רוב 105-0210-01-13-01), אקדמיה Sinica.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma Aldrich64197
AcetonitrileSigma Aldrich75058
Acetic anhydrideSigma Aldrich108247
Anhydrous magnesium sulfateSigma Aldrich7487889
Boron trifluoride ethyl etherateSigma Aldrich109637
Bovine serum albuminSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamideBio-Rad1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichlorideSigma Aldrich12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milkSigma Aldrich48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Cerium ammonium molybdateTCIC1794
Cerium ammonium nitrateSigma Aldrich16774213
Clean glass slide Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acidSigma Aldrich3063716
Deuterated chloroformSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugatedJackson Immuno Research, USA709605098
DichloromethaneSigma Aldrich75092
Diethylaminosulfur trifluorideSigma Aldrich38078090
DimethylformamideSigma Aldrich68122
Ethyl acetateSigma Aldrich141786
Ethylene glycolAcros Organic107211
FAST frame slide incubation chambersSigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 software Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis)moleculardeviceswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing )GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxideSigma Aldrich1310652
Manganese chlorideSigma Aldrich7773015
MethanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Oxalic acidAcros Organic144627
Palladium hydroxideSigma Aldrich12135227
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific 10010023
PyridineSigma Aldrich110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrateSigma Aldrich773476
Silver triflateSigma Aldrich2923286
Sodium bicarbonateSigma Aldrich144558
Sodium chlorideSigma Aldrich7647145
Sodium hydrogen carbonateSigma Aldrich144558
Sodium methoxide Sigma Aldrich124414
Sodium sulfateSigma Aldrich7757826
Toluene Sigma Aldrich108883
Tris buffer AmrescoN/AUltra-pure grade
Tween-20Amresco9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose)Sigma Aldrich137868521

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

132ACG glycanHIVN glycans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved