Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura

Riepilogo

Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.

Abstract

Vi presentiamo un modo altamente efficiente per la preparazione rapida di una vasta gamma di N-collegato oligosaccaridi (stimati a superare i 20.000 strutture) che si trovano comunemente sulle glicoproteine umane. Per ottenere il desiderato diversità strutturale, la strategia ha cominciato con il chemio-enzimatico di sintesi dei tre tipi di moduli di fluoruro di oligosaccharyl, seguite da loro graduale glycosylations α-selettivo presso la 3-O e 6-O posizioni della residui di mannosio del trisaccaride nucleo comune avendo un legame β-mannoside cruciale. Abbiamo attaccato ulteriormente gli N- glicani alla superficie di una lastra di vetro rivestita di ossido di alluminio (ACG) per creare un array misto covalente per l'analisi dell'interazione ligando-etero con un anticorpo HIV. In particolare, il comportamento di associazione di un nuovo isolato HIV-1 largamente anticorpo neutralizzante (bNAb), PG9, alla miscela di ravvicinate Man₅GlcNAc₂ (uomo₅) e 2,6-di-sialilato bi-antennary complesso tipo N- glycan (SCT ) su una matrice ACG, apre una nuova strada per guidare la progettazione immunogen efficace per lo sviluppo del vaccino HIV. Inoltre, la nostra matrice ACG incarna un potente strumento per studiare altri anticorpi anti-HIV per il comportamento di etero-ligando.

Introduzione

N- glicani su glicoproteine sono covalentemente ad l'asparagina (Asn) residuo di sequon di Asn-Xxx-Ser/Thr di consenso, che interessano diversi processi biologici come il riconoscimento di conformazione, antigenicità, solubilità e lectina di proteina ^{1 , 2}. la sintesi chimica di N-collegati oligosaccaridi rappresenta una sfida sintetica significativa a causa della loro enorme eterogeneità strutturale micro e architettura altamente ramificato. Un'attenta selezione di proteggere gruppi per ottimizzare la reattività di blocchi predefiniti, raggiungimento di selettività presso centri anomerici e uso corretto del promotore / activator(s) sono elementi chiave nella sintesi di oligosaccaridi complessi. Per risolvere il problema della complessità, una grande quantità di lavoro per far avanzare di N- glycan sintesi è stata segnalata recentemente^3,4. Nonostante questi approcci robusti, trovando un metodo efficace per la preparazione di una vasta gamma di N- glicani (~ 20.000) rimane una grande sfida.

Il tasso di mutazione rapida di HIV-1 per ottenere la vasta diversità genetica e la sua capacità di fuggire da neutralizzare la risposta anticorpale, è tra le più grandi sfide per sviluppare un vaccino sicuro e profilattico contro HIV-1^{5,6 , 7}. una tattica efficace che l'HIV utilizza per evitare la risposta immunitaria è la glicosilazione post-traduzionale della busta glicoproteina gp120 con una diversificata N-collegato glicani derivato dal host glicosilazione macchine^{8, 9}. Un recente rapporto per quanto riguarda l'analisi precisa dei ricombinanti monomerica glicosilazione di gp120 di HIV-1 da cellule 293T cellule embrionali umane del rene (HEK) suggerisce l'avvenimento di microheterogeneity strutturale con un modello caratteristico di cellula-specifico^{10 , 11 , 12}. Pertanto, la comprensione delle specificità glycan di HIV-1 bNAbs richiede ben caratterizzati gp120 relative N- glycan strutture in quantità sufficiente per l'analisi.

La scoperta della tecnologia microarray glycan fornito alta basati su velocità effettiva esplorazione delle specificità di una gamma diversificata di carboidrati proteine, virus/batterica adesine, tossine, anticorpi e lectines^13,14 . La disposizione sistematica glicani in un formato basato su chip allinearono potrebbe determinare interazioni proteina-glycan problematico bassa affinità attraverso presentazione multivalente^15,16,17,18. Questa disposizione basata su chip glycan convenientemente sembra imitare efficacemente interfacce cellula-cellula. Per arricchire la tecnologia e superare il problema irregolare connesso con formati di matrice convenzionale, il nostro gruppo ha recentemente sviluppato una matrice glycan su un vetrino in vetro rivestita di ossido di alluminio (ACG) usando glicani attacco acido fosfonico per aumentare l'intensità del segnale, omogeneità e sensibilità^19,20.

Per migliorare la comprensione corrente circa glycan epitopi di recente isolato HIV-1 largamente neutralizzando gli anticorpi (bNAbs), abbiamo sviluppato una strategia modulare altamente efficiente per la preparazione di una vasta gamma di N-collegato glicani^{21 ,22} per essere stampati su un ACG piastrina (Vedi Figura 1). Specificità di profilatura studi di HIV-1 bNAbs su una matrice ACG offerto l'individuazione insolita del comportamento di associazione di etero-glycan di altamente potente bNAb PG9 che è stato isolato da HIV infettato gli individui^23,24,25.

Protocollo

1. preparazione del D1/D2 braccio moduli²²

1. Preparazione di intermedi 2
   1. Pesare a partire del materiale 1 (illustrata nella Figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) in una provetta da 15 mL e sciogliere in Tris tampone (25 mM, pH 7.5) contenente Dicloruro di manganese (MnCl₂, 10 mM) per ottenere una concentrazione finale glycan di 5 mM.
   2. Aggiungere 2 equivalenti di galattosio di uridina difosfato (UDP-Gal).
   3. Aggiungere 150 unità di enzima β-1, 4 galattosil transferasi da latte bovino e incubare la miscela a 37 ^oC per 15 h.
   4. Dopo 15 h, eseguire cromatografia su strato sottile (TLC) per indicare il consumo totale del materiale di base individuando la miscela di reazione su un piatto di TLC, sviluppare con n-butanolo/acido acetico/acqua (H₂O) 1:1:1 rapporto e colorazione di un soluzione di 0,25 M cerio Ammonio molibdato seguito dal riscaldamento. Poi placare la reazione di riscaldamento a 90 ^oC per 5 min.
   5. Centrifugare la miscela di reazione ad una velocità di 2.737 x g per 3 min e caricare il surnatante nella parte superiore della colonna di gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali). Eluire la colonna utilizzando acqua distillata deionizzata e raccogliere il prodotto con le frazioni di 1-2 mL.
   6. Monitorare la raccolta differenziata da TLC²⁶, sviluppare con n-butanolo: H₂o: acido acetico in un 1:1:1 rapporto e colorazione di una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguito dal riscaldamento. Lyophilize²⁷ il prodotto contenente frazioni per ottenere intermedio 2 (115 mg, 86%) come polvere bianca. Caratterizzano il prodotto di NMR²⁸ e spettroscopia di massa²⁹ (vedere File di dati supplementari).
2. Preparazione di intermedio 3
   1. Pesare a partire del materiale 2 (illustrato nella Figura 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0.122 mmol)) in una provetta da 15 mL e dissolverlo in Tris tampone (25 mM, pH 7.5) contenenti MnCl₂ (10 mM) per preparare una concentrazione finale glycan di 5 mM.
   2. Aggiungere 2 equivalenti di sale di guanosina 5'-membrana in direzione extra-β-L-fucosio disodico (PIL-Fuc).
   3. Aggiungere 150 unità di enzima α-1, 3 fucosil transferasi da Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695) e incubare la miscela a 37 ^oC per 15 h.
   4. Seguire il passaggio 1.1.4.
   5. Seguire il passaggio 1.1.5.
   6. Seguire passo 1.1.6 ottenere intermedio 3 (82 mg, 84%) come polvere bianca. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).
3. Preparazione di moduli 4 e 5
   1. Pesare il composto 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,230 g, 0.360 mmol) o composti 3, p- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0,125 mmol) in un matraccio da 25 mL singolo-collo rotondo-fondo e a secco sotto vuoto per 30 min.
   2. Rimuovere la beuta da vuoto, riempire con gas azoto, aggiungere un ancoretta magnetica, dirla con un setto di gomma e allegare un palloncino di azoto.
   3. Iniettare il pallone posizionato su un bagno di ghiaccio a 0 ^oC. mescolare la reazione risultante per 12 h a temperatura ambiente con un agitatore magnetico a 600-700 giri/min 7 mL di piridina asciutto e 3 mL di anidride acetica (Ac₂O). Evaporare i solventi utilizzando un rotary evaporatore a una pressione di vuoto 0 - 10 mbar a 50 ^oC.
   4. Diluire la miscela grezza con 30 mL di diclorometano (DCM) ed estrarre con bicarbonato di sodio acquoso saturo (NaHCO₃) (2 x 20 mL) in un imbuto separatore 50 mL.
   5. Ri-estrarre lo strato acquoso con DCM (3 x 15 mL) e asciugare gli strati organici combinati su solfato di sodio. Rimuovere il solfato di sodio per filtrazione e lavare con DCM (5 mL). Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 400 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
   6. Caricare la soluzione della miscela grezza in 2 mL di DCM sopra il letto di silice.
   7. Eluire la colonna con una miscela che contiene toluene e l'acetone da 0 - 20% di acetone in toluene e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
   8. Monitorare la raccolta differenziata da TLC (passaggi 1.1.4 e 1.1.6), sviluppando con toluene/acetone (7/3), e che macchia con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguiti dal riscaldamento su un piatto caldo.
   9. Evaporare il prodotto contenente frazioni utilizzando un evaporatore rotante per ottenere prodotti desiderati come schiuma bianca in 72% e 85% rendimenti, rispettivamente.
   10. Sciogliere i prodotti in 7 mL di acetonitrile: toluene: H₂O un 4:2:1 rapporto in un pallone da 25 mL.
   11. Aggiungere Cerio nitrato d'ammonio (2 equivalenti) durante il raffreddamento a 0 ^oC con un bagno di ghiaccio. Mescolare la reazione a temperatura ambiente per 3 h a ~ 500-800 giri/min.
   12. Dopo TLC indica consumo totale del materiale di partenza (TLC sviluppando con toluene/acetone (7/3) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), diluire la miscela di reazione con acetato di etile (30 mL) ed estratto con H₂O (15 x 2 mL).
   13. Estrarre gli strati organici combinati con 5 mL di soluzione satura di sodio cloruro (NaCl).
   14. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 240 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
   15. Caricare la soluzione del prodotto grezzo in 2 mL di DCM sopra il letto di silice. Eluire la colonna con una miscela che contiene toluene e l'acetone (0 - 20% di acetone in toluene) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con toluene/acetone (7/3).
   16. Far evaporare le frazioni contenenti prodotto utilizzando un evaporatore rotante a vuoto mbar 77 e 40 ^oC per ottenere prodotti desiderati come schiume bianche.
   17. Sciogliere i rispettivi alcoli in 10 mL di DCM in un singolo-collo-25ml pallone e raffreddare a-30 ^oC.
   18. Aggiungi diethylaminosulfur trifluoruro (DAST, 2 equivalenti). Mescolare la miscela di reazione a-30 ^oC per 2 h.
   19. Dopo TLC indica il consumo di materiale di partenza (TLC sviluppando con toluene/acetone (4/1) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), diluire la miscela di reazione con DCM (30 mL) , e lavare con saturi NaHCO₃ (15 x 2 mL).
   20. Estrarre lo strato organico combinato con 5 mL di soluzione satura di NaCl, asciugarlo con l'aggiunta di solfato di magnesio anidro, filtrare la miscela dopo un lavaggio con DCM (5 mL) e raccoglierlo in un pallone da 100 mL singolo-collo.
   21. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 400 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
   22. Caricare la soluzione del prodotto grezzo in 2 mL di DCM sopra il letto di silice. Eluire la colonna con una miscela di toluene e l'acetone (0-20% di acetone, toluene) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
   23. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con toluene/acetone (7/3).
   24. Evaporare il prodotto contenente frazioni utilizzando un evaporatore rotante per ottenere prodotti desiderati 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-triacetil-α-D-mannopyranosyl fluoruro (54% superiori a 2 passi) e 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-Mannopyranosyl fluoruro (67% superiori a 2 passi) come solidi bianchi.
   25. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).

2. preparazione del Glycan 10

1. Preparazione di intermedio 7
   1. Pesare il dicloruro di argento triflato (AgOTf) (0,039 g, 0,155 mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (Cp₂HfCl₂) (0,041 g, 0,108 mmol) in un pallone a sfondo sferico singolo-collo-25ml, asciugarlo sotto vuoto linea schlenk per 30 min, rimuoverlo dalla il vuoto e riempirlo con gas azoto.
   2. Trasferire appena secchi 4 Å setacci molecolari (0,2 g) nella beuta contenente il AgOTf e Cp₂HfCl₂, aggiungere un ancoretta magnetica, tappo con setto immediatamente e aggiungere un fumetto con azoto.
   3. Trasferire 3 mL di toluene asciutto nel pallone con una siringa di vetro asciutto. Mescolare la miscela di reazione per 1 h a temperatura ambiente e poi lasciare raffreddare a 0 ^oC.
   4. Iniettare una soluzione di donatore 4 (Figura 2, 0,043 g, 0,046 mmol) e acceptor 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Figura 3, 0,045 g, 0,031 mmol) in 3 mL di toluene nel pallone mediante setto utilizzando una siringa da 10 mL a 0 ^o C. mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 3 h.
   5. Dopo TLC indica il consumo di materie prime (TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), placare la reazione di iniettare 10 equivalenti di trietil ammina.
   6. Filtrare i setacci molecolari attraverso un letto di celite in un pallone a fondo rotondo da 50 mL e ulteriormente lavare con 10 mL di acetato di etile. Estrarre gli strati organici combinati con una soluzione satura di acquosa NaHCO₃ (2 x 20 mL) in un imbuto separatore 50 mL. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 15 mL).
   7. Estrarre gli strati organici combinati con soluzione satura di NaCl (5 mL), asciugarlo utilizzando solfato di magnesio anidro, filtrare la miscela per rimuovere il solfato di magnesio, lavare con acetato di etile (3 x 15 mL) e raccogliere il filtrato in un pallone a fondo rotondo da 100 mL.
   8. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 240 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
   9. Caricare la soluzione del prodotto grezzo in DCM in cima alla colonna del letto di silice. Eluire la colonna con una miscela contenente DCM e acetone (0-10% di acetone in DCM) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
   10. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5). Far evaporare le frazioni contenenti il prodotto con un evaporatore rotante per ottenere [5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7, intermedio 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, 70%), come schiuma bianca.
   11. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).
2. Preparazione di intermedio 8
   1. Pesare hexasaccharide 7 (Figura 3, 0,040 g, 0,016 mmol) in un pallone a sfondo sferico singolo-collo-25ml, asciugarlo sotto vuoto per 1 h, rimuoverlo dal vuoto, riempire con gas azoto, aggiungere un ancoretta magnetica e dirla con un setto di gomma.
   2. Trasferire 3 mL di acetonitrile:methanol (MeOH) (rapporto 2:1) nel pallone.
   3. Aggiungi p-toluene sulfonic acido monoidrato (0,001 g, 0.008 mmol) nel pallone di reazione e mescolare la reazione a 800 rpm per 5 h.
   4. Dopo TLC indica consumo di materiale di partenza (TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5) e la visualizzazione di capacità di assorbimento UV a 254 nm o macchiando con una soluzione di molibdato d'ammonio cerio seguita da riscaldamento), placare la reazione di iniettare 10 equivalenti di trietil ammina.
   5. Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 337 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
   6. Sciogliere la miscela grezza con circa 2 mL di DCM e caricarlo sopra il letto di silice.
   7. Eluire la colonna con una miscela di acetone (0 - 10% di acetone in DCM) e DCM e raccogliere le frazioni di 5-10 mL. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppando con DCM/acetone (8,5/1.5). Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante a 400 mbar vuoto e 40 ^oC.
   8. Asciugare il residuo sotto pressione ridotta per dare intermedio 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-acetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1 → 4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Figura 3, 0,022 g, 57%) come solido bianco. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).
3. Preparazione di intermedio 9
   1. Preparazione di intermedio 9 (Figura 3) è stato realizzato utilizzando donatore 5 (0,015 g, µmol 13,2) e acceptor 8 (Figura 3, 0,020 g, 8.80 µmol).
   2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) e Cp₂HfCl₂ (0,012 g, 30,8 µmol) sono stati utilizzati come un promotori.
   3. Eseguire i passaggi 2.1.1 a 2.1.10 arrivare intermedio 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deossi-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as schiuma bianca.
4. Deprotezione globale di intermedio
   1. Pesare il composto 9 (0,010 g, 2,9 µmol) in un pallone a sfondo sferico singolo-collo-25ml, aggiungere un ancoretta magnetica, tappo con un setto di gomma e allegare un palloncino di azoto.
   2. Trasferire 2 mL di 1, 4 diossano: H₂O (4:1) nel pallone. Aggiungere idrossido di litio (LiOH) (0,005 g, 50% di peso) nel pallone. Mescolare la miscela di reazione a 90-100 ^oC per 12 h e lasciarla raffreddare a TA.
   3. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante e asciugare il pallone sotto vuoto per 1 h, riempirlo con azoto, rimuoverlo dal collettore di aspirazione e dirla con un setto di gomma.
   4. Iniettare 4 mL di piridina asciutto e 2 mL di anidride acetica nel matraccio attraverso il setto con una siringa da 10 mL a 0 ^oC. mescolare la miscela di reazione per 12 h a TA.
   5. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante a 0-10 mbar di pressione vuoto a 50 ^oC.
   6. Sciogliere la miscela grezza con 30 mL di soluzione DCM ed estrarre la soluzione satura acquosa NaHCO₃ (2 x 20 mL) in un imbuto separatore 50 mL.
   7. Ri-estrarre lo strato acquoso con DCM (3 x 15 mL). Far evaporare il solvente mediante evaporatore rotante.
   8. Caricare una soluzione di prodotto in circa 2 mL di DCM sopra il letto di silice C18. Eluire la colonna con una miscela di acqua e metanolo (0 - 100% di metanolo in acqua) e raccogliere le frazioni di 5-10 mL.
   9. Raccogliere le frazioni di prodotto ed evaporare sotto pressione ridotta per ottenere il prodotto desiderato come schiuma bianca.
   10. Sciogliere il prodotto in 5 mL di metanolo asciutto in un pallone da 25 mL e dirla con un setto di gomma.
   11. Trasferire 0,1 mL di metossido di sodio (NaOMe) in metanolo e fresco a 0 ^oC con un bagno di ghiaccio e mescolare il composto per 12 h.
   12. Togliere il solvente mediante evaporatore rotante e asciugare il prodotto sotto alto vuoto.
   13. Sciogliere i prodotti grezzi in 5 mL di metanolo: H₂o: acido acetico (6:3:1).
   14. Aggiungere idrossido di Palladio (Pd(OH)₂) (50% in peso) e mescolare la reazione sotto atmosfera di idrogeno usando un palloncino di idrogeno per 15 h.
   15. Filtrare la reazione attraverso un letto di celite e lavare con 2 mL di metanolo seguiti da 2 mL di acqua dd.
   16. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante.
   17. Sciogliere la miscela grezza con circa 1 mL di acqua e caricarlo sul letto del gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali). Eluire il prodotto con acqua e raccogliere le frazioni di 1-2 mL.
   18. Monitorare la raccolta differenziata da TLC, sviluppare con n-butanolo: H₂o: acido acetico (1:1:1).
   19. Raccogliere le frazioni di prodotto e lyophilize per ottenere il prodotto desiderato 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-( α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a polvere bianca.
   20. Caratterizzano il prodotto di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari).

3. preparazione dei glicani con coda acido fosfonico^19,22

1. Pesare i rispettivi glycan (2-5 µmol) in un pallone da 5 mL, aggiungere un ancoretta magnetica e dirla con un setto di gomma.
2. Trasferimento di 400 µ l di dimetilformammide appena essiccato.
3. Aggiungi [2 (2 (2 (bis (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) carbonato di etile (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl)] (10-25 µmol, preparata in casa) per la soluzione di glycan. Mescolare il composto a 800 rpm per 5 h.
4. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante a 5-10 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
5. Sciogliere la miscela di reazione in 0,5 mL di acqua e caricare nella parte superiore del letto del gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali). Eluire il prodotto utilizzando acqua e raccogliere le frazioni di 1-2 mL.
6. Monitorare la raccolta differenziata di TLC²⁶. Individuare la miscela di reazione su un piatto di TLC ed aggiungere la soluzione di macchia di 0,25 M cerio molibdato d'ammonio; seguire di riscaldamento utilizzando un piatto caldo. Raccogliere il prodotto contenente frazioni e lyophilize per ottenere il prodotto desiderato come una polvere bianca.
7. Sciogliere il prodotto in 2 mL di acqua e aggiungere Pd (OH)₂ (50% in peso). Mescolare la reazione a 800 rpm sotto atmosfera di idrogeno usando un palloncino di idrogeno per 15 h.
8. Filtrare la reazione attraverso un letto di flusso-calcinato e lavare con 2 mL di metanolo seguiti da 2 mL di acqua distillata deionizzata. Evaporare i solventi mediante un evaporatore rotante a 300 mbar di pressione vuoto a 40 ^oC.
9. Sciogliere la miscela grezza con circa 1 mL di acqua e caricarlo sul letto del gel di poliacrilammide (Vedi Tabella materiali).
10. Eluire il prodotto con acqua e raccogliere le frazioni di 1-2 mL. Monitorare la raccolta differenziata di TLC²⁶. Le frazioni di lyophilize (congelare il prodotto usando azoto liquido poi posto su liofilizzatori sotto vuoto) per ottenere il prodotto desiderato come una polvere bianca. Caratterizzano i prodotti di NMR e spettrometria di massa (vedere il File di dati supplementari) con D₂O come un solvente.

4. Glycan Array

1. Preparazione di alluminio rivestito vetro diapositive (slide ACG) ^{19 , 20 , 22}
   Nota: Fabbricazione delle diapositive in alluminio con vetro è stato fatto a Thin Film Technology Division, strumento Technology Research Center e laboratori di ricerca applicata nazionale, parco scientifico Hsinchu, Taiwan.
   1. Pack scivoli rivestiti, vuoto-seal loro per prevenire la formazione di NAO e mantenere sigillato fino a quando la reazione elettrochimica per anodizzazione superficiale.
2. Superficie anodizzazione dell'alluminio rivestito di lastre di vetro ^{19 , 20 , 22}
   1. Impostare l'incubatore termostatato a 4 ° C. Preparare la soluzione acquosa di acido ossalico 0.3 M e tenerlo in un bagno di ghiaccio. Prendere il becher da 500 mL, aggiungere una barra di agitatore magnetico.
   2. Trasferire l'acido ossalico 0,3 M becher da 500 mL e quindi inserire un bastoncino di 10cm lungo platino come catodo nella soluzione. Continuate a mescolare (a 300 giri/min) l'acido ossalico durante tutto il processo di anodizzazione.
   3. Girare il software tracer lab, fare clic sul pulsante "Configura" poi "funzione tensione sweep scelta." Impostare l'inizio e interrompere la tensione a 25,8 V, numero di punti a 100, rispetto a 1 e spazzare ritardo a 1.200 ms e fare clic su "ok".
   4. Fissare il lato in alluminio con vetro rivolto verso il catodo. Fare clic sul pulsante "Esegui test". Osservare la misura della corrente (~ 8-10 mA).
   5. Dopo l'anodizzazione superficiale, lavare il vetrino accuratamente con acqua distillata doppia, eliminazione dei fogli inceppati asciutto con gas azoto e quindi memorizzare in una camera di 30% di umidità relativa fino al successivo utilizzo.
3. Fabbricazione di ACG glycan microarray ²²
   1. Preparare individualmente 100 µ l di tutti i glicani monovalenti (I-XI) in glicole etilenico alla concentrazione di 10 mM.
   2. Diluire il glycan sopra con buffer di stampa (80% glicole etilenico e 20% acqua deionizzata) per effettuare una concentrazione di 100 µM.
   3. Per lo studio di etero-ligando, preparare 5 µ l di singoli XI glicani e ognuno aggiungere 5 µ l del uomo₅GlcNAc₂ (rapporto 1:1).
   4. Stampa microarrays di robotica pin (Vedi Tabella materiali) per la deposizione di 0,6 nL dei glicani precedentemente preparato su ACG diapositive³¹.
   5. Archiviare le diapositive stampate in una scatola asciutta umidità controllata prima del dosaggio di associazione.
4. Mappatura glycan epitopi di HIV-1 anticorpo neutralizzante ampiamente PG9 ²²
   1. Preparare 1 mL BSA contenuta tampone PBST, 3% p/v.
   2. Preparare 70 µ l di PG9 (50 µ g/mL) in tampone PBST (BSA contenute tampone PBST, 3% p/v).
   3. Preparare 120 µ l di anticorpo secondario fluorescente tag asino anti-IgG umano (Alexa Fluor 647 coniugato) 50 µ g/mL in tampone PBST (BSA contenute tampone PBST, 3% p/v) al buio.
   4. Mix di anticorpo primario (PG9) e dell'anticorpo secondario tag fluorescente in rapporto 1:1 (da 60 µ l). Incubare gli anticorpi premiscelati per 30 min a 4 ° C.
   5. Caricare la diapositiva ACG nella camera di incubazione di diapositiva che è diviso in 16 pozzetti. Trasferire 100 µ l di anticorpi premiscelati nella matrice glycan e incubare a 4 ° C per 16 h.
   6. Dispensare fuori anticorpi premiscelati. Rimuovere la camera di incubazione di diapositiva.
   7. Lavare il vetrino in primo luogo nel buffer di PBST (PBS e 0.05% Tween-20), seguita da acqua deionizzata e spin asciutto a 2.000 x g.
   8. Aprire il software di analisi di immagine di microarray (Vedi Tabella materiali). Inserire una diapositiva con le caratteristiche allinearono rivolto verso il basso.
   9. Fare clic sul menu "Impostazioni", impostare la risoluzione dell'immagine di 5 µm per pixel e la lunghezza d'onda a 635 nm con PMT450 e potenza al 100%.
   10. Fare clic sul pulsante "scan" per avviare la diapositiva di imaging.
   11. Fare clic sull'icona "file" per salvare l'immagine di scansione in formato tif.
   12. Eseguire analisi di immagine seguendo guida^{32 dell'utente del software}.
   13. Calcolare il totale intensità di fluorescenza e illustrare utilizzando software³³ di elaborazione dell'immagine (Vedi Tabella materiali).
       Nota: Qui, l'errore medio percentuale per tutti i punti dati è presentato da barre di errore.

Risultati

Una strategia modulare chemo-enzimatica per la sintesi di una vasta gamma di N -glicani è presentata nella Figura 1. La strategia è basata sul fatto che la diversità può essere creato all'inizio da chemio-enzimatico di sintesi dei tre moduli importanti, seguita dalla mannosilazione α-specifiche con il 3-O e/o 6-O posizione del residuo mannosio del comune trisaccaride nucleo di N- glicani. Considerando la diversità str...

Discussione

Una classe di HIV-1 bNAbs tra cui PG9, PG16 e PGTs 128, 141-145 sono stati segnalati per essere altamente potente nel neutralizzare il 70-80% del circolante isolati HIV-1. Gli epitopi di questi bNAbs sono altamente conservati tra le varianti del gruppo intero di HIV-1 M, quindi si può guidare la progettazione immunogen efficace per un vaccino contro l'HIV suscitare anticorpi neutralizzanti^23,24,25 . Come parte dei nostri sforzi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sigma Aldrich	64197
Acetonitrile	Sigma Aldrich	75058
Acetic anhydride	Sigma Aldrich	108247
Anhydrous magnesium sulfate	Sigma Aldrich	7487889
Boron trifluoride ethyl etherate	Sigma Aldrich	109637
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide	Bio-Rad	1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride	Sigma Aldrich	12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk	Sigma Aldrich	48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)	Arrayit
Cerium ammonium molybdate	TCI	C1794
Cerium ammonium nitrate	Sigma Aldrich	16774213
Clean glass slide	Schott
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid	Sigma Aldrich	3063716
Deuterated chloroform	Sigma Aldrich	865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated	Jackson Immuno Research, USA	709605098
Dichloromethane	Sigma Aldrich	75092
Diethylaminosulfur trifluoride	Sigma Aldrich	38078090
Dimethylformamide	Sigma Aldrich	68122
Ethyl acetate	Sigma Aldrich	141786
Ethylene glycol	Acros Organic	107211
FAST frame slide incubation chambers	Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt	Sigma Aldrich	15839700
Lab tracer 2.0 software			Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis)	moleculardevices		www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing )	GraphPad Software, Inc		http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide	Sigma Aldrich	1310652
Manganese chloride	Sigma Aldrich	7773015
Methanol	Sigma Aldrich	67561
N-butanol	Sigma Aldrich	71363
Oxalic acid	Acros Organic	144627
Palladium hydroxide	Sigma Aldrich	12135227
Phosphate Buffered Saline	Thermo Fisher Scientific	10010023
Pyridine	Sigma Aldrich	110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate	Sigma Aldrich	773476
Silver triflate	Sigma Aldrich	2923286
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	144558
Sodium chloride	Sigma Aldrich	7647145
Sodium hydrogen carbonate	Sigma Aldrich	144558
Sodium methoxide	Sigma Aldrich	124414
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	7757826
Toluene	Sigma Aldrich	108883
Tris buffer	Amresco	N/A	Ultra-pure grade
Tween-20	Amresco	9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose)	Sigma Aldrich	137868521