JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

N- glukanlardir bağlantı için bir alüminyum oksit kaplı cam sentezi için modüler bir yaklaşım olarak geliştirilen glycan Mikroarray ve geniş antikor nötralize bir HIV profil oluşturma için kullanımı gösterilmiştir (ACG slayt) kaydırın.

Özet

Ngeniş bir hızlı hazırlanması için son derece verimli bir şekilde tanıtacağız-bağlı yaygın insan glikoproteinlerin üzerinde bulunan (20.000 yapıları aşmayı tahmini) oligosakkaritler. İstenilen yapısal çeşitlilik ulaşmak için strateji oligosaccharyl florür modülleri, onların kademeli α-seçici glycosylations 3-Ey ve 6-Ey ardından üç tür kemoterapi enzimatik sentezi ile başladı. olarak konumlandırır bir çok önemli β-mannoside bağlantı sahip ortak çekirdek trisaccharide mannoz kalıntısı. Biz daha fazla kovalent karışık dizi analizi ile bir HIV antikor hetero-ligand etkileşim için oluşturmak için bir alüminyum oksit kaplı cam (ACG) slayt yüzeyine N- glukanlardir bağlı. Özellikle, N- glycan (SCT bağlama davranışı bir yeni izole HIV-1 geniş nötralize antikor (bNAb), PG9, yakından aralıklı adam5GlcNAc2 karışımı (adam5) ve 2,6-di-sialylated BI antennary kompleks yazın ) ACG dizi etkili immunogen tasarım HIV aşı geliştirme için rehberlik için yeni bir cadde açar. Buna ek olarak, bizim ACG dizi diğer HIV antikor hetero-ligand bağlayıcı davranış için eğitim için güçlü bir araç içerir.

Giriş

N- glukanlardir glikoproteinlerin üzerinde kovalent asparagine için fikir birliği Asn-Xxx-Ser/Thr sequon kalıntısı (Asn) protein uyum, antigenicity, çözünürlük ve lektin tanıma gibi birçok biyolojik süreçlerin etkileyen bağlıdır 1 , 2. kimyasal sentez n-bağlantılı oligosakkaritler temsil eden önemli bir sentetik sorun onların büyük yapısal mikro heterojenite ve çok dallı mimarisi nedeniyle. Reaktivite yapı taşları, anomerik merkezleri ve organizatörü doğru kullanımı seçicilik ulaşmak ayarlamak için koruma dikkatli seçimi gruplar / activator(s) karmaşık oligosakkaritler sentezi temel unsurlarıdır. Karmaşıklık bu sorunu çözmek için N- glycan sentezi ilerlemek için iş büyük bir miktar bildirildi son zamanlarda3,4. Sağlam bu yaklaşımlardan rağmen büyük bir meydan (~ 20.000) kalıntıları N- glukanlardir geniş bir hazırlanması için etkili bir yöntem bulmak.

Geniş genetik çeşitlilik ve antikor yanıtı, nötralize kaçmak için onun yetenek elde etmek için HIV-1 hızlı mutasyon oranı olduğunu HIV-15,6 karşı güvenli ve profilaktik aşı geliştirmek için en büyük sorunları arasında , 7. konak immün yanıt önlemek için HIV kullanır bir etkili bir taktik olduğunu zarf glikoprotein gp120 farklı Nile post-translational glikozilasyon-bağlı ana bilgisayar glikozilasyon makine8, elde edilen glukanlardir 9. Rekombinant monomeric HIV-1 gp120 glikozilasyon insan embriyonik böbrek (HEK) 293T hücrelerden kesin analizi ile ilgili son bir rapor karakteristik hücre özel desen10 ile yapısal microheterogeneity oluşumunu göstermektedir , 11 , 12. bu nedenle, N- glycan yapıları analiz için yeterli bir miktar HIV-1 bNAbs glycan özelliklerine gerektirir iyi karakterize gp120 anlayış ile ilgili.

Glycan Mikroarray teknoloji keşfi karbonhidrat bağlanıcı proteinler, virüs/bakteriyel adhesins, toksinler, antikorlar ve lectines13,14 çeşitli bir yelpazede özelliklerine yüksek üretilen iş tabanlı keşif sağlanan . Sistematik glukanlardir düzenleme dizilmiş çip tabanlı biçimde sorunlu düşük benzeşme protein-glycan etkileşimleri ile multivalent tanıtımı15,16,17,18belirleyebilir. Bu çip tabanlı glycan düzenleme uygun etkili hücre-hücre arabirimleri taklit etmek için görünür. Teknoloji zenginleştirmek ve geleneksel dizi biçimleri ile ilişkili düzensiz sorunu aşmak için bizim grup son zamanlarda bir glycan dizi phosphonic asit sona erdi glukanlardir sinyal yoğunluğu artırmak için kullanarak bir alüminyum oksit kaplı cam (ACG) slayt üzerinde geliştirilen, homojenliği ve duyarlılık19,20.

Glycan epitopları yeni izole HIV-1 geniş antikorları (bNAbs) nötralize hakkında şimdiki anlayış geliştirmek için biz Ngeniş bir dizi hazırlanması için son derece verimli bir modüler strateji geliştirdik-bağlı glukanlardir21 ,bir ACG yazdırılacak22 (bkz. şekil 1) kaydırın. Özgüllük hetero-glycan bağlama davranışı son derece güçlü bNAb HIV izole PG9 sıradışı tespiti bireyler23,24,25enfekte HIV-1 bNAbs bir ACG dizisinde profil oluşturma çalışmaları sundu.

Protokol

1. D1/D2 hazırlanması kol modülleri22

  1. Orta 2 hazırlanması
    1. Malzeme 1 ( Şekil 2' de p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0,204 mmol) 15 mL tüp içine gösterilen) başlayarak tartmak ve arabellek (25 mM, pH 7.5) Tris içeren çözülür manganez ve (MnCl2, 10 mM) 5 mM bir son glycan konsantrasyon elde etmek için.
    2. 2 karşılıkları üridin nükleotittir galaktoz (UDP-Gal) ekleyin.
    3. 150 adet enzim β-1, 4 galactosyl Transferazlar sığır süt ekleyin ve 37 oC 15 h karisimin kuluçkaya.
    4. 15 h, gerçekleştirdikten sonra ince tabaka Kromatografi (TLC) malzeme TLC tabağa tepki karışımı kullanan diğer oluşumlar başlayan toplam tüketim belirtmek için nile Geliştirme-butanol/Asetik asit/su (H2O) 1:1:1 oran ve tarafından boyama bir 0.25 M Seryum amonyum molibdat Isıtma tarafından takip çözüm. O zaman reaksiyon, 90 oC 5 min için Isıtma tarafından gidermek.
    5. Reaksiyon karışımı 2,737 x g 3 dk hızında santrifüj kapasitesi ve süpernatant polyacrylamide jel sütunun en üstündeki yük ( Tablo malzemelerigörmek). Distile de-iyonize su kullanarak sütun elute ve kesirli sayıları 1-2 ml ürün toplamak.
    6. TLC26 nile Geliştirme tarafından toplanan kesirler izlemek-butanol: H2O: Asetik asit bir 1:1:1 oran ve Seryum amonyum molibdat Isıtma tarafından takip bir çözüm tarafından boyama. 27 ara 2 (115 mg, % 86'sı) elde etmek için kesirler içeren ürün beyaz toz lyophilize. Ürün NMR28 ve kütle spektroskopisi29 (ek veri dosyasına bakın) tarafından karakterize.
  2. Ara 3 hazırlanması
    1. Malzeme 2 ( Şekil 2' de p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0,122 mmol) bir 15 mL tüp içinde gösterilen) başlayarak tartmak ve Tris içinde çözülür son glycan konsantrasyonu 5 mm hazırlamak için tampon (25 mM, pH 7.5) içeren MnCl2 (10 mM).
    2. 2 karşılıkları guanozin 5'-diphospho-β-L-fucose disodyum tuzu (GSYİH-Fuc) ekleyin.
    3. Enzim α-1, 3 fucosyl Transferazlar Helicobacter pylori (Hp1-3FTΔ26695), üzerinden 150 adet ekleyin ve 37 oC 15 h karisimin kuluçkaya.
    4. Adım 1.1.4 izleyin.
    5. Adım 1.1.5 izleyin.
    6. Adım 1.1.6 ara 3 (82 mg, % 84) elde etmek için beyaz toz olarak izleyin. Ürün NMR ve kütle spektroskopisi (bkz: ek veri dosyası) tarafından karakterize.
  3. 4 ve 5 modülleri hazırlanması
    1. Bileşik 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,230 g, 0,360 mmol) veya bileşik 3, ptartmak- (0,100 g, 0,125 mmol) methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside 25 mL tek-boyun yuvarlak alt şişesi ve 30 dk için vakum altında kuru içine.
    2. Şişeye vakum kaldırmak, azot gazı ile doldurmak, manyetik heyecan çubuğu ekleme, bir lastik septum ile kap ve bir azot balon ekleyebilirsiniz.
    3. 7 mL kuru pyridine ve 3 mL asetik anhidrit (Ac2O) 0 oC. heyecan bir manyetik karıştırıcı 600-700 rpm ile oda sıcaklığında 12 h için ortaya çıkan tepki, bir buz banyosu yerleştirilen balonun içine enjekte. Bir rotary kullanarak çözücüler buharlaşır Evaporatör, bir vakum basıncı 0 - 50 oC., 10 mbar
    4. 30 mL diklorometan (DCM) kullanarak ham karışım sulandırmak ve doymuş sulu Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) ayıklamak (2 x 20 mL) 50 mL HCI'yi huni içine.
    5. DCM (3 x 15 mL) ile sulu katmanı yeniden ayıklayın ve kombine organik katmanlar üzerinde sodyum sülfat kuru. Sodyum sülfat filtrasyon tarafından kaldırmak ve DCM (5 mL) ile yıkayın. 400 mbar vakum basınç 40 oC., rotary Evaporatör kullanarak solvent buharlaşır
    6. Ham karışım çözüm DCM 2 mL silis yatağın üstüne yüklemek.
    7. Toluen ve 0 - %20 aseton, toluen üzerinden aseton içeren bir karışımı ile sütun elute ve 5-10 mL kesirleri toplamak.
    8. Toluen/aseton ile Geliştirme TLC (Adım 1.1.4 ve 1.1.6), tarafından toplanan kesirler izlemek (7/3), ve bir çözüm Seryum amonyum molibdat ile boyama sıcak tabakta Isıtma tarafından takip.
    9. İstenilen ürünler sırasıyla % 72 ve %85 verimleri, beyaz köpük olarak almak için döner Buharlaştırıcı kullanarak kesirler içeren ürün buharlaşır.
    10. Ürünler Asetonitril 7 mL dissolve: toluen: H2O bir 4:2:1 oranında bir 25 mL yuvarlak alt şişesi içinde.
    11. Seryum amonyum nitrat (2 eşdeğerleri) 0 oiçin bir buz banyosu kullanarak C soğutma sırasında ekleyin. Tepki 3 h ~ 500-800 rpm'de için oda sıcaklığında karıştırın.
    12. TLC malzeme başlayan toplam tüketimi gösterir sonra (TLC toluen/aseton ile Geliştirme (7/3) ve UV Absorbans 254 tarafından görüntülenmesi nm veya bir çözüm Isıtma tarafından takip Seryum amonyum molibdat ile boyama tarafından), reaksiyon karışımı ile sulandırmak Etil asetat (30 mL) ve özü ile H2O (15 x 2 mL).
    13. 5 mL doymuş Sodyum Klorür (NaCl) çözeltisi ile kombine organik katmanları ayıklayın.
    14. 240 mbar vakum basınç 40 oC., rotary Evaporatör kullanarak solvent buharlaşır
    15. Ham ürün çözüm DCM 2 mL silis yatağın üstüne yüklemek. Toluen ve aseton (0 - %20 aseton, toluen) içeren bir karışımı ile sütun elute ve 5-10 mL kesirleri toplamak. TLC, toluen/aseton ile Geliştirme tarafından toplanan kesirler izlemek (7/3).
    16. 77 mbar vakum ve 40 oC beyaz köpükler olarak istenilen ürünleri almak için döner Buharlaştırıcı kullanarak ürün içeren kesirleri buharlaşır.
    17. DCM 25 mL tek-boyun yuvarlak alt şişesi ve sakinleşmek için-30 EyC. 10 mL içine ilgili alkoller dağıtılması
    18. Diethylaminosulfur trifluoride (Tıklayacağım, 2 eşdeğerleri) ekleyin. -30 oC 2 h, reaksiyon karışımı ilave edin.
    19. TLC tüketimi malzeme başlayan gösterir sonra (TLC toluen/aseton ile Geliştirme (4/1) ve 254 Absorbans UV tarafından görüntülenmesi nm veya bir çözüm Isıtma tarafından takip Seryum amonyum molibdat ile boyama), reaksiyon karışımı DCM (30 mL) ile sulandırmak , ve yıkama ile doymuş NaHCO3 (15 x 2 mL).
    20. 5 mL doymuş NaCl çözeltisi ile kombine organik katman ayıklamak, susuz Magnezyum sülfat ekleyerek kuru, bir yıkama DCM (5 mL) ile takip karışımı filtre ve 100 mL tek-boyun yuvarlak alt şişesi toplamak.
    21. 400 mbar vakum basınç 40 oC., rotary Evaporatör kullanarak solvent buharlaşır
    22. DCM 2 ml silis yatağın üstüne ham ürün çözüm yükleyin. Sütun ve toplamak kesirler olarak 5-10 mL toluen ve aseton (0-%20 aseton, toluen) karışımı ile elute.
    23. TLC, toluen/aseton ile Geliştirme tarafından toplanan kesirler izlemek (7/3).
    24. İstenilen ürünler 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-almak için döner Buharlaştırıcı kullanarak kesirler içeren ürün buharlaşır O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl flor (2 adım üzerinden % 54) ve 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- Beyaz katı olarak 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl florür (2 adım üzerinden % 67).
    25. Ürün NMR ve kütle spektroskopisi (bkz: ek veri dosyası) tarafından karakterize.

2. Glycan 10 hazırlanması

  1. İntermidiate 7 hazırlanması
    1. Gümüş triflate (AgOTf) (0,039 g, 0,155 mmol) bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) ve (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 mmol) 25 mL tek-boyun yuvarlak alt şişesi tartmak, 30 dk için schlenk satır vakum altında kuru, kaldırmak vakum ve azot gazı ile doldurun.
    2. Taze kuru 4 Å moleküler elekler (0.2 g) içeren AgOTf ve Cp2HfCl2balonun aktarmak, a manyetik heyecan çubuğu ekleme, septum ile hemen kap ve bir azot balon ekleyin.
    3. 3 mL kuru toluen kuru cam şırınga ile balonun aktarın. Oda sıcaklığında 1 h için tepki karışımı ilave edin ve sonra 0 oiçin C. cool
    4. Donör 4 (Şekil 2, 0.043 g, 0,046 mmol) ve alıcısı 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) çözeltisi enjekte carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (şekil 3, 0,045 g, 0,031 mmol) 3 mL toluen şişeye 10 mL 0 kullanarak septum ile içine o C. 3 h için oda sıcaklığında tepki karışımı ilave edin.
    5. TLC tüketim malzemeleri başlayan gösterir sonra (DCM/aseton ile (8.5/1.5) geliştirme ve 254 Absorbans UV tarafından görüntülenmesi TLC, nm veya bir çözüm Isıtma tarafından takip Seryum amonyum molibdat ile boyama tarafından), reaksiyon enjeksiyon 10 tarafından gidermek triethyl Amin karşılıkları.
    6. Bir CELITE yatak aracılığıyla moleküler elekler yuvarlak popolu bir 50 mL şişe filtre ve daha fazla 10 mL Etil asetat ile yıkayın. Sulu NaHCO3 (2 x 20 mL) 50 mL HCI'yi huni doymuş çözeltisi ile kombine organik katmanları ayıklayın. Etil asetat (3 x 15 mL) sulu katmanla ayıklayın.
    7. Doymuş NaCl çözüm (5 mL) ile kombine organik katmanları ayıklamak, susuz Magnezyum sülfat kullanarak kuru, Magnezyum sülfat, Etil asetat (3 x 15 mL) ile yıkayın kaldırıp filtrate yuvarlak popolu bir 100 mL şişe içinde toplamak için karışımı filtre.
    8. 240 mbar vakum basınç 40 oC., rotary Evaporatör kullanarak solvent buharlaşır
    9. Silis yatak sütun üstüne DCM yılında ham ürün çözüm yükleyin. DCM ve aseton (0-%10 aseton DCM içinde) içeren bir karışımı ile sütun elute ve 5-10 mL kesirleri toplamak.
    10. TLC, DCM/aseton ile (8.5/1.5) geliştirme tarafından toplanan kesirler izlemek. İntermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[elde etmek için bir rotary Evaporatör kullanarak ürün içeren kesirleri buharlaşır 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranoside (0,052 g, % 70), beyaz köpük olarak.
    11. Ürün NMR ve kütle spektroskopisi (bkz: ek veri dosyası) tarafından karakterize.
  2. İntermidiate 8 hazırlanması
    1. Hexasaccharide 7 (şekil 3, 0.040 g, 0,016 mmol) 25 mL tek-boyun yuvarlak alt şişesi tartmak, 1 h için vakum altında kuru, vakum kaldırmak, azot gazı ile doldurmak, manyetik heyecan çubuğu eklemek ve kauçuk septum ile kap.
    2. Acetonitrile:methanol (MeOH) (2:1 oranında) 3 mL şişe aktarın.
    3. Pekleyin-toluen sülfonik asit monohidrat (0,001 g, 0,008 mmol) tepki şişesi ve heyecan 5 h için 800 rpm'de tepki.
    4. TLC tüketimi malzeme başlayan gösterir sonra (DCM/aseton ile (8.5/1.5) geliştirme ve 254 Absorbans UV tarafından görüntülenmesi TLC, nm veya bir çözüm Isıtma tarafından takip Seryum amonyum molibdat ile boyama tarafından), reaksiyon enjeksiyon 10 tarafından gidermek triethyl Amin karşılıkları.
    5. Rotary Evaporatör, 40 oC. 337 mbar vakum basınç kullanarak solvent buharlaşır
    6. Ham karışımı DCM yaklaşık 2 mL ile dağıtılması ve silis yatağın üstünde tepe-in yük.
    7. Sütun DCM ve aseton (DCM 0 - %10 aseton) karışımı ve 5-10 mL toplamak kesirler ile elute. TLC, DCM/aseton ile (8.5/1.5) geliştirme tarafından toplanan kesirler izlemek. Rotary Evaporatör 400 mbar vakum ve 40 oC. kullanma solvent buharlaşır
    8. Kalıntı ara 8, 5 vermek için düşük basınç altında kuru-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-asetil-4, 6-O-benzylidine-β - D - mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Şekil 3, 0,022 g, % 57) bir beyaz katı olarak. Ürün NMR ve kütle spektroskopisi (bkz: ek veri dosyası) tarafından karakterize.
  3. İntermidiate 9 hazırlanması
    1. İntermidiate 9 (şekil 3) hazırlanması donör 5 (0,015 g, 13.2 µmol) ve alıcısı 8 (şekil 3, 0,020 g, 8,80 µmol) kullanarak başarılı oldu.
    2. AgOTf (0.011 g, 44.1 µmol) ve Cp2HfCl2 (0.012 g, 30,8 µmol) bir promotors kullanılmıştır.
    3. 2.1.1-2.1.10 ara 9, 5 almak için adımları-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-3-d-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-3-d-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-3-d-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as beyaz köpük.
  4. İntermidiate küresel deprotection
    1. Bileşik 9 (0,010 g, 2.9 µmol) 25 mL tek-boyun yuvarlak alt şişesi tartmak, bir manyetik heyecan bar, bir lastik septum ile kap ekleyin ve bir azot balon ekleyebilirsiniz.
    2. 1, 2 mL transfer 4 dioxane: H2O (4:1) balonun içine. Lityum hidroksit (LiOH) (0.005 g, WT % 50 oranında) balonun ekleyin. 90-100 oC 12 h, reaksiyon karışımı ilave edin ve RT. soğumasını bekleyin
    3. Rotary Evaporatör kullanarak çözücüler buharlaşır ve şişeye 1 h için vakum altında kuru, azot ile doldurmak, vakum manifold kaldırmak ve kauçuk septum ile kap.
    4. 4 mL kuru pyridine ve 2 mL asetik anhidrit RT. 12 h için 0 oC. heyecan tepki karışımı bir 10 mL şırınga kullanarak septum ile balonun içine enjekte
    5. 0-10 mbar vakum basınç 50 oC., rotary Evaporatör kullanarak çözücüler buharlaşır
    6. DCM 30 mL kullanarak ham karışım dağıtılması ve doymuş sulu NaHCO3 (2 x 20 mL) 50 mL HCI'yi huni ile çözüm ayıklamak.
    7. DCM (3 x 15 mL) ile sulu katmanı yeniden ayıklayın. Rotary Evaporatör kullanarak solvent buharlaşır.
    8. Ürünün yaklaşık 2 mL DCM C18 silis yatağın üstüne, bir çözüm yükleyin. Metanol ve su karışımı ile sütun elute (0 - %100 su metanol) ve toplamak kesirler olarak 5-10 mL.
    9. Ürün kesirleri toplamak ve beyaz köpük olarak istenen ürün almak için düşük basınç altında buharlaşır.
    10. İçine kuru metanol alt şişesi yuvarlak 25 ml 5 mL ürün dağıtılması ve kauçuk septum ile kap.
    11. Sodyum methoxide (NaOMe) metanol ve serin 0.1 mL 0 obir buz banyosu kullanarak C aktarmak ve 12 h için karışımı ilave edin.
    12. Rotary Evaporatör kullanarak solvent kaldırmak ve yüksek vakum altında ürün kuru.
    13. 5 mL metanol de ham ürünlerinde dağıtılması: H2O: Asetik asit (6:3:1).
    14. Paladyum hidroksit (Pd(OH)2) eklemek (wt % 50) ve tepki için 15 h hidrojen balonu kullanarak hidrojen atmosfer altında ilave edin.
    15. Bir CELITE yatak ile reaksiyon filtre ve 2 mL dd su takip 2 mL metanol ile yıkayın.
    16. Rotary Evaporatör kullanarak çözücüler buharlaşır.
    17. Ham karışımı yaklaşık 1 mL su ile dağıtılması ve polyacrylamide jel yatağın üstünde tepe-in yük ( Tablo malzemelerigörmek). Ürün su ile elute ve 1-2 mL kesirleri toplamak.
    18. TLC tarafından toplanan kesirler izlemek için nile geliştirmek-butanol: H2O: Asetik asit (1:1:1).
    19. Ürün kesirleri toplamak ve almak istediğiniz ürün 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-(lyophilize α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a beyaz toz.
    20. Ürün NMR ve kütle spektroskopisi (bkz: ek veri dosyası) tarafından karakterize.

3. glukanlardir Phosphonic asit kuyruk19,22 ile hazırlanması

  1. 5 mL yuvarlak alt kabı içinde ilgili glycan (2-5 µmol) tartmak, manyetik heyecan çubuğu eklemek ve kauçuk septum ile kap.
  2. Taze kuru dimethylformamide 400 µL aktarın.
  3. Ekle [2 (2 (2 (BIS (benzyloxy) phosphoryl) ethoxyethoxy) etil (2, 5-dioxopyrrolidin1-yl) karbonat] (10-25 µmol, evde hazırlanan) glycan çözüm için. 5 h için 800 rpm'de karışımı ilave edin.
  4. 5-10 mbar vakum basınç 40 oC., rotary Evaporatör kullanarak çözücüler buharlaşır
  5. 0.5 mL su tepki karışımı dağıtılması ve yük polyacrylamide jel yatağın üst kısmında ( Tablo malzemelerigörmek). Su kullanarak ürün elute ve 1-2 mL kesirleri toplamak.
  6. Toplanan kesirler TLC26tarafından izlemek. Reaksiyon karışımı TLC tabağa spot ve 0.25 M Seryum amonyum molibdat leke çözümü ekleyin; Elektrikli Ocak kullanarak Isıtma tarafından izleyin. Kesirler içeren ürün toplamak ve bir beyaz toz olarak istenen ürün almak için lyophilize.
  7. 2 mL su üründe dağıtılması ve Pd (OH)2 (ağırlıkça % 50) ekleyin. Reaksiyon için 15 h hidrojen balonu kullanarak hidrojen atmosfer altında 800 rpm'de karıştırın.
  8. Reaksiyon akı kalsine yatak aracılığıyla filtre ve 2 mL distile de-iyonize su takip 2 mL metanol ile yıkayın. 300 mbar vakum basınç 40 oC., rotary Evaporatör kullanarak çözücüler buharlaşır
  9. Ham karışımı yaklaşık 1 mL su ile dağıtılması ve polyacrylamide jel yatağın üstünde tepe-in yük ( Tablo malzemelerigörmek).
  10. Ürün su ile elute ve 1-2 mL kesirleri toplamak. Toplanan kesirler TLC26tarafından izlemek. Kesirler lyophilize (sıvı nitrojen kullanarak ürün donma sonra yer lyophilizer bir vakum altında üzerinde) bir beyaz toz olarak istenen ürün almak için. NMR ve kütle spektroskopisi (bkz: ek veri dosyası) D2O bir çözücü kullanarak ürünleri karakterize.

4. Glycan dizi

  1. Hazırlık alüminyum kaplı cam slaytlar (ACG slayt) 19 , 20 , 22
    Not: İnce Film teknolojisi bölümü, enstrüman Teknoloji Araştırma Merkezi ve ulusal uygulamalı araştırma laboratuvarları, Hsinchu bilim Parkı, Tayvan alüminyum kaplı cam slaytlar imalatı yapıldı.
    1. Kaplamalı slaytlar topla, vakum-seal onları NAO oluşumunu önlemek ve tutmak için yüzey anodization elektrokimyasal reaksiyon kadar mühürlü.
  2. Alüminyum yüzey anodization kaplı cam slaytlar 19 , 20 , 22
    1. 4 ° C'de ısı kontrollü kuluçka ayarla 0,3 M oksalik asit sulu çözüm hazırlamak ve bir buz banyosu içinde saklayın. 500 mL kabı al, bir manyetik karıştırıcı çubuk eklemek.
    2. 0,3 M oksalik asit 500 mL kabı transfer ve 10 cm uzun Platin çubuk katot çözüm içine yerleştirin. (300 rpm) oksalik asit anodization sürecinde karıştırmaya devam edin.
    3. Laboratuvar izleme yazılımı açmak, tıkırtı "ayarla" düğmesini sonra "seçim süpürme gerilim çalışması." Başlangıç ayarlamak ve gerilim 25,8 V, puanlar 100, 1, uyum için durdurmak ve 1200 ms gecikme süpürme ve "Tamam."
    4. Alüminyum kaplı cam yüzü katot doğru bakacak şekilde kelepçe. "Çalışma testi" düğmesini tıklatın. Geçerli ölçüm (~ 8-10 mA) gözlemlemek.
    5. Yüzey anodization sonra slaydı Çift Kişilik distile su ile iyice yıkayın, azot gazı ile Kuru Temizleme ve sonra %30 bağıl nem odası daha fazla kullanım kadar saklayın.
  3. ACG imalat glycan Mikroarray 22
    1. Tüm monovalent glukanlardir (ı-XI) 100 µL etilen glikol 10 mM konsantrasyon, ayrı ayrı hazırlayın.
    2. Yukarıdaki glycan yazdırma arabelleği (% 80 etilen glikol ve % 20 de-iyonize su) ile 100 µM konsantrasyon yapmak oranında seyreltin.
    3. Hetero-ligand eğitim, bireysel ı-XI glukanlardir 5 µL hazırlamak ve her 5 µL adam5GlcNAc2 (1:1 oran) ekleyin.
    4. Robot tarafından baskı microarrays pin ( Tablo malzemelerigörmek) 0,6 birikimi ACG üzerine önceden hazırlanmış glukanlardir nL slaytlar31.
    5. Yazdırılmış slaytlar bağlama tahlil önce bir nem kontrollü kuru kutuda saklayın.
  4. HIV-1 geniş nötralize antikor PG9 glycan epitopları eşleme 22
    1. 1 mL bulunan BSA hazırlamak PBST arabellek, % 3 w/v.
    2. PG9 70 µL hazırlamak (50 µg/mL) içinde PBST tampon (BSA bulunan PBST arabellek, % 3 w/v).
    3. İkincil floresan etiketi antikor eşek Anti-insan IgG (Alexa Fluor Birleşik 647) 120 µL hazırlamak 50 µg/mL PBST tampon (BSA bulunan PBST arabellek, % 3 w/v) karanlıkta.
    4. Birincil antikor (PG9) ve ikincil floresan etiketi antikor 1:1 oranında (60 her µL) karıştırın. 4 ° C'de 30 dk premix antikor kuluçkaya
    5. ACG Slayt Slayt kuluçka odası hangi 16 kuyu bölünmüş içine yükleyin. Premix antikorların 100 µL glycan diziye aktarın ve 16 h için 4 ° C'de kuluçkaya.
    6. Damlalıklı premix antikorlar dışarı. Slayt kuluçka odası kaldırın.
    7. Slayt ilk PBST arabellekte yıkayın (PBS ve % 0.05 ara-20), de-iyonize su ve spin de 2.000 x g Kuru ardından.
    8. Mikrodizi görüntü analiz yazılımı açın (bkz. Tablo malzeme). Aşağı bakacak şekilde dizilmiş özelliklere sahip bir slayt ekleyin.
    9. Tıklayın "Ayarlar" menüsünden, piksel başına 5 mikron ve dalga boyu 635, görüntü çözünürlüğünü ayarlayın nm PMT450 ve güç % 100.
    10. Slayt görüntüleme başlatmak için "scan" butonuna basın.
    11. Tarama görüntü TIF biçiminde kaydetmek için "dosya" simgesini tıklatın.
    12. Görüntü analizi yazılım kullanım kılavuzu32takip ederek gerçekleştirmek.
    13. Floresans toplam yoğunluğunu hesaplamak ve görüntü işleme yazılımı33 kullanarak göstermektedir ( Tablo malzemelerigörmek).
      Not: Burada, tüm veri noktaları için ortalama yüzde hata hata çubukları tarafından sunulur.

Sonuçlar

N -glukanlardir geniş bir dizi sentezi için modüler bir kemoterapi enzimatik strateji şekil 1' de sunulmuştur. Çeşitlilik-ebilmek var olmak mahluk başında 3-Ey ve/veya 6-Ey α-özel mannosylation ardından üç önemli modüller kemoterapi enzimatik sentezi tarafından gerçeğine dayanarak stratejidir ortak mannoz kalıntısı konumunu N- glukanlardir trisaccharide çekirdek. İki, üç ve tetra antennary karmaþ?...

Tartışmalar

HIV-1 bNAbs PG9, PG16 ve PGTs 128, 141-145 dahil olmak üzere bir sınıf olduğunu bildirdi HIV-1 yalıtır dolaşan % 70-80 nötralize son derece güçlü olmak. Bu bNAbs epitopları tüm HIV-1 Grup M türevleri arasında son derece korunmuş, bu nedenle nötralize antikorlar23,24,25 temin bir HIV aşısı için etkili immunogen Tasarım Kılavuzu . HIV-1 geniş antikorları nötralize glycan epitopları tanımlamak için bizi...

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar ince Film teknolojisi bölümü, enstrüman Teknoloji Araştırma Merkezi (ITRC) ve ulusal uygulamalı araştırma laboratuvarları, Hsinchu bilim Parkı, Tayvan teşekkür ederiz. Bu eser Ulusal Bilim Konseyi tarafından desteklenmiştir (Hayır verin. ÇOĞU 105-0210-01-13-01) ve Academia Sinica.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Acetic acidSigma Aldrich64197
AcetonitrileSigma Aldrich75058
Acetic anhydrideSigma Aldrich108247
Anhydrous magnesium sulfateSigma Aldrich7487889
Boron trifluoride ethyl etherateSigma Aldrich109637
Bovine serum albuminSigma Aldrich9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamideBio-Rad1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichlorideSigma Aldrich12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milkSigma Aldrich48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins)Arrayit
Cerium ammonium molybdateTCIC1794
Cerium ammonium nitrateSigma Aldrich16774213
Clean glass slide Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acidSigma Aldrich3063716
Deuterated chloroformSigma Aldrich865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugatedJackson Immuno Research, USA709605098
DichloromethaneSigma Aldrich75092
Diethylaminosulfur trifluorideSigma Aldrich38078090
DimethylformamideSigma Aldrich68122
Ethyl acetateSigma Aldrich141786
Ethylene glycolAcros Organic107211
FAST frame slide incubation chambersSigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt Sigma Aldrich15839700
Lab tracer 2.0 software Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis)moleculardeviceswww.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing )GraphPad Software, Inchttp://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxideSigma Aldrich1310652
Manganese chlorideSigma Aldrich7773015
MethanolSigma Aldrich67561
N-butanolSigma Aldrich71363
Oxalic acidAcros Organic144627
Palladium hydroxideSigma Aldrich12135227
Phosphate Buffered SalineThermo Fisher Scientific 10010023
PyridineSigma Aldrich110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrateSigma Aldrich773476
Silver triflateSigma Aldrich2923286
Sodium bicarbonateSigma Aldrich144558
Sodium chlorideSigma Aldrich7647145
Sodium hydrogen carbonateSigma Aldrich144558
Sodium methoxide Sigma Aldrich124414
Sodium sulfateSigma Aldrich7757826
Toluene Sigma Aldrich108883
Tris buffer AmrescoN/AUltra-pure grade
Tween-20Amresco9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose)Sigma Aldrich137868521

Referanslar

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kimyasay 132kemoterapi enzimatik senteziACG glycan dizilerHIV antikorN glukanlardirn tralize profil olu turmamod ler yakla m zg ll k

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır