הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Summary

מאמר זה מדגים כיצד תרבות תודרנית לבנה השתילים בשטח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic מגבילה את הבסיס העיקרי ואת שערות השורש למישור אופטי יחיד. פלטפורמה זו יכולה לשמש עבור הדמיה אופטית בזמן אמת מורפולוגיה שורש בסדר גם באשר דימות ברזולוציה של באמצעים אחרים.

Abstract

שערות השורש להגדיל שטח הבסיס ספיגת מים טובה יותר, מזין הקליטה על ידי הצמח. כי הם קטנים בגודלם, לעיתים קרובות מטושטשים על ידי הסביבה הטבעית שלהם, מורפולוגיה שורש השיער ותפקוד הם קשה ללמוד לעיתים קרובות נשלל מן הצמח המחקר. בשנים האחרונות, פלטפורמות microfluidic הציעו דרך להמחיש מערכות שורשים ברזולוציה גבוהה מבלי להפריע את השורשים במהלך העברה אל מערכת הדמיה. פלטפורמת microfluidic הציג כאן בונה על מחקרים קודמים של הצמח על-גבי שבב על-ידי שילוב מכשיר דו שכבתי להגבלת השורש העיקרי תודרנית לבנה על אותו מישור אופטי כמו שערות השורש. עיצוב זה מאפשר כימות של שערות השורש על סלולרית ומונעת אברון רמה וגם ציר z נסחף בעת הוספת טיפולים ניסיוניים. אנו מתארים כיצד לאחסן את ההתקנים בסביבה כלולות, רטוב, ללא צורך משאבות fluidic, תוך שמירה על סביבה gnotobiotic שתיל. לאחר הניסוי דימות אופטי, ההתקן עשוי להיות רמקול ניתן לפירוק, משמש מצע כוח אטומי או סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים תוך שמירה על שורש בסדר מבנים שלמים.

Introduction

שורש בסדר תכונות להגדיל מים ורכישה התזונתי של הצמח, לחקור מקומות אדמה חדשה ואת הגדלת שטח הפנים הכולל שורש. המחזור של תכונות אלה שורש בסדר ממלאת תפקיד מרכזי ממריצה את שרשרת המזון הרכבת התחתית¹ , המספר של שורשים בסדר מיני צמחים מסוימים הוא צפוי להכפיל תחת דו תחמוצת הפחמן באטמוספירה מוגברות². שורשים בסדר בדרך כלל מוגדרים אלה קטן מ- 2 מ מ קוטר, אף על פי הגדרות חדשות דוגל אפיון שורשים בסדר על-ידי הפונקציה שלהם³. כמו שורשים משובחים רבים, שערות השורש לספק את הפונקציה של ספיגת וספיגה אך תופסים מקום קטן עם קטרים הסדר מיקרון. בשל גודלם הקטן, שערות השורש קשה התמונה ב באתרו , הם לעתים קרובות התעלמו כחלק של הארכיטקטורה הכוללת שורש ב שדה ניסויים בקנה מידה ומודלים.

אקס טרה שורש השיער לחקר, כגון החל בשתילים שגדלו על פלטות אגר, סיפקו את הקהילה המדעית עם מידע חשוב על צמיחה סלולרי, תחבורה^4,5. בעוד פלטות אגר מאפשרים מערכות שורשים לדימות גמישה, בזמן אמת, הם לא מציעים בקרה סביבתית גבוהה עבור התוספת של ניסיוני טיפולים כגון חומרים מזינים, הורמונים צמחיים או חיידקים. פתרון המתעוררים הקלת הדמיה ברזולוציה גבוהה תוך כדי גם מנקר דינמי הסביבתי היה הופעתו של פלטפורמות microfluidic ללימודי צמח. פלטפורמות אלה אפשרו את הצמיחה הרסניות והדמיה של מספר מיני צמחים עבור תפוקה גבוהה phenotyping^6,7,8,9, טיפולים כימיים מבודד ¹⁰כוח מדידות^11,12, התוספת של מיקרואורגניזמים¹³. Microfluidic פלטפורמה עיצובים התמקדו השימוש של שכבות fluidic יחיד שטח פתוח שבו השורשים עלול להפיץ, המתיר את שערות השורש להיסחף פנימה והחוצה במיקוד אופטי במהלך צמיחה או טיפול.

כאן אנו מציגים הליך לפיתוח פלטפורמה דו שכבתי microfluidic באמצעות צילום ושיטות רך-ליתוגרפיה בונה על תכנונים קודמים של הצמח על-גבי שבב על ידי כך שמניחים את השערות שורש שתיל למטוס הדמיה אותו כבסיס העיקרי. זה מאפשר לנו לעקוב אחר התפתחות שורש השיער בזמן אמת, ברזולוציה גבוהה, לאורך כל תהליך טיפול ניסיוני. השיטות culturing שלנו מאפשרים תודרנית לבנה השתילים להיות מונבטים מזרע בתוך הפלטפורמה, בתרבית במשך שבוע בסביבה רטוב וסטרילי שלא דורש שימוש ציוד משאבת מזרק. ברגע דימות הניסוי זמן לשגות הגיע למסקנה, ניתן לפתוח את הפלטפורמה המובאת כאן מבלי להפריע את המיקום של התכונות שורש עדינה יותר. פעולה זו מאפשרת את השימוש בשיטות הדמיה אחרות ברזולוציה גבוהה. כאן אנו מספקים תוצאות נציג כימות והדמיה של שורש השיער מורפולוגיה פלטפורמה זו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים, סריקה אופטית (SEM), כוח אטומי טכניקות במיקרוסקופ (AFM).

Protocol

1. דו שכבתי פלטפורמה פבריקציה נוספת

1. ייצור של מאסטרים מרובת שכבות
   1. ספין מעיל על בסיס אפוקסי photoresist שליליות (~63.45% מוצקים, 1,250 cSt) על פי מפרט היצרן (2,000 סל ד עבור 45 s) על גבי סיליקון בקוטר 4 אינץ רקיק כדי להשיג את הגובה הרצוי של 20 מיקרומטר על השכבה הראשונה של עיצוב.
   2. רך-אופים מוצרי קונדיטוריה להתנגד מצופה במשך 4 דקות ב- 95 מעלות צלזיוס. לאפשר וופל לקרר במשך 5 דק לחשוף כשהפחד לאור אולטרא סגול 15 s (~ 150 mJ/cm² -365 ננומטר) דרך photomask ב- UV פנה aligner להגדרת הגיאומטריה של השכבה התחתונה.
   3. לאחר חשיפה לאפות כשהפחד למשך 5 דקות ב 95 ° C. ללא פיתוח, תשואה כשהפחד coater ספין, ספין על שכבה נוספת של photoresist שלילי על בסיס אפוקסי (~76.75% מוצקים, 80,000 cSt) ב-3000 סל ד כדי להשיג גובה השכבה השנייה של 150-200 מיקרומטר.
   4. לאפשר כשהפחד לנוח במשך 5 דקות לפני העברת פלטה 95 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. לאחר האפייה על פלטת הבישול, להסיר כשהפחד ולאפשר את להתנגד מגניב, להקשיח בטמפרטורת החדר למשך עוד 5 דקות על משטח שטוח ברמה. ליישר ולחשוף את לחם הקודש photomask השכבה השנייה ב-30 s ב- aligner קשר UV (מנה של-300 mJ/cm²).
   5. לבצע את העוגות לאחר חשיפה על ידי הצבת את לחם הקודש על גזייה למשך 15 דקות ב 95 ° C ולאחר מכן אפשר כשהפחד להתקרר על משטח שטוח רמה במשך 5 דקות לפני פיתוח.
   6. לפתח שתי שכבות להתנגד בו זמנית על-ידי הצבת כשהפחד לתוך צלחת פלסטיק, השוקע כשהפחד במפתח המתאים (ראה טבלת חומרים). בעדינות רוק המנה מדי פעם כדי לשטוף את מפתח טריים מעל פרוסת סיליקון.
   7. אחרי 17 דקות, לשטוף את וופל עם אלכוהול איזופרופיל (IPA). אם סרט לבן מופיע, להמשיך לחזר בין שטיפה כשהפחד עם מפתח, IPA עד הסרט נעלם. יבש את פרוסות סיליקון בדוגמת עם חנקן.
2. Polydimethylsiloxane רך-ליתוגרפיה
   1. לחשוף את וופל סיליקון פלזמה אוויר ב-30 s בפלזמה מנקה להגדיר גבוה (ראה טבלת חומרים) כדי לנקות. Silanize כשהפחד עם טריכלורו (1H 1H, 2H, 2H-perfluoro-n-אוקטיל) silane בשכונה כימי על גזייה מתחת רחוק ממוקד של silane (85 ° C) במשך שעתיים.
   2. יוצקים 10:1 יחס של polydimethylsiloxane (PDMS) לסוכן ריפוי אל כשהפחד בסיס סיליקון. דגה את PDMS מעורב בתוך תא ואקום ולרפא ואז הפולימר בתנור 70 ° C 1 h או עד PDMS נרפאה לחלוטין.
   3. באמצעות אזמל, לחתוך את המכשירים PDMS ו לקלף אותן מן כשהפחד בסיס סיליקון. להשתמש אגרוף ביופסיה 1.5 מ מ כדי ליצור אינלטס זרע וטיפול, להכות את כניסת הזרע בזווית של 45° כדי לעודד צמיחה השורש לתוך התעלה הראשית.
   4. השתמש ברור דבק כדי הסרת לכלוך מהמכשיר PDMS ומניחים בצד עיצוב המכשיר למטה על coverslip זכוכית. אוטוקלב המכשירים מורכבים.

2. נטיעת התקנים

1. הכנת זרע תודרנית לבנה
   1. משטח לחטא לבנה א זרעים צינור microfuge עם פתרון של 30% זמינים מסחרית אקונומיקה בדילול ותחטא מיוננים מים ו- 0.1% X טריטון מינימלית 7 הזרעים שטיפת 4 פעמים עם מים סטריליים.
   2. Stratify זרעים על ידי קירור microfuge צינור למשך הלילה או עד שבוע ב 4 º C.
2. הכנת התקן
   1. למקם את התקנים סטיריליים ואקום degassing כדי להוציא אוויר מן הגז PDMS חדיר וערוצי fluidic כדי לשפר את הקלות של מילוי.
   2. להסיר את ההתקנים מן החדר ואקום ויציפו מיד את ההתקנים צלחת פטרי מלא עם נוזל מדיית צמחית ¼ כוח ב- pH 5.7.
   3. באמצעות פיפטה של, משוך נוזלי דרך פתחי הכניסה כדי למלא את המכשיר. ודא כי אין בועות אוויר יישאר בתוך ערוצי על ידי בדיקה חזותית.
   4. העברה התקנים אינדיווידואליים פטרי יבשה חדשה. יוצקים או פיפטה אגר חמה מסביב למכשיר עד רמת אגר כמעט מיושר עם החלק העליון של המכשיר PDMS. לאפשר אגר לגבש.
      הערה: התקנים עכשיו מוכנים לזריעה זרעים או שניתן לאחסן ב 4 ° C עד שהוא נדרש.
3. שתילת זרעים בתוך מכשירים
   1. בסביבה סטרילית, העברת זרע סטיריליים אחד לים של כל התקן באמצעות פיפטה קטן.
   2. כסו צלחת פטרי עם שעווה סרט (ראה טבלת חומרים) ומניחים תא לגידול אופניים/כהה או אדן החלון בטמפרטורת החדר. אוריינט הפטרי כך ההתקנים הם אנכי ותעודד הכבידה שורשים כדי לגדול דרך הערוץ.

3. טיפול

1. ניסיוני טיפולים
   1. בזמן הרצוי בפיתוח של שתיל, להוסיף את טיפול ניסיוני שתיל על-ידי הוספת כמות לפי מרשם של הטיפול לכל אחד הצד 8 יציאות באמצעות פיפטה.
   2. Reseal הפטרי ולחזור תא לגידול או על אדן החלון.
   3. להמשיך עם הדמיה דגימות בזמן הרצוי כדי ללכוד את נקודות זמן הפרט או להתחיל זמן לשגות הדמיה.

4. הדמיה אופטית

1. להוריד הדמיה ברזולוציה (4-20 X)
   1. מניחים את כל צלחת פטרי המכילות את המכשיר ואת שתיל תחת מיקרוסקופ שדה בהיר הפוך עבור שדה מוארים רזולוציה (4-20 X) נמוך או התערבות דיפרנציאלית ניגודיות (DIC) הדמיה. למטב את תנאי תאורה התירי תכוניות מורפולוגיות של עניין על-ידי התאמת פעמים חשיפה, המנורה בהירות, צמצם, את הקיטוב של אור. נסיעה על הבמה באזור הרצוי השורש ואת המיקוד על שורש או root hair(s) של עניין.
   2. רוכשים לנקודת זמן אחת או סדרה זמן של תמונות. כדי להמחיש את הצמיחה של שערות השורש, תמונה שערות השורש גדל פעם אחת בכל מין. כדי להמחיש את הצמיחה של השורש העיקרי, לרכוש תמונה אחת כל 30 דקות חזרה הפטרי את השתילים תא לגידול או על אדן החלון בצורה מאונכת השלמת ההדמיה.
2. הדמיה ברזולוציה (20-63 X) גבוה יותר
   1. לאחר שתיל גדל לזמן הרצוי, להשתמש מלקחיים כדי להסיר coverslip והתקן אגר. נקה מתחתית coverslip באמצעות רקמות מעבדה של אתנול שנרטבו.
   2. התקשורת טבילה המומלצת חלות על המטרה כפי שהוצע על ידי יצרן עדשות למיקרוסקופ. מניחים את coverslip למטה על הבמה מיקרוסקופ ולגדל לשלב ליצור קשר עם התקשורת טבילה על המטרה. מיטוב לתנאי התאורה על ידי התאמת פעמים חשיפה, המנורה בהירות, צמצם, את הקיטוב של אור. נסיעה על הבמה האזור הרצוי מבטיחות על root hair(s) של עניין.
      הערה: DIC יש צורך לדמיין cytoplasmic streaming, סמני פלורסצנטיות נדרשים כדי להמחיש אברון תנועה.
   3. כדי לכמת את צמיחת שורש השיער לאורך זמן, רוכשים תמונה אחת לכל מין. כדי להמחיש אברון תנועה, למזער את הזמן חשיפה פלורסצנטיות תוך שמירה על אות זיהוי קרינה פלואורסצנטית מ organelles. לרכוש תמונות של organelles הכי מהר זמן החשיפה מאפשרת. עוד זמן לשגות הדמיה, לשימוש במדגרה הבמה הדמיה של תאים חיים כדי לשמור על טמפרטורת הסביבה ולחות.
      הערה: מטרה שמן X 63 מומלצת הדמיה organelles שורש השיער.

5. הלא-הדמיה אופטית

1. הכנת התקן
   1. ברגע שתיל גדלה במשך הזמן הרצויים.

הסר את ההתקן ואת coverslip צלחת פטרי.

הפוך התקן, בעדינות לקלף את coverslip כך הבסיס נשאר בתוך התעלה PDMS.

המשך להשתמש בהתקן PDMS כמו מצע עבור בסיס כוח אטומי ברזולוציה גבוהה או מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה.

מיקרוסקופ אלקטרונים סורק

1. הפקדה של דק (~ 20 ננומטר) שכבה של כרום על גבי הבסיס, סביב PDMS באמצעות קרן אלקטרונים האקדח כפול אידוי התא.
2. העבר את השורש ואת המכשיר PDMS תא לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון.
   הערה: הדמיה תנאים, דהיינו מתח, המרחק הנוכחי ועובד יהיה צורך ניתן למטב כדי להשיג את הרזולוציה הרצויה עבור יישום מסוים.

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM)

1. הר PDMS התקן root בצד למעלה בקופסת הדגימה AFM. כדי להגדיל את החדות במצלמה ביתר קלות בין השורש PDMS, מקם את המכשיר PDMS על מצע רעיוני במול (כגון נציץ מצופה בזהב) לפני טעינת המכשיר את המחזיק הדגימה AFM.
2. לאבטח קובץ מצורף גם נוזלי על גבי המכשיר PDMS ולמלא את זה עם מים כדי לשמור את השורשים להתייבש במהלך דימות.
3. לטעון המחזיק הדגימה לתוך AFM. להתאים את z-הפקד על העובי של המכשיר PDMS ולנסוע הזיז לאזור של ריבית הבסיס בעזרת מצלמה להדרכה.
4. יישר את הלייזר עם קצה שלוחה. לקבלת התוצאות הטובות ביותר עם קשר במצב הדמיה, להשתמש cantilevers עם האביב קבועים של N/m 0.01 או 0.03 נקודות היכולת להפעיל כוח מינימלי על השורש במהלך סריקה.
5. הורידו לאט את מנגנון סריקה עד הזיז רק יוצר קשר עם הדוגמה. להתאים את גודל סריקה עבור האזור הרצוי ובחר מהירות סריקה של קו 1/s עם 256 נקודות מתח בכל שורה. רוכשים את הסריקה.

תוצאות

דו שכבתי PDMS microfluidic להתקנים המתוארים כאן יש 200 מיקרומטר גבוהה ערוץ בסיס תודרנית הראשי, תא גבוה 20 מיקרומטר להגבלת שערות השורש גדל רוחבית (איור 1 א'). עיצוב זה יכול לשמש עבור מיני צמחים עם קטרים שורש דומה כמו תודרנית לבנה , ניתן לשנות בקלות כדי להתאים מ...

Discussion

השיטה המתוארת במאמר זה ליצירת פלטפורמה צמח-על-שבב הוא ייחודי בכך דו שכבתי עיצוב וביתנו השערות שורש הדמיה מטוס בודד, פלטפורמת ייתכן מלונות־המלח ויש משמש מצע הדמיה לא אופטי ברזולוציה גבוהה . באמצעות הדמיה לא אופטי ברזולוציה גבוהה יכול לספק מידע רב ערך על רקמת הצמח כי לא היתה אפשרות לקבל מן ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System