JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makalede, ana kök ve kök tüyleri tek bir optik uçağı için confines bir iki katlı mikrosıvısal platformda Arabidopsis thaliana fidan kültür gösterilmiştir. Bu platform iyi kök morfolojisi de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gelince gerçek zamanlı optik görüntüleme için başka araçlar tarafından kullanılabilir.

Özet

Kök tüyleri daha iyi su alımı ve bitki besin emilimi için kök yüzey alanını artırır. Küçük boyutlu ve sık sık doğal çevreleri tarafından obscured oldukları için kök saç morfoloji ve işlev çalışmaya zor ve genellikle bitki araştırmaları dışında. Son yıllarda mikrosıvısal platformlar kök sistemleri yüksek çözünürlükte görüntüleme sistemine aktarımı sırasında kökleri bozmadan görselleştirmek için bir yol teklifinde bulundular. Önceki bitki-on-a-chip araştırma burada sunulan yapılar Arabidopsis thaliana ana kök kök tüyleri olarak aynı optik uçağa sınırlamak için bir iki katlı aygıt dahil ederek mikrosıvısal platformu. Bu tasarım bir cep üzerinde kök tüyler miktar etkinleştirir ve organel düzeyde ve aynı zamanda deneysel tedaviler eklenmesi sırasında sürüklenen z ekseni engeller. Belgili tanımlık aygıt ezelî belgili tanımlık lüzum için Akışkan pompalar, fide için bir gnotobiotic ortamı korurken bir içerilen ve sulu ortamda saklamak açıklanmıştır. Optik görüntüleme deneyden sonra aygıtın demonte ve Atomik kuvvet veya elektron mikroskobu tarama iyi kök yapıları olduğu gibi tutmak için bir substrat kullanılır.

Giriş

İyi kök özellikleri su ve besin alımı için yeni toprak alanlarda keşfetmek ve toplam kök yüzey alanı artan tesisi, artış. Bu iyi kök özellikler ciro yeraltı gıda zinciri1 uyarıcı bir önemli rol oynar ve iyi bazı bitki türleri kökleri beklenen yüksek atmosferik karbon dioksit altında çift2sayısıdır. Her ne kadar iyi kökleri onların işlevi3tarafından karakterize için yeni tanımları savunucusu iyi kökleri genellikle olanlar kadar 2 mm çapında, daha küçük tanımlanır. Gibi pek çok iyi kökleri, kök tüyleri alımı ve emme işlevi sağlar, ancak mikron sırasına fan çapı daha küçük bir yer işgal. Kendi küçük boyutu nedeniyle kök kılları için görüntü içinde situ zordur ve genellikle alan ölçekli deneyler ve modelleri genel kök mimarisinde bir parçası olarak gözden.

Terra ex kök saç çalışmalar, böyle Ağar kaplamalar üzerinde yetiştirilen Fideler itibaren bilimsel topluluk ile hücresel büyüme ve taşıma4,5değerli bilgiler sağladı. Ağar kaplamalar kök sistemleri dönüşlü ve gerçek zamanlı olarak yansıması için izin verirken, besin, bitki hormonları veya bakteri gibi deneysel tedaviler eklenmesi için yüksek çevre denetim sunmuyoruz. Ayrıca dinamik çevre denetim saglayan sırasında yüksek kararlılık düşsel kolaylaştırmak için gelişmekte olan bir çözüm mikrosıvısal platformlar bitki araştırmaları gelişiyle oldu. Bu platformlar tahribatsız büyüme ve yüksek işlem hacmi fenotipleme6,7,8,9, izole kimyasal tedaviler için birkaç bitki türlerinin görselleştirme etkinleştirdikten 10, kuvvet ölçümleri11,12ve mikroorganizmaların13eklenmesi. Mikrosıvısal platformu tasarımlar tek açık alan sıvı katmanlar içinde kökleri, büyüme veya tedavi sırasında içinde ve dışında optik odak kayması için kılı kök erişimine izin verme yaymak kullanımı odaklı olması.

Burada ana root olarak aynı görüntüleme uçağa fide kök tüyleri hapsetmesi tarafından önceki bitki-on-a-chip tasarımlar inşa fotoğraf ve yumuşak Taş baskı yöntemlerini kullanarak bir iki katlı mikrosıvısal platform geliştirmek için bir yordam mevcut. Bu kök saç geliştirme gerçek zamanlı, yüksek çözünürlükte ve deneysel bir tedavi süreci boyunca izlemek için bize izin verir. Bizim kodlamayla yöntemler içinde belgili tanımlık peron ve kültürlü için şırınga pompa ekipman kullanımı gerektirmez sulu ve steril bir ortamda bir haftaya kadar tohumdan germinated Arabidopsis thaliana fidan olanak sağlar. Bir kez sahip olduğu zaman hata görüntüleme deneyi, burada sunulan platformu ince kök özellikleri konumunu bozmadan açılabilir. Bu diğer yüksek çözünürlükte görüntüleme yöntemlerinin kullanımı sağlar. Burada biz temsilcisi sonuçları miktar ve kök saç Morfoloji bu platformda görselleştirme için optik, tarama elektron mikroskobu (SEM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) teknikleri sağlar.

Protokol

1. iki katlı Platform imalat

  1. Çok katmanlı masters imalatı
    1. Spin kat epoksi esaslı negatif fotorezist (~63.45% katı, 1250 cSt) üreticinin belirtimlerine göre (2000 rpm için 45 s) üzerine 20 µm ilk tasarım katman için istediğiniz yüksekliği elde etmek için 4 inç çapında silikon gofret.
    2. Yumuşak-resist kaplı gofret için 95 ° C'de 4 dk pişir Gofret 5 dk. ortaya çıkarmak için UV ışık için 15 için gofret soğutmak izin s (~ 150 mJ/cm2 365 nm) aligner alt tabaka geometrisini tanımlamak için bir UV bir photomask aracılığıyla ulaşın.
    3. Sonrası pozlama fırında 95 ° C'de 5 min için gofret Geliştirme olmadan, gofret spin coater ve spin için negatif fotorezist epoksi esaslı ikinci bir katman üzerinde dönmek (~76.75% katı, 80.000 cSt) 150-200 µm ikinci katman yüksekliği elde etmek için 3000 devirde.
    4. Gofret için 5 dk 45 dk için 95 ° C Pinar aktarmadan önce dinlenmek izin verir. Ocağın üzerinde pişirme sonra gofret kaldırmak ve serin ve düz yüzeyin üzerinde başka bir 5 min için oda sıcaklığında sertleşmesine resist sağlar. Hizalayın ve gofret için 30 ikinci katman photomask maruz bir UV kişi aligner (yaklaşık 300 mJ/cm2doz) s.
    5. Sonrası pozlama fırında yanında duvar ilanı gofret 95 ° C'de 15 dakika bir ocağın üzerinde gerçekleştirmek ve gofret düz yüzeyin 5 min için üzerinde geliştirme önce soğumasını bekleyin.
    6. Her iki resist katmanı aynı anda gofret bir plastik tabak içine yerleştirip uygun geliştirici gofret batış geliştirmek ( Malzeme tabloyabakın). Yavaşça zaman zaman taze geliştirici üzerinde gofret yıkamak için çanak rock.
    7. 17 dk sonra gofret isopropanol (IPA) ile yıkayın. Beyaz bir film filmin kaybolana kadar gofret geliştirici ve IPA ile durulama arasında yinelemek görünürse. Desenli silikon gofret azot ile kuru.
  2. Polydimethylsiloxane yumuşak-litografi
    1. Bir hava plazma 30 için silikon gofret maruz yüksek üzerinde küme s bir plazma temizleyici (temizlemek için malzemeler tablo bkz:). Silanize ile trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfloro-n-Oktil) silane 2 h için silane (85 ° C) parlama noktası aşağıda bir ocağın üzerinde kimyasal başlıklı gofret.
    2. Polydimethylsiloxane (PDMS) 10:1 oranında kür Ajan silicon ana gofret üzerine dökün. Bir vakum odasında karışık PDMS degas ve polimer bir 70 ° C fırında PDMS tamamen tedavi kadar veya 1 h için tedavi.
    3. Bir neşter kullanarak PDMS aygıtlar kesmek ve onları silikon ana gofret soyma. 1.5 mm biyopsi yumruk tohum giriş ana kanal içine kök büyümesini teşvik için bir 45 ° açıyla Delme tohum ve tedavi girişleri oluşturmak için kullanın.
    4. Açık yapışkan bant kullanmak enkaz PDMS aygıttan kaldırmak ve aygıt tasarım yan cam coverslip yerleştirin. Otoklav monte cihazlar.

2. dikim aygıtları

  1. Arabidopsis thaliana tohum hazırlama
    1. Yüzey A. thaliana tohum bir microfuge tüp bir çözüm de-iyonize su ve % 0.1 Triton X deterjan 7 dk. yıkama tohumları 4 kez steril su ile seyreltilmiş % 30 piyasada bulunan çamaşır suyu ile sterilize.
    2. Gecede veya bir hafta 4 ° C'de microfuge tüp soğutucu tarafından tohum tabakalaşmak
  2. Aygıt hazırlama
    1. Bir vakum odası gaz havayı çıkarmak için gaz giderme sterilize cihazları yerleştirmek geçirgen PDMS ve sıvı kanallarını dolum kolaylığı geliştirmek için.
    2. Aygıtları vakum odası ve hemen sıvı ¼ güç bitki esaslı ortam pH 5.7 ile dolu bir petri aygıtlardan daldırın.
    3. Bir pipet kullanarak, sıvı cihazın doldurmak için giriş çek. Tarafından görsel denetim içinde kanalların hiçbir hava kabarcıkları kalır emin olun.
    4. Bireysel cihazlar için yeni kuru Petri yemekler aktarımı. Pour veya pipet sıcak agar agar düzeyi PDMS cihazın üst ile hemen hemen aynı hizada olana aygıt çevresinde. Agar kuvvetlendirmek izin.
      Not: Aygıtları artık tohum dikim için hazırsınız veya ihtiyaç kadar 4 ° C de saklanabilir.
  3. Cihazlar içinde tohum Ekim
    1. Steril bir ortamda bir steril tohum küçük bir pipet kullanarak her aygıt koya aktarın.
    2. Kapak balmumu ile Petri kabına ( Malzeme tabloyabakın) film ve açık/koyu Bisiklete binme büyüme odası veya pencere oda sıcaklığında yerleştirin. Petri kabına dikey aygıtlardır ve yerçekimi kökleri kanalı ile büyümeye teşvik edecek gelecek şekilde yönlendirin.

3. tedavi

  1. Deneysel tedaviler
    1. Fide'nın gelişiminde istediðiniz saatte deneysel tedavi fide için tedavi reçete miktarı her pipet ile 8 yan bağlantı noktaları ekleyerek.
    2. Petri kabına yeniden mühürlemek ve büyüme odası veya pencere geri dönün.
    3. Bireysel zaman noktaları yakalamak veya zaman atlamalı görüntüleme başlamak için istediğiniz saatte örnekleri Imaging ile devam edin.

4. optik görüntüleme

  1. Düşük çözünürlük (4-20 X) görüntüleme
    1. Aygıt ve daha düşük çözünürlük (4-20 X) parlak alan veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) görüntüleme için bir ters parlak alan mikroskop altında fide içeren tüm Petri kabına yerleştirin. Pozlama süreleri, lamba parlaklık, diyafram ve ışık polarizasyonu ayarlayarak ilgi Morfolojik özellikleri aydınlatmak için ışık koşulları en iyi duruma getirme. Sahne alanı için kök ve odak alanı istenen sürücü kök veya ilgi root hair(s) üzerinde.
    2. Bir seferinde noktası veya bir zaman dizi resmi elde etmek. Kök saç büyüme görselleştirmek için en az bir kez başına büyüyen kök tüyleri görüntü. Ana kök gelişimini görselleştirmek için görüntüleme tamamlandıktan sonra bir görüntü her 30 dk. dönüş Petri kabına ve büyüme odası veya pencere dikey pozisyonda fidan elde.
  2. Daha yüksek çözünürlük (20-63 X) görüntüleme
    1. Fide istenen vakit geçirmek için büyüdü sonra forseps coverslip ve aygıt agar kaldırmak için kullanabilirsiniz. Bir ıslak etanol laboratuvar doku kullanarak coverslip alt temiz.
    2. Önerilen daldırma medya hedef mikroskop objektif üreticisi tarafından önerilen olarak uygulanır. Coverslip mikroskop Sahne Alanı'nda yerleştirin ve amaç üzerinde daldırma medya iletişim aşaması yükseltmek. Aydınlatma koşulları pozlama süreleri, lamba parlaklık, diyafram ve ışık polarizasyonu ayarlayarak en iyi duruma getirme. Sahne alanı üzerinde ilgi root hair(s) istenilen bölgeye ve odak için sürücü.
      Not: DIC sitoplazmik akış görselleştirmek için gereklidir ve floresan işaretleri organel hareket görselleştirmek için ihtiyaç vardır.
    3. Kök tüylerin zamanla ölçmek için min başına bir görüntü elde etmek. Organel hareket görselleştirmek için organelleri tanımlanabilir Floresans sinyalini koruyarak Floresans maruz kalma süresini en aza indirmek. Organelleri görüntülerini hızlı çekim hızı sağlar elde etmek. Artık bu zaman hata görüntüleme için ortam sıcaklığı ve nem korumak için bir canlı hücre görüntüleme sahne kuluçka makinesi kullanın.
      Not: 63 X Petrol amaç görüntüleme kök saç organelleri için önerilir.

5. sigara-optik görüntüleme

  1. Aygıt hazırlama
    1. Bir kez fide için istediğiniz zaman büyüdü,
aygıt ve coverslip Petri kabına kaldırın.
  • Aygıt ters çevirin ve kök PDMS kanal içinde kalır ki soyma yavaşça uzakta coverslip.
  • İçin daha yüksek çözünürlük Atomik kuvvet veya tarama elektron mikroskobu kökünden bir substrat PDMS aygıtı kullanmaya devam edin.
  • Elektron mikroskobu tarama
    1. İnce bir depozito (~ 20 nm) kök ve bir çift silah elektron ışını buharlaşma odası kullanarak PDMS çevreleyen krom tabakasının.
    2. Kök ve PDMS aygıt bir Taramalı elektron mikroskobu odasına aktar.
      Not: Görüntüleme koşulları, Yani gerilim, geçerli ve çalışma mesafe belirli bir uygulama için istediğiniz çözünürlüğü elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir.
  • Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM)
    1. Bir AFM numune sahibi PDMS aygıt kök yan binin. Kamera kontrastı arttırmak ve kök PDMS daha kolay ayırt etmek için AFM numune tutucu üzerinde cihaz montaj önce düz yansıtıcı yüzey (örneğin Mika altın kaplı) PDMS aygıtta yerleştirin.
    2. Bir sıvı iyi eki PDMS aygıt üstünde güvenli ve görüntüleme sırasında sulu kökleri tutmak için su ile doldurun.
    3. Numune tutucu AFM yükleyin. Z-Denetim için PDMS cihazın kalınlığını ayarlamak ve konsol rehberlik için bir kamera ile kök faiz bölgeye sür.
    4. Lazer konsol ucu ile hizalayın. En iyi sonuçları elde etmek için kişi modunu görüntüleme, tarama sırasında kök en az kuvvet sarfetmek 0.01 veya 0,03 N/m bahar sabitleriyle cantilevers kullanın.
    5. Yavaşça indirin tarama mekanizması kadar konsol sadece örnek ile temas. İstenen bölge için tarama boyutu ayarlamak ve 1 satır/s her satıra 256 gerilim puanla tarama hızını seçin. Tarama elde etmek.

    • Sonuçlar

    Burada açıklanan iki katlı PDMS mikrosıvısal cihazları ana Arabidopsis kök ve yanal büyüyen kök tüyleri (şekil 1A) sınırlamak için bir 20 µm yüksek odası için 200 µm yüksek kanal var. Bu tasarım için bitki türleri benzer kök çapı Arabidopsis thaliana kullanılabilir ve kolayca türler farklı boyutlarda. içerecek şekilde değişiklik Tasarım bir giriş bitki için yanı sıra istenen herhangi bir kimyas...

    Tartışmalar

    İki katmanlı tasarım sınırları tek bir görüntüleme uçağı ve platform için kök tüyleri deconstructed ve yüksek çözünürlüklü olmayan optik görüntüleme için bir substrat kullanılan bir bitki-on-a-chip platformu oluşturmak için bu makalede açıklanan yöntemi benzersizdir . Yüksek çözünürlüklü optik Imaging'i kullanma optik görüntüleme üzerinden tek başına elde edilemedi bitki doku hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Örneğin, AFM görüntüleme geliştirme sırasında veya ...

    Açıklamalar

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Teşekkürler

    Bu el yazması UT-Battelle, LLC altında Sözleşme No tarafından kaleme ABD Enerji Bakanlığı ile DE-AC05-00OR22725. Amerika Birleşik Devletleri hükümeti korur ve Yayımcı, yayın, makale kabul ederek Amerika Birleşik Devletleri hükümeti yayımlamak veya yayımlanmış form üretmek için münhasır olmayan, Odenmis, geri alınamaz, dünya çapında lisans korur onaylar Bu makale, veya bunu, Amerika Birleşik Devletleri hükümeti amaçlar için başkalarına izin verme. Enerji Bakanlığı'nın araştırma Federal projeleri DOE kamu erişim planı (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) uygun olarak bu sonuçları kamu erişim sağlayacak.

    Bu eser kısmen genomik bilim programı, ABD Enerji Bakanlığı, Office bilim, biyolojik ve çevresel araştırma, bitki mikrop arabirimleri bilimsel odak alanını (http://pmi.ornl.gov) bir parçası olarak tarafından desteklenmiştir. Mikrosıvısal platformlar imalatı Nanofabrication araştırma laboratuvarında Merkezi Nanophase malzeme bilimleri için bir DOE ofis, bilim kullanıcı tesis olan gerçekleştirilmiştir. JAA bir NSF yüksek lisans araştırma bursu DGE-1452154 tarafından desteklenmektedir

    Malzemeler

    NameCompanyCatalog NumberComments
    Silicon WaferWRS Materials100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
    Quintel Contact AlignerNeutronix Quintel CorpNXQ 7500 Mask Aligner
    Fluorescent MicroscopeNikonEclipse Ti-U
    laboratory tissueKimberly ClarkKimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
    Negative Photoresist EpoxyMicrochemSU-8 2000s series
    Photoresist developerMicrochemSu-8 developer
    trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silaneSigma Aldrichuse in chemical hood
    Air Plasma CleanerHarrick Plasma
    PDMSDow CorningSylgard 184 Silicone elastomer base
    PDMS curing agentDow CorningSylgard 184 Silicone elastomer curing agent
    DessicatorBel-ArtF42010-000
    ScalpelX-acto knife
    Biopsy PunchTed Pella15110-15
    Adhesive tapeStaplesInvisible Tape
    Microfuge tubeEppendorf
    Triton XJ.T.Baker XI98-07
    BleachChloroxconcentrated
    Plant-Based MediaPhyto Technology LaboratoriesM524
    AgarTeknovaA7777
    Wax filmParafilm
    microscopeOlympusIX51
    Atomic Force MicroscopeKeysight Technologies5500 PicoPlus AFM
    Petri dishVWR
    Scanning Electron MicroscopeJEOL7400
    Dual Gun Electron Beam EvaporatorThermionicsCustom Dual Electron Gun Evaporation System

    Referanslar

    1. Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
    2. Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
    3. McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
    4. Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
    5. Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
    6. Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
    7. Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
    8. Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
    9. Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
    10. Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
    11. Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
    12. Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
    13. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
    14. Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
    15. Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
    16. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
    17. Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
    18. Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
    19. Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).

    Yeniden Basımlar ve İzinler

    Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

    Izin talebi

    Daha Fazla Makale Keşfet

    Biyom hendisliksay 126k klerihavacilikbitki on a chipArabidopsis thalianak k saSEMAFMorganely ksek z n rl klg r nt lemetedavi

    This article has been published

    Video Coming Soon

    JoVE Logo

    Gizlilik

    Kullanım Şartları

    İlkeler

    Bize Ulaşın

    KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

    JoVE HABER BÜLTENLERİ

    Araştırma

    Eğitim

    Yazarlar

    Kütüphaneciler

    JoVE Hakkında

    Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır