Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform

Zusammenfassung

Dieser Artikel veranschaulicht, wie Arabidopsis Thaliana Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform Kultur, die die Hauptwurzel und Wurzelhaare zu einer optischen Ebene beschränkt. Diese Plattform kann für Echtzeit-optische Bildgebung der feinen Wurzel Morphologie als auch für hochauflösende Bildgebung mit anderen Mitteln verwendet werden.

Zusammenfassung

Wurzelhaare erhöhen Wurzel Oberfläche für bessere Wasseraufnahme und Nährstoffaufnahme durch die Pflanzen. Weil sie klein und oft verdeckt von ihrer natürlichen Umgebung sind, sind Wurzelhaare Morphologie und Funktion schwer zu studieren und Pflanzenforschung oft ausgeschlossen. In den letzten Jahren haben mikrofluidischen Plattformen eine Möglichkeit, Wurzelsysteme mit hoher Auflösung sichtbar zu machen, ohne die Wurzeln zu stören, während der Übertragung um ein bildgebendes System angeboten. Mikrofluidischen Plattform präsentiert hier baut auf bisherigen Anlage-on-a-Chip-Forschung, durch den Einbau einer Zweischicht-Gerät um die Arabidopsis Thaliana Hauptwurzel, die gleichen optischen Ebene als die Wurzelhaare beschränken. Dieses Design ermöglicht die Quantifizierung der Wurzelhaare auf ein Handy und Organelle Ebene und auch verhindert, dass z-Achse treiben während der Zugabe von experimentellen Behandlungen. Wir beschreiben, wie die Geräte in einer geschlossenen und hydratisiert Umgebung, ohne die Notwendigkeit für fluidische Pumpen, unter Beibehaltung einer gnotobiotischen Umgebung für den Keimling zu speichern. Nach dem optischen Bildgebung Experiment werden das Gerät zerlegt und als Substrat für Rasterkraftmikroskop oder Rasterelektronenmikroskopie während feine Wurzel Strukturen intakt zu halten verwendet.

Einleitung

Feine Wurzel Funktionen erhöhen Wasser und Nährstoff Erwerb für die Pflanze neue Erde Räume zu erforschen und Vergrößerung der Oberfläche total Wurzel. Der Umsatz dieser feinen Wurzel Funktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Stimulierung der unterirdischen Nahrungskette¹ und die Anzahl der Feinwurzeln in bestimmten Pflanzenarten ist unter erhöhten atmosphärischen Kohlendioxyd verdoppeln². Feinwurzeln sind in der Regel als jene kleiner als 2 mm im Durchmesser, definiert, obwohl neue Definitionen für die Charakterisierung von Feinwurzeln durch ihre Funktion³befürworten. Wie viele Feinwurzeln Wurzelhaare erfüllen die Funktion der Aufnahme und Absorption aber einen viel kleineren Raum mit Durchmessern in der Größenordnung von Mikrometern zu besetzen. Aufgrund ihrer geringen Größe Wurzelhaare sind schwer zu Bild in Situ und werden oft als Teil der Gesamtarchitektur der Wurzel im Feld Skalierung Experimente und Modelle übersehen.

Ex-Terra Wurzelhaare Studien, z. B. Sämlinge auf Agarplatten gewachsen, haben hat die wissenschaftliche Gemeinschaft mit wertvollen Informationen auf Zellwachstum und Transport^4,5. Während Agarplatten Wurzelsysteme, zerstörungsfrei und in Echtzeit abgebildet werden können, bieten sie nicht hohe Umweltkontrolle für den Zusatz von experimentellen Behandlungen wie Nährstoffe, Pflanzenhormone oder Bakterien. Eine neue Lösung für hochauflösende Bildgebung, wobei jedoch auch dynamische Umwelt Kontrolle erleichtern seit dem Aufkommen von mikrofluidischen Plattformen für Pflanze Studien. Diese Plattformen haben die nicht-destruktive Wachstum und Visualisierung von mehreren Pflanzenarten für hohen Durchsatz Phänotypisierung^6,7,8,9, isolierte chemische Behandlungen ermöglicht. ¹⁰, Force Messungen^11,12, und die Zugabe von Mikroorganismen¹³. Mikrofluidischen Plattform Entwürfe konzentrierten sich auf die Verwendung von einzelnen Freifläche fluidische Schichten, in denen die Wurzeln ausbreiten können, erlaubt die Wurzelhaare, ein-und optischen Schwerpunkt während des Wachstums oder Behandlung zu treiben.

Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Entwicklung einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform mit Foto und Soft-Lithografie-Methoden, die auf früheren Pflanze-on-a-Chip-Designs durch die Beschränkung der Sämling Wurzelhaare, die gleichen Abbildungsebene als die Hauptwurzel aufbaut. Dies ermöglicht es uns, Wurzelhaare Entwicklung in Echtzeit, mit hoher Auflösung und Verlauf der experimentellen Behandlung zu verfolgen. Unsere Kultivierung Methoden ermöglichen Arabidopsis Thaliana Sämlinge gekeimt werden aus Samen innerhalb der Plattform und kultivierten für bis zu einer Woche in einer hydratisiert und sterile Umgebung, die nicht die Verwendung von Spritze Pumpe Ausrüstung erfordert. Einmal das Zeitraffer Image Experiment abgeschlossen hat, kann die hier vorgestellten Plattform geöffnet werden, ohne zu stören die Position der feineren Wurzel Merkmale. Dies ermöglicht die Verwendung von anderen hochauflösenden bildgebenden Verfahren. Hier bieten wir repräsentative Ergebnisse für die Quantifizierung und Visualisierung der Wurzelhaare Morphologie in dieser Plattform durch optische, Scan-Elektronen-Mikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskop Mikroskopiertechniken (AFM).

Protokoll

(1) Zweischicht-Plattform Fertigung

1. Herstellung von mehrschichtigen Meister
   1. Spin Beschichtung Epoxy-basierte negativer Photoresist (~63.45% Feststoffe, 1.250 cSt) nach den Vorgaben des Herstellers (2.000 u/min für 45 s) auf einen 4-Zoll-Durchmesser Siliziumwafer, die gewünschte Höhe von 20 µm für die erste Design-Schicht zu erhalten.
   2. Soft-Backen der Fotolack beschichtete Wafer für 4 min bei 95 ° C. Erlauben Wafer Abkühlen für 5 min. aussetzen den Wafer mit UV-Licht für 15 s (~ 150 mJ/cm² bei 365 nm) über einer Fotomaske in einer UV kontaktieren Aligner um die Geometrie der untersten Ebene zu definieren.
   3. Nach Exposition den Wafer für 5 min bei 95 ° c Backen Ohne zu entwickeln, die Wafer zu Spin Coater und Spin auf eine zweite Schicht Epoxy-basierte negativer Photoresist zurück (~76.75% Feststoffe, 80.000 cSt) bei 3.000 u/min, eine zweite Schichthöhe von 150-200 µm zu erreichen.
   4. Lassen Sie die Wafer vor der Übertragung an eine Herdplatte 95 ° C für 45 min. 5 min ruhen. Nach dem Backen auf der Herdplatte entfernen des Wafers und der Resist abkühlen und härtet bei Raumtemperatur für weitere 5 Minuten auf einer flachen, Ebenen Oberfläche. Ausrichten und aussetzen den Wafer, die zweite Schicht Fotomaske für 30 s in einer UV-Kontakt-Aligner (Dosis von etwa 300 mJ/cm²).
   5. Führen Sie eine Post-Exposition Backen indem der Wafer auf eine Herdplatte für 15 min bei 95 ° C, und lassen Sie die Wafer auf einer flachen, Ebenen Oberfläche für 5 min abkühlen, bevor Sie zu entwickeln.
   6. Beide Resist-Schichten gleichzeitig zu entwickeln, indem der Wafer in einer Plastikschale und Eintauchen des Wafers in die entsprechenden Entwickler (siehe Materialtabelle). Schütteln Sie das Gericht gelegentlich um frische Entwickler über den Wafer zu waschen.
   7. Nach 17 min Spülen des Wafers mit Isopropanol (IPA). Wenn ein weißer Film angezeigt wird, weiterhin durchlaufen zwischen den Wafer mit Entwickler und IPA spülen, bis der Film verschwindet. Trocknen Sie die gemusterten Silizium-Wafer mit Stickstoff.
2. Polydimethylsiloxan Soft-Lithographie
   1. Aussetzen der Silizium-Wafer, ein Luft-Plasma für 30 s in einem Plasma Reiniger hoch angesetzt (siehe Materialtabelle) zu reinigen. Silanize der Wafer mit Silan Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-n-Octyl) in einem chemischen Haube auf einer Heizplatte unter dem Flammpunkt von Silan (85 ° C) für 2 h.
   2. Gießen Sie ein 10:1-Verhältnis von Polydimethylsiloxan (PDMS), Härtemittel auf master Siliziumwafer. Entgasen Sie der gemischten PDMS in einer Vakuumkammer und dann heilen Sie das Polymer in einem 70 ° C Ofen für 1 h oder bis die PDMS vollständig ausgehärtet ist.
   3. Mit einem Skalpell schneiden die PDMS-Geräte und schälen von Meister Siliziumwafer. Verwenden Sie einen 1,5 mm-Biopsie-Punch um Saatgut und Behandlung Buchten, Stanzen Samen Einlauf im 45° Winkel zum Wurzelwachstum in den Hauptkanal fördern erstellen.
   4. Verwenden Sie klare Klebeband zu entfernen Fremdkörper aus dem PDMS-Gerät und der Gerät-Design-Seite nach unten auf ein Glas Deckglas. Autoklaven der montierten Geräte.

2. Anbau Geräte

1. Arabidopsis Thaliana Saatgutvorbereitung
   1. Oberfläche zu sterilisieren A. Thaliana Samen in einem Microfuge Rohr mit einer Lösung aus 30 % handelsübliche Bleichmittel in deionisiertes Wasser und 0,1 % Triton X-Reinigungsmittel für 7 min. Waschen Samen 4 Mal mit sterilem Wasser verdünnt.
   2. Samen von Microfuge Röhre kühl, über Nacht oder bis zu einer Woche bei 4 ° c zu Schichten
2. Gerät-Vorbereitung
   1. Stellen Sie sterilisierte Geräte in einem Vakuum-Entgasung Kammer um Luft aus dem Gas zu entfernen durchlässig PDMS und fluidische Kanäle, einfache Füllung zu verbessern.
   2. Entfernen Sie die Geräte aus der Vakuumkammer und sofort Tauchen Sie die Geräte in einer Petrischale gefüllt mit ¼ Kraft pflanzlicher Basis Flüssigmedien bei pH 5,7.
   3. Durchziehen Sie Flüssigkeit mit einer Pipette, die Buchten um das Gerät zu füllen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in Kanälen durch Sichtkontrolle bleiben.
   4. Übertragen Sie einzelne Geräte auf neue trockene Petrischalen. Gießen oder Pipette heißen Agar rund um das Gerät bis die Agar-Ebene ist fast bündig mit der Oberseite des Geräts PDMS. Lassen Sie Agar, erstarren.
      Hinweis: Geräte sind nun bereit für die Saat oder bei 4 ° C bis benötigt gespeichert werden können.
3. Saat in Geräten
   1. Übertragen Sie in einer sterilen Umgebung einen sterilisierte Samen auf den Einlass von jedem Gerät mit einer kleinen Pipette.
   2. Abdeckung der Petrischale mit Wachs (siehe Materialtabelle) und legen Sie in eine hell/dunkel Radfahren Wachstum Kammer oder Fensterbank bei Raumtemperatur. Ausrichten der Petrischale, sodass die Geräte senkrecht sind und Schwerkraft die Wurzeln fördert wachsen durch den Kanal.

3. Behandlung

1. Experimentelle Behandlungen
   1. Zum gewünschten Zeitpunkt in der Entwicklung der Keimling fügen Sie die experimentelle Behandlung des Keimlings indem eine vorgeschriebene Menge der Behandlung zu jedem der 8 Seite Ports per Pipette hinzu.
   2. Versiegeln der Petrischale und Rückkehr zum Wachstum Kammer oder Fensterbank.
   3. Fahren Sie fort mit imaging-Proben zum gewünschten Zeitpunkt zu einzelnen Zeitpunkten zu erfassen oder Zeit verfallen Bildgebung zu beginnen.

4. optische Bildgebung

1. Niedriger Auflösung (4-20 X)
   1. Legen Sie die gesamte Petrischale mit dem Gerät und der Keimling unter einem invertierten Hellfeld-Mikroskop für niedrigere Auflösung (4-20 X) Hellfeld oder differential Interferenz Kontrast (DIC) Bildgebung. Optimierung der Lichtverhältnisse zu morphologischen Merkmale von Interesse zu erhellen, Belichtungszeiten, Lampenhelligkeit, Blende und die Polarität des Lichts anpassen. Fahren Sie die Etappe auf den gewünschten Bereich des Root "und" Fokus im Stamm oder der Root hair(s) von Interesse.
   2. Erwerben Sie einen einzigen Zeitpunkt oder einer Zeitreihe von Bildern. Um das Wachstum der Wurzelhaare visualisieren, Bild wachsenden Wurzelhaare einmal pro Minute. Visualisieren Sie das Wachstum der Hauptwurzel, erwerben ein Bild alle 30 min. Rückkehr der Petrischale und die Sämlinge zu Wachstum Kammer oder Fensterbank in senkrechter Position nach dem Imaging ist abgeschlossen.
2. Höhere Auflösung (20-63 X) Bildgebung
   1. Der Keimling für eine gewünschte Zeit geworden ist, verwenden Sie Zange, um Deckglas und Gerät aus dem Agar zu entfernen. Reinigen Sie den unteren Rand des Deckglases mit einem Ethanol benetzt Labor Gewebe.
   2. Gelten Sie die empfohlene eintauchen-Medien für das Ziel entsprechend dem Vorschlag der Mikroskop-Objektiv-Hersteller. Legen Sie das Deckglas auf den Mikroskoptisch und erhöhen Sie die Bühne, um auf das Ziel der Immersion Medienkontakt. Optimieren Sie die Lichtverhältnisse, Belichtungszeiten, Lampenhelligkeit, Blende und die Polarität des Lichts anpassen. Fahren Sie der Bühne auf das gewünschte Gebiet und Fokus auf Root hair(s) von Interesse.
      Hinweis: DIC musste zytoplasmatischen streaming zu visualisieren, und Fluoreszenz Markierungen sind erforderlich, um Organelle Bewegung sichtbar zu machen.
   3. Quantifizierung der Wurzelhaare Wachstum im Laufe der Zeit ein Bild pro min zu erwerben. Um Organelle Bewegung zu visualisieren, minimieren Sie die Fluoreszenz Belichtungszeit Beibehaltung einer identifizierbaren Fluoreszenzsignal aus der Organellen. Erwerben Sie so schnell wie die Belichtungszeit erlaubt Bilder von den Organellen. Verwenden Sie für mehr Zeitraffer Aufnahmen einen live-Cell imaging Bühne Inkubator, um Umgebungstemperatur und Feuchtigkeit zu erhalten.
      Hinweis: Ein 63 X Öl Ziel empfiehlt sich für bildgebende Wurzelhaare Organellen.

5. nicht-optische Bildgebung

1. Gerät-Vorbereitung
   1. Sämling zur gewünschten Zeit geworden ist,

Entfernen Sie das Gerät und Deckglas der Petrischale.

Umdrehen Sie Gerät und ziehen Sie sanft das Deckglas, so dass die Wurzel in der PDMS-Kanal bleibt.

Fahren Sie mit das PDMS-Gerät als Substrat für die Wurzel in höherer Auflösung Rasterkraftmikroskop oder Rasterelektronenmikroskopie verwenden.

Rasterelektronenmikroskopie

1. Hinterlegung einer dünnen (~ 20 nm) Schicht aus Chrom auf die Wurzel und die umliegenden PDMS mit einer Dual Pistole Electron Beam Verdunstungskammer.
2. Übertragen Sie die Wurzel und PDMS-Gerät zu einer Raster-Elektronenmikroskop Kammer.
   Hinweis: Imaging-Bedingungen, d.h. Spannung, aktuelle und Arbeitsbedingungen Abstand müssen optimiert werden, um die gewünschte Auflösung für eine bestimmte Anwendung zu erreichen.

Rasterkraftmikroskopie (AFM)

1. Die Wurzelseite PDMS Gerät oben auf ein AFM Probenhalter anbringen. Kontrast in der Kamera zu erhöhen und leichter unterscheiden die Wurzel aus dem PDMS, platzieren Sie das PDMS-Gerät auf einem flachen reflektierenden Untergrund (z. B. Glimmer in Gold beschichtet) vor der Montage des Gerätes auf die AFM-Probenhalter.
2. Sichern Sie eine flüssige gut Befestigung auf der Oberseite der PDMS-Gerätes zu und füllen Sie es mit Wasser, die Wurzeln während der Bildgebung hydratisiert zu halten.
3. Laden Sie in der AFM Probenhalter. Einstellen Sie Z-Regler für die Dicke der PDMS-Gerät und befahren Sie die Wurzel mit einer Kamera zur Orientierung der Cantilever in die Region von Interesse.
4. Richten Sie den Laser mit der Spitze des Nadelträgers. Verwenden Sie für optimale Ergebnisse mit Kontakt-Modus Bildgebung Kragarme mit Federkonstanten von 0,01 bis 0,03 N/m, minimale Kraft auf die Wurzel während des Scannens ausüben.
5. Senken Sie langsam die Scannen-Mechanismus bis der Cantilever nur nimmt Kontakt mit der Probe. Passen Sie die Scangröße für die gewünschte Region und wählen Sie eine Scangeschwindigkeit von 1 Zeile/s mit 256 Spannung Punkte pro Zeile. Den Scan zu erwerben.

Ergebnisse

Die hier beschriebenen Zweischicht-PDMS mikrofluidischen Geräte haben einen 200 µm hohen Kanal für die Hauptwurzel Arabidopsis und einer 20 µm hohe Kammer, seitlich wachsenden Wurzelhaare (Abbildung 1A) zu beschränken. Dieses Design darf für Pflanzenarten mit ähnlicher Wurzel Durchmessern wie Arabidopsis Thaliana und kann leicht geändert werden, um Platz für Arten in verschiedenen Größen. Das Design beinhaltet einen Einla...

Diskussion

Schaffung einer Pflanze-on-a-Chip-Plattform in diesem Artikel beschriebene Verfahren ist einzigartig, da die Zweischicht-design Grenzen der Wurzelhaare zum einzigen Abbildungsebene und der Plattform dekonstruiert und als Substrat für nichtoptische hochauflösende Bildgebung verwendet werden . Mit hoher Auflösung nicht optische Bildgebung bieten wertvolle Informationen über das Pflanzengewebe, die aus optischen Bildgebung allein nicht erreicht werden konnten. Zum Beispiel bieten AFM Bildgebung Kraftmessungen um die Ela...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Wafer	WRS Materials	100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
Quintel Contact Aligner	Neutronix Quintel Corp	NXQ 7500 Mask Aligner
Fluorescent Microscope	Nikon	Eclipse Ti-U
laboratory tissue	Kimberly Clark	Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
Negative Photoresist Epoxy	Microchem	SU-8 2000s series
Photoresist developer	Microchem	Su-8 developer
trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane	Sigma Aldrich		use in chemical hood
Air Plasma Cleaner	Harrick Plasma
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer base
PDMS curing agent	Dow Corning	Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
Dessicator	Bel-Art	F42010-000
Scalpel	X-acto knife
Biopsy Punch	Ted Pella	15110-15
Adhesive tape	Staples	Invisible Tape
Microfuge tube	Eppendorf
Triton X	J.T.Baker XI98-07
Bleach	Chlorox	concentrated
Plant-Based Media	Phyto Technology Laboratories	M524
Agar	Teknova	A7777
Wax film	Parafilm
microscope	Olympus	IX51
Atomic Force Microscope	Keysight Technologies	5500 PicoPlus AFM
Petri dish	VWR
Scanning Electron Microscope	JEOL	7400
Dual Gun Electron Beam Evaporator	Thermionics	Custom Dual Electron Gun Evaporation System