ניצול של קפסולות עבור מכתים שלילי של דגימות ויראלי בתוך Biocontainment

Summary

פרוטוקול זה מספק הוראה עבור דגימות וירוס מכתים שלילי אשר יכול בקלות לשמש במעבדות BSL-2, -3, -4 או -4. הוא כולל את השימוש בקפסולה עיבוד חדשנית, אשר מגן על רשת אלקטרונים שידור מיקרוסקופיה ומספק למשתמש טיפול קל יותר בסביבות סוערות יותר בתוך biocontainment.

Abstract

מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) משמש כדי לבחון את התשתית של וירוסים ופתוגנים פתולוגיים אחרים עם רזולוציה ננומטר. רוב החומרים הביולוגיים אינם מכילים אלמנטים צפופים המסוגלים לפזר אלקטרונים כדי ליצור תמונה; לכן, כתם שלילי, אשר מציב מלחי מתכת כבדים צפופים סביב המדגם, נדרש. כדי לדמיין וירוסים ההשעיה תחת TEM הם חייבים להיות מיושמים על רשתות קטנות מצופה משטח שקוף רק ננומטר עבה. בשל גודלם הקטן שבריריות, רשתות אלה קשה להתמודד בקלות עברו זרמי אוויר. משטח דק פגום בקלות, משאיר את המדגם קשה או בלתי אפשרי התמונה. וירוסים זיהומיים חייבים להיות מטופלים בארון biosafety (BSC) וחלקם דורשים סביבה מעבדה biocontainment. וירוסים מכתים ברמות biosafety (BSL) -3 ו -4 הוא מאתגר במיוחד כי סביבות אלה הם יותר סוערים טכנאים נדרשיםO ללבוש ציוד מגן אישי (PPE), אשר מקטין מיומנות.

במחקר זה, הערכנו מכשיר חדש כדי לסייע בוירוס מכתים שלילי biocontainment. המכשיר הוא כמוסה שפועלת כמו טיפ פיפטה מיוחדים. לאחר הרשתות נטענות לתוך הקפסולה, המשתמש פשוט שואף ריאגנטים לתוך הקפסולה כדי לספק את הנגיף ואת הכתמים לרשת encapsulated, ובכך ביטול טיפול המשתמש של רשתות. למרות טכניקה זו תוכננה במיוחד לשימוש BSL-3 או -4 biocontainment, זה יכול להקל על הכנת המדגם בכל סביבת מעבדה על ידי הפעלת מכתים שלילי קל של הנגיף. שיטה זו יכולה גם להיות מיושם להכין דגימות TEM שלילי מוכתם של חלקיקים, מקרומולקולות ודגימות דומות.

Introduction

מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) הוא כלי יעיל לצפייה מורפולוגיה ו ultrastructure של דגימות ביולוגיות כי הם קטנים מדי כדי להיראות עם מיקרוסקופ אור מסורתי ^{1 , 2 , 3 , 4} . TEMs לירות electrons דרך דגימה דקה מאוד לייצר תמונה ברזולוציה גבוהה כמו האלקטרונים יש אורך גל קצר בהרבה מאשר אור. אזורים של המדגם כי לכופף או לחסום אלקטרונים מופיעים כהה, ואילו אזורים כי הם אלקטרונים lucent מופיעים לבן.

חוסר חומר צפוף אלקטרונים עושה וירוסים קשה להציג תחת TEM כי הם לא יכולים לפזר אלקטרונים. מכתים שלילי היא השיטה הנפוצה ביותר המשמש ליצור ניגודיות וירוסים עם נוף TEM. ההליך הראשון של מכתים שלילי הוצע על ידי ברנר ו הורן בשנת 1959, מבוסס על ניסוי שבו הול (1955) ו Huxley (1957)נראה את המראה של מבנים ביולוגיים בניגוד הפוך כאשר שקוע בחומר צפוף אלקטרונים ⁵ . תהליך של מכתים שלילי כבר כמעט ללא שינוי במהלך חצי המאה האחרונה. מכתים שלילי כרוך בקצרה יישום פתרון מלח מתכת כבד מדגם ברשת TEM בניסיון להקיף את הנגיף עם חומר צפוף ללא חדירת הנגיף ⁶ . זה יוצר גבול כהה חושף את הצורה של החלקיקים ⁵ . מחקר זה משתמש בשני ריאגנטים עבור מכתים שליליים, אורניל אצטט (UA) וחומצה phosphotungstic אשלגן (PTA). שני כתמים אלה משמשים בדרך כלל כתם שלילי דגימות ביולוגיות קטנות, כגון וירוסים, קומפלקסים חלבונים, וחלקיקים ^{7 , 8 , 9} .

הטכניקה קונבנציונאלי שלילי מכתים הוא טיפה ידנית שלילית מכתים טק⁷ . שיטה זו דורשת טיפול מדויק של קטנים, שברירי רשתות TEM עם מלקחיים ליישם כמויות קטנות של מדגם וירוסים, כתם, שטיפות. פרוטוקול הכנה טיפוסי כרוך החלת טיפת ההשעיה מדגם על פני השטח של רשת מצופה TEM הסרט ( איור 1 א ). לאחר ההתקשרות של המדגם למשטח הסרט, הרשת שטופה כדי להסיר וירוסים שאינם דביקים ומוכתמים עם UA או PTA למשך כמה שניות עד דקה, בהתאם לסוג המדגם. עודף נוזלים הוא מרושע מן הרשת על ידי נגיעה פיסת נייר סינון לקצה הרשת.

השיטה ידנית טיפות דורש כל רשת להיות בנפרד. אם לא מטופלים בזהירות, רשתות TEM מצופה נקב בקלות, כפוף, או מזוהמים. עיבוד דגימות מרובות יכול להוביל קשיים במעקב אחר הרשתות ולהבטיח מכתים עקביים עבור כל מדגם. הליך זה מכתים ידני הוא הרבה יותר דכאשר הוא מתבצע במעבדות ביו-בטיחותיות (BSL) -3 ו -4 ביו-מעבדות, בשל ציוד המגן האישי הנדרש (PPE) הנדרש עבור סביבות אלה. PPE הוא מסורבל הסביבה biocontainment הרבה יותר סוער לעומת מעבדה רגילה. כוח אדם העובד במעבדות Biocontainment BSL-3 נדרש ללבוש 2 זוגות של כפפות ולעבוד בארון biosafety (BSC). שכבה כפולה של כפפות מפחית רגישות מישוש ומגביל התנועה המנועית בסדר. זרימת האוויר של BSC כי מגן על המשתמש ומסייע במניעת זיהום מדגם יכול לגרום דגימות וכתמים להתייבש מהר מדי ובכך להשפיע על איכות הכתם. זרימת האוויר הסוערת חזקה ב BSC יכול גם לפוצץ במהירות את הרשת כי הוא לא מאובטח היטב. במעבדות ביו-שכבת BSL-4 קיימות דרישות בטיחות נוספות. כוח אדם נדרש ללבוש חליפת לחץ חיובית, אשר מגבילה עוד יותר תנועה פיזית ואת היכולת לראות בבירור וללכתUle רשתות. הטכנאי העובד ב BSL-4 לובש לפחות 2 זוגות כפפות, כאשר הצמד החיצוני הוא כפפה עבה אשר מקטינה באופן משמעותי את המיומנות ואת תחושת המישוש. לבסוף, מלקחיים המשמשים להתמודד עם רשתות TEM חדים, ובכך מהווה סיכון לטכנאי בשל יכולתם לנקב כפפות. עם כמוסות המכילות רשתות, מלקחיים הם לא הכרחי, ובכך לספק בטוח, מלקחיים ללא אלטרנטיבה עבור מניפולציה רשתות biocontainment. לבסוף, כמוסות גם לספק דרך יעילה לאחסן רשתות במהלך עיבוד, אודיום אדי טיהור, ובמהלך אחסון; ובכך לשמור על רשתות מאורגן ובטוח מפני נזק.

בדו"ח זה, אנו מציגים שיטה חדשה עבור רשתות מכתים שליליות של TEM במעבדות biocontainment כי מנצל mPrep / g כמוסות, מכשיר מבוסס על הקפסולה לטיפול ברשת מכתים ^{10 , 11 , 12} . הקפסולה מתאימהModates שתי רשתות TEM, ממזער טיפול ישיר, ומקטין את פוטנציאל נזק לרשת. הקפסולה מייחסת ישירות פיפטה אחת או רב באותו אופן כמו קצה פיפטה, המאפשר יישום של נוזלים שונים לרשת הכלולה. זה מאפשר הכנה סימולטנית של דגימות מרובות עם רשתות כפולות ( איור 1 ב ). כתם שלילי עם כמוסות המדגם וירוס הוא aspirated לתוך הקפסולה והחזיק במשך 10 דקות לתת וירוסים adsorb על פני הרשת. הרשתות עם וירוסים adsorbed נשטפים לאחר מכן עם מים deionized (dI) ומוכתמים או UA או PTA במשך כמה שניות עד 1 דקות. תהליך זה עושה שימוש באותו פרוטוקול צעדים ריאגנטים כמו שיטת טיפות ידני; ההבדל הוא שכל העבודה מתרחשת בתוך הקפסולה ללא טיפול פיזי של הרשתות. ( תרשימים 1C , 1D ).

מטרת המחקר הייתה להעריך כמוסותשיטה חדשה מכתים שלילי של דגימות וירוס בסביבות biocontainment. מחקר זה בחן גם את איכות תמונות TEM המיוצר משני הליכים שונים של מניעת הנגיף: 1) איון מהיר, עם 1% אדי tetroxide אוסמיום, ו 2) 24 שעות inactivation עם glutaraldehyde 2%. שניהם נערכו באמצעות הכמוסות. לבסוף, הערכנו שני כתמים שליליים נפוצים, UA ו- PTA, לשימוש בקפסולה. ¹³

Protocol

1. ניסוי הכנה בסביבת BSL-2 לפני עבודה עם דוגמאות וירוסים

1. הכן או לרכוש Formvar ופחמן מצופים TEM רשתות נחושת, בדרך כלל 200-400 רשת.
2. הכנס את רשתות TEM מצופה לתוך כמוסות.
   1. השתמש בעדשה מוגדלת כדי להפוך את התהליך הזה קל לביצוע. רשת אחת או שתיים ניתן להכניס לתוך כל כמוסה. טרום טעון קפסולות ניתן לרכוש כדי לבטל את שלב זה אם תרצה.
3. מעבירים את הכמוסות עם רשתות TEM מצופה מוכנס, יחד עם חומרים אחרים ריאגנטים, כדי biocontainment שבו הווירוסים יהיו מוכתמים שלילית.

2. שיטת הקפסולה עבור מכתים שלילי Biocontainment באמצעות Glutaraldehyde מימית ו 1% אוסמיום Tetroxide אדי איטום

1. בתוך biocontainment BSC, לשאוב 40 μL ההשעיה וירוס לתוך הקפסולה המצורפת פיפטה.
   הערה: פיפטה נשאר מחובר thE כמוסה עד להשלמת התהליך. הכנת וירוסים היא על פי הפרסום הקודם שלנו ¹⁴ .
2. מניחים את פיפטה בצד שלה במשך 10 דקות עם רשתות בכיוון אופקי. זה כדי לקדם הפצה אפילו של חלקיקי הנגיף על גבי רשתות מצופים.
3. לנטרל את הנגיף בתוך הקפסולה בתוך bococontainment BSC.
   1. להרים את פיפטה ו לדכא את הבוכנה כדי לוותר על פתרון וירוס לתוך מיכל פסולת.
   2. לשאוב 40 μL של מקבע glutaraldehyde 2% לתוך כמוסות.
      זהירות: Glutaraldehyde הוא כימי מסוכנת דורש הגנה מתאימה. Glutaraldehyde ניתן להשתמש בתקופות קצרות ב BSC נורמלי, אבל מגיב פתוח מורחב דורש לעבוד BSC צינור או כיבוי קטר כימי.
   3. מניחים את פיפטה על הצד שלה במשך 20 דקות. זה כדי להבטיח דגימות הם קבועים היטב.
   4. לגרש את מקבע לשאוב 40 μL של מים dI לתוך כמוסות wאפר משם מקבע. חזור על צעד זה לשטוף עבור סך של 3 מחזורי שטיפה.
4. לשאוב 40 μL של 1% uranyl אצטט (UA) או 1% אשלגן חומצה phosphotungstic (PTA) לתוך כמוסות ולאפשר לשבת במשך 30 שניות.
   הערה: זמן הכתמה עשוי להשתנות מ 10 שניות עד 1 דקות מבוסס על מדגם וירוס.
   זהירות: UA הוא פולט אלפא, ורעל מצטבר. לטפל בו עם הגנה מתאימה.
5. הסר את הקפסולה מן פיפטה כתם לייבש את הרשתות על ידי נגיעה פיסת נייר סינון לקצה של רשתות בעוד רשתות להישאר בתוך הקפסולה.
6. אוסמומי Tetroxide אדי תהליך איטום.
   1. מניחים את הקפסולה, עם מכסה פתוח, לתוך צינור 50 צנטריפוגה מ"ל המכיל נייר מסנן ספוג תמיסת tetroxide אוסמיום 1%.
      זהירות: tetroxide אוסמיום הוא רעיל מאוד עם לחץ אדים נמוך. זה חייב לשמש BSC צינור או כימיים קטר כיפה. לטפל בו עם הגנה מתאימה. פרסם אזהרהמידע בתחום העבודה.
   2. חותם צינור 50 מ"ל צנטריפוגות עבור 1 שעות כדי לאפשר חדירה מלאה של אדי tetroxide אוסמיום. לאחר מכן, לאחר מכן לטהר ולהעביר את הצינור מתוך biocontainment למתקן BSL-2 EM.
7. הסר רשתות EM מן הקפסולה.
   1. במתקן BSL-2 EM, להסיר את הקפסולה מצינור צנטריפוגות ומניחים אותו על פיפטה.
   2. לשאוב 40 μL של מים dI לתוך הקפסולה ולהחלק את המים לתוך מיכל פסולת שלוש פעמים.
   3. הסר את הקפסולה מן פיפטה כתם לייבש את הרשתות באמצעות נייר סינון לגעת בקצה הרשתות.
   4. לאחר ייבוש האוויר, לאחסן את הרשתות עבור הדמיה TEM לאחר מכן.

3. שיטת הקפסולה עבור איטום בביו-שכנוע עם Glutaraldehyde 2%, ואחריו מכתים שלילי במעבדה BSL-2

1. נוהל וירוסים.
   1. בתוך bococainainment Bioc, לערבב את ההשעיה וירוס היטב עם נפח זהה של glutaraldehyde 4% כדי להשיג ריכוז סופי של glutaraldehyde 2%.
      זהירות: Glutaraldehyde הוא כימי מסוכנת דורש הגנה מתאימה. Glutaraldehyde ניתן להשתמש בתקופות קצרות ב BSC נורמלי, אבל מגיב פתוח מורחב דורש לעבוד BSC צינור או כיבוי קטר כימי.
   2. להשבית וירוסים עם מקבע עבור מינימום של 24 שעות לפני האריזה, טיהור, ולהעביר אותו למתקן BSL-2 EM.
2. במתקן BSL-2 EM, לשאוב את הנגיף תערובת מקבע לתוך הקפסולה, המכיל שתי רשתות TEM, מחובר פיפטה.
3. מניחים את פיפטה אופקית במשך 10 דקות עם רשתות בכיוון אופקי.
   הערה: זה כדי לקדם הפצה אפילו של חלקיקי הנגיף על גבי רשתות TEM.
4. לאסוף את פיפטה ו לדכא את הבוכנה כדי לגרש את הנגיף למיכל פסולת. לשאוב 40 μL של dIמים לתוך הקפסולות ולגרש אותו לתוך מיכל פסולת במשך 3 מחזורי שטיפה.
5. לשאוב 40 μL של או 1% UA או 1% PTA לתוך כמוסות במשך 30 s.
   הערה: זמן מכתים השתנה מ 10 שניות עד 1 דקות על סמך מדגם וירוס.
   זהירות: UA הוא פולט אלפא, ורעל מצטבר. לטפל בו עם הגנה מתאימה.
6. הסר את הקפסולה מן פיפטה כתם לייבש את הרשתות על ידי נגיעה בקצה הרשתות כדי פיסת נייר הסינון. האוויר יבש רשתות ולאחסן אותם עבור הדמיה TEM הבאים.

תוצאות

שיטת הקפסולה לייצר מכתים שלילי באיכות טובה עבור הדמיה TEM:

ראשית, הערכנו את איכות התמונות שנוצרו על ידי שימוש הן שיטת טיפה ידני ושיטות כמוסה עבור מכתים שלילי ebolavirus זאיר. Ebolaviruses הם חברים של Filoviridae...

Discussion

מכתים שלילית היא טכניקה TEM יקר להערכת ו אומדת וירוסים, קומפלקסים חלבונים וחלקיקים. הכנה דגימה של דגימות אלה על ידי הזזת ידני של רשתות מגיב לכתמים שליליים כבר פרוטוקול קלאסי במשך יותר מחצי מאה. זהו תהליך פשוט, אך דורש מומחיות שנרכשו באמצעות הכשרה להשלמה מוצלחת. מכתים ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM