Использование капсул для отрицательного окрашивания вирусных образцов в области биологического обогащения

Резюме

В этом протоколе содержится инструкция для образцов отрицательного окрашивания вирусов, которые могут быть легко использованы в лабораториях BSL-2, -3 или -4. Он включает в себя использование инновационной капсулы для обработки, которая защищает сетку электронной микроскопии трансмиссии и обеспечивает удобство работы пользователя в более бурных средах в рамках биоконцентрации.

Аннотация

Передаточная электронная микроскопия (TEM) используется для наблюдения ультраструктуры вирусов и других микробных патогенов с нанометровым разрешением. Большинство биологических материалов не содержат плотных элементов, способных рассеивать электроны для создания изображения; Поэтому требуется отрицательное пятно, которое помещает плотные соли тяжелых металлов вокруг образца. Чтобы визуализировать вирусы в суспензии под ТЕМ, их следует наносить на небольшие сетки, покрытые прозрачной поверхностью толщиной всего нанометров. Из-за их небольшого размера и хрупкости эти решетки трудно обрабатывать и легко перемещать воздушными потоками. Тонкая поверхность легко повреждается, оставляя образец трудным или невозможным для изображения. Инфекционные вирусы должны быть обработаны в шкафу для биобезопасности (BSC), а некоторые требуют лабораторной среды для биоконцентрации. Окрашивание вирусов на уровнях биобезопасности (BSL) -3 и -4 особенно сложно, поскольку эти среды более бурные и требуются технические специалисты tO носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), что снижает ловкость.

В этом исследовании мы оценили новое устройство, помогающее отрицательным окрашивающим вирусам в биоконцентрации. Устройство представляет собой капсулу, которая работает как специализированный наконечник пипетки. Когда сетки загружаются в капсулу, пользователь просто отсасывает реагенты в капсулу, чтобы доставлять вирус и пятна в инкапсулированную сетку, тем самым устраняя обработку пользователем сеток. Хотя этот метод был разработан специально для использования в биологическом обогащении BSL-3 или -4, он может облегчить подготовку проб в любой лабораторной среде, обеспечивая легкое отрицательное окрашивание вируса. Этот же метод может быть также применен для получения отрицательно окрашенных образцов ТЕМ наночастиц, макромолекул и аналогичных образцов.

Введение

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЕА) является эффективным инструментом для просмотра морфологии и ультраструктуры биологических образцов, которые слишком малы, чтобы их можно было увидеть с помощью обычного светового микроскопа ^{1 , 2 , 3 , 4} . TEM снимают электроны через очень тонкий образец, создавая изображение с более высоким разрешением, поскольку электроны имеют гораздо более короткую длину волны, чем свет. Регионы образца, которые изгибают или блокируют электроны, выглядят темными, а области, которые являются электронно-лучистыми, кажутся белыми.

Отсутствие электронного плотного вещества затрудняет просмотр вирусов при ТЭМ, поскольку они не могут рассеивать электроны. Отрицательное окрашивание является наиболее распространенным методом, используемым для создания контраста и просмотра вирусов с помощью TEM. Первая отрицательная процедура окрашивания была предложена Бреннером и Хорном в 1959 году на основе эксперимента, в котором Холл (1955) и Хаксли (1957) наблюдалиПривело к появлению биологических структур в обратном контрасте при погружении в электронно-плотное вещество ⁵ . Процесс отрицательного окрашивания практически не изменился за последние полвека. Отрицательное окрашивание включает кратковременное применение раствора соли тяжелых металлов к образцу на сетке ТЕА в попытке окружить вирус плотным материалом без проникновения вируса ⁶ . Это создает темную границу и показывает форму частицы ⁵ . В этом исследовании используются два реагента для отрицательного окрашивания, уранилацетат (UA) и фосфовольфрамовая кислота калия (PTA). Оба эти пятна обычно используются для негативного окрашивания небольших биологических образцов, таких как вирусы, белковые комплексы и наночастицы ^{7 , 8 , 9} .

Традиционная технология отрицательного окрашивания - это технология ручного отрицательного окрашивания капельNique ⁷ . Этот метод требует точной обработки небольших хрупких сеток ТЕА с помощью щипцов для нанесения небольшого количества образца вируса, пятен и полосканий. Типичный протокол подготовки включает в себя нанесение капельки суспензии образца на поверхность сетки ТЕА, покрытой пленкой ( рис. 1А ). После прикрепления образца к поверхности пленки сетку промывают для удаления неадгезивных вирусов и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до минуты, в зависимости от типа образца. Избыточная жидкость отходит от сетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки.

Метод ручной капли требует, чтобы каждая сетка была индивидуально изготовлена. Если не обрабатывать тщательно, покрытые сетки ТЕА легко проколоты, согнуты или загрязнены. Обработка нескольких выборок может привести к затруднениям в отслеживании сеток и обеспечении согласованного окрашивания для каждого образца. Эта процедура окрашивания вручную намного больше d(BSL) -3 и -4 лаборатории по биоконцентрации, из-за необходимого средства индивидуальной защиты (СИЗ), необходимого для этих сред. СИЗ громоздка, а окружающая среда биоконцентрации гораздо более бурная по сравнению с обычной лабораторией. Персонал, работающий в лабораториях по биологическому обогащению BSL-3, должен носить 2 пары перчаток и работать в шкафу для биобезопасности (BSC). Этот двойной слой перчаток снижает тактильную чувствительность и ограничивает тонкое движение мотора. Воздушный поток BSC, который защищает пользователя и помогает предотвратить загрязнение образца, может привести к тому, что образцы и пятна высохнут слишком быстро, что повлияет на качество пятен. Сильный турбулентный поток воздуха в BSC также может быстро сдуть сетку, которая недостаточно хорошо закреплена. В лабораториях по биологическому обогащению BSL-4 существуют дополнительные требования безопасности. Персонал должен носить костюм с положительным давлением, который дополнительно ограничивает физическое перемещение и способность четко видеть и манипулироватьUlate. Техник, работающий в BSL-4, также носит по крайней мере 2 пары перчаток, а внешняя пара - толстая перчатка, которая значительно снижает ловкость и осязание. Наконец, щипцы, используемые для работы с сетками ТЕА, являются острыми, что создает риск для техников из-за их способности проколоть перчатки. С капсулами, содержащими сетки, щипцы не нужны, тем самым обеспечивая безопасную альтернативу без использования щипцов для манипулирования сетками в биоконцентрации. Наконец, капсулы также обеспечивают эффективный способ хранения сеток во время обработки, дезактивации пара осмия и во время хранения; Тем самым сохраняя сетки организованными и безопасными от повреждений.

В этом отчете мы вводим новый метод для отрицательных окрашивающих сеток ТЕА в лабораториях по биологическому обогащению, в которых используются капсулы mPrep / g, капсульное устройство для обработки сетки и окрашивания ^{10 , 11 , 12} . Капсула вмещаетИзменяет две сетки ТЕА, сводит к минимуму прямую обработку и уменьшает вероятность повреждения сетки. Капсула прикрепляется непосредственно к одной или многоканальной пипетке таким же образом, что и наконечник пипетки, что позволяет применять различные жидкости к сеткам, содержащимся внутри. Это позволяет одновременно подготовить несколько образцов с дублирующими сетками ( рис. 1B ). К отрицательному пятну с капсулами образец вируса аспирируют в капсулу и выдерживают в течение 10 минут, чтобы вирусы адсорбировались на поверхности сетки. Затем сетки с адсорбированным вирусом промывают деионизированной (dI) водой и окрашивают либо UA, либо PTA в течение нескольких секунд до 1 мин. Этот процесс использует те же самые этапы и реагенты протокола, что и метод ручной капли; Разница в том, что вся работа происходит внутри капсулы без физической обработки сеток. ( Фиг.1С , 1D ).

Целью этого исследования было оценить капсулы какНовый метод отрицательного окрашивания образцов вирусов в средах биоконцентрации. В этом исследовании также изучалось качество изображений ТЕА, полученных из двух различных процедур инактивации вирусов: 1) быстрая инактивация, 1% пара тетроксида осмия и 2) 24-процентная инактивация с 2% глутаральдегидом. Оба они проводились с использованием капсул. Наконец, мы оценили два часто используемых отрицательных пятна, UA и PTA, для использования в капсуле. ¹³

протокол

1. Подготовка эксперимента в среде BSL-2 до работы с образцами вирусов

1. Подготовьте или купите медные сетки TEM Formvar и углеродного покрытия, обычно 200-400 меш.
2. Вставьте покрытые сетки ТЕА в капсулы.
   1. Используйте увеличенный объектив, чтобы облегчить выполнение этого процесса. Одна или две сетки могут быть вставлены в каждую капсулу. Предварительно загруженные капсулы можно приобрести, чтобы устранить этот шаг, если это необходимо.
3. Перенесите капсулы со вставленными сетками, покрытыми ТЕА, вместе с другими материалами и реагентами, в биоконцентрации, где вирусы будут отрицательно окрашены.

2. Способ капсулирования для отрицательного окрашивания в биологическом обогащении с использованием водного глутаральдегида и 1% -ной инактивации паратриоксида осмия

1. Внутри биоконцентрирования BSC аспирировать 40 мкл суспензии вируса в капсулу, прикрепленную к пипетке.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Пипетка остается прикрепленной к нейE до завершения процесса. Подготовка вируса соответствует нашей предыдущей публикации ¹⁴ .
2. Поместите пипетку на бок в течение 10 минут, сетки ориентированы горизонтально. Это должно способствовать равномерному распределению вирусных частиц на сетках с покрытием.
3. Инактивировать вирус в капсуле внутри биоконтактного BSC.
   1. Возьмите пипетку и нажмите на поршень, чтобы распределить раствор вируса в контейнер для отходов.
   2. Аспирируйте 40 мкл 2% глутаральдегида в капсулы.
      Осторожно: глутаровый альдегид является опасным химическим веществом и требует соответствующей защиты. Глутаральдегид можно использовать в течение коротких периодов в нормальном BSC, но расширенный открытый реагент требует работы в канальном BSC или вытяжном шкафу.
   3. Поместите пипетку на бок в течение 20 минут. Это необходимо для правильной фиксации образцов.
   4. Извлеките фиксатор и аспирируйте 40 мкл воды dI в капсулы, чтобы wПепел от фиксатора. Повторите этот этап промывки в течение всего 3 циклов полоскания.
4. Аспирируйте в капсулы по 40 мкл либо 1% уранилацетата (UA), либо 1% фосфовольфрамовой кислоты калия (PTA) и дайте ей сидеть в течение 30 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Время окрашивания может варьироваться от 10 с до 1 мин на основе образца вируса.
   Осторожно: UA является альфа-эмиттером и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой.
5. Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки, прикоснувшись к куску фильтровальной бумаги к краю сетки, в то время как решетки остаются в капсуле.
6. Процедура инактивации паратексида осмия.
   1. Поместите капсулу с открытой крышкой в ​​пробирку для центрифуги на 50 мл, содержащую фильтровальную бумагу, смоченную в 1% -ном растворе тетраоксида осмия.
      Осторожно: четырехокиси Osmium чрезвычайно токсичен при низком давлении паров. Он должен использоваться в канальном BSC или вытяжном шкафу для химических веществ. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой. Почтовое предупреждениеИнформации в рабочей зоне.
   2. Уплотните 50 мл центрифужную пробирку в течение 1 часа, чтобы обеспечить полное проникновение пара тетроксида осмия. Затем, затем дезактивируйте и перенесите трубку из биоконтейнера в установку EML BSL-2.
7. Удалите сетки EM из капсулы.
   1. В установке BSL-2 EM удалите капсулу из пробирки центрифуги и поместите ее на пипетку.
   2. Аспирируйте 40 мкл воды dI в капсулу и три раза подавайте воду в контейнер для отходов.
   3. Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки с помощью фильтровальной бумаги, чтобы прикоснуться к краю сетки.
   4. После сушки на воздухе храните сетки для последующей визуализации TEM.

3. Способ капсулирования для инактивации в биоконцентрации с 2% глутаровым альдегидом с последующим отрицательным окрашиванием в лаборатории BSL-2

1. Процедура инактивации вирусов.
   1. Внутри биоконцентрирования BSC смешать суспензию вируса с тем же объемом 4% глутаральдегида для достижения конечной концентрации 2% глутаральдегида.
      Осторожно: глутаровый альдегид является опасным химическим веществом и требует соответствующей защиты. Глутаральдегид можно использовать в течение коротких периодов в нормальном BSC, но расширенный открытый реагент требует работы в канальном BSC или вытяжном шкафу.
   2. Инактивировать вирусы с фиксацией в течение как минимум 24 часов перед упаковкой, дезактивацией и переносить их на оборудование BSL-2 EM.
2. В установке EML BSL-2 аспирируйте вирус и фиксирующую смесь в капсулу, содержащую две сетки ТЕА, прикрепленные к пипетке.
3. Поместите пипетку горизонтально в течение 10 минут с сетками, ориентированными горизонтально.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Это должно способствовать равномерному распределению вирусных частиц на сетках ТЕА.
4. Возьмите пипетку и нажмите на поршень, чтобы выгнать вирус в контейнер для отходов. Аспирировать 40 мкл ДИВоду в капсулы и выталкивать ее в контейнер для отходов для 3 циклов полоскания.
5. Аспирируйте 40 мкл либо 1% UA, либо 1% PTA в капсулы в течение 30 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Время окрашивания варьировало от 10 с до 1 мин на основе образца вируса.
   Осторожно: UA является альфа-эмиттером и кумулятивным токсином. Обращайтесь с ней с соответствующей защитой.
6. Удалите капсулу из пипетки и промокните сухие решетки, прикоснувшись к краю сетки к части фильтровальной бумаги. Воздух высушите решетки и сохраните их для последующей визуализации TEM.

Результаты

Метод капсул дает отрицательное окрашивание хорошего качества для изображений ТЕА:

Во-первых, мы оценили качество изображений, сгенерированных с использованием как ручного метода капель, так и методов капсул для отрицательного окраши...

Обсуждение

Отрицательное окрашивание является ценным методом ТЕА для оценки и калибровки вирусов, белковых комплексов и наночастиц. Классификация протоколов на протяжении более полувека была составлена ​​каплеобразным составом этих образцов путем ручного перемещения сеток от реагента до от?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM