Utilisation de capsules pour la coloration négative des échantillons viraux dans le cadre du suivi biologique

Résumé

Ce protocole fournit des instructions pour les échantillons de virus à coloration négative qui peuvent être facilement utilisés dans les laboratoires BSL-2, -3 ou -4. Il comprend l'utilisation d'une capsule de traitement innovante, qui protège la grille de microscopie électronique de transmission et fournit à l'utilisateur une manipulation plus facile dans les environnements les plus turbulents au sein du biocontainment.

Résumé

La microscopie électronique par transmission (TEM) est utilisée pour observer l'ultrastructure des virus et d'autres agents pathogènes microbiens avec une résolution nanométrique. La plupart des matériaux biologiques ne contiennent pas d'éléments denses capables de diffuser des électrons pour créer une image; Par conséquent, une tache négative, qui place des sels de métaux lourds denses autour de l'échantillon, est nécessaire. Afin de visualiser les virus en suspension sous TEM, ils doivent être appliqués sur de petites grilles revêtues d'une surface transparente de seulement des nanomètres d'épaisseur. En raison de leur faible taille et de leur fragilité, ces réseaux sont difficiles à manipuler et facilement déplacés par les courants d'air. La surface mince est facilement endommagée, laissant l'échantillon difficile ou impossible à l'image. Les virus infectieux doivent être manipulés dans un cabinet de prévention des risques biotechnologiques (BSC) et certains nécessitent un environnement de laboratoire de biocontainment. La coloration des virus dans les niveaux de biosécurité (BSL) -3 et -4 est particulièrement difficile car ces environnements sont plus turbulents et des techniciens sont nécessaires tO porter un équipement de protection individuelle (EPI), ce qui diminue la dextérité.

Dans cette étude, nous avons évalué un nouveau dispositif pour aider à la coloration négative des virus dans le biocontainment. L'appareil est une capsule qui fonctionne comme une pointe de pipette spécialisée. Une fois que les grilles sont chargées dans la capsule, l'utilisateur élimine simplement les réactifs dans la capsule pour délivrer le virus et les taches à la grille encapsulée, éliminant ainsi la manipulation par l'utilisateur des grilles. Bien que cette technique ait été conçue spécifiquement pour une utilisation dans BSL-3 ou -4 biocontainment, elle peut faciliter la préparation des échantillons dans n'importe quel environnement de laboratoire en permettant une coloration négative facile du virus. Cette même méthode peut également être appliquée pour préparer des échantillons TEM colorés négatifs de nanoparticules, de macromolécules et de spécimens semblables.

Introduction

La microscopie électronique à transmission (TEM) est un outil efficace pour visualiser la morphologie et l'ultrastructure des spécimens biologiques trop petits pour être vus avec un microscope optique traditionnel ^{1 , 2 , 3 , 4} . Les TEM tirent des électrons à travers un spécimen très mince produisant une image à résolution plus élevée puisque les électrons ont une longueur d'onde beaucoup plus courte que la lumière. Les régions de l'échantillon qui se plient ou bloquent des électrons apparaissent sombres, alors que les régions électronucléaires apparaissent blanches.

Le manque de matière électronique dense rend les virus difficiles à voir sous un TEM car ils ne peuvent pas disperser les électrons. La coloration négative est la méthode la plus commune utilisée pour créer un contraste et afficher des virus avec TEM. La première procédure de coloration négative a été proposée par Brenner et Horne en 1959, sur la base d'une expérience où Hall (1955) et Huxley (1957) ont observéL'apparition de structures biologiques en contraste inverse lorsqu'elles sont immergées dans une substance densément électronique ⁵ . Le processus de coloration négative n'a pratiquement pas changé au cours du dernier demi-siècle. La coloration négative consiste à appliquer brièvement une solution de sel de métaux lourds à un échantillon sur une grille TEM afin d'entourer le virus avec un matériau dense sans infiltrer le virus ⁶ . Cela crée une bordure sombre et révèle la forme de la particule ⁵ . Cette étude utilise deux réactifs pour la coloration négative, l'acétate d'uranyle (UA) et l'acide phosphotungstique de potassium (PTA). Ces deux taches sont couramment utilisées pour tacher les petits échantillons biologiques, tels que les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules ^{7 , 8 , 9} .

La technique de coloration négative classique est la technologie manuelle de coloration négative des gouttelettesNique ⁷ . Cette méthode nécessite une manipulation précise des grilles TEM petites et fragiles avec des pinces pour appliquer de petites quantités d'échantillons de virus, de taches et de rinçages. Le protocole de préparation typique implique l'application d'une gouttelette de suspension d'échantillon sur la surface d'une grille TEM revêtue de film ( figure 1A ). Après la fixation de l'échantillon sur la surface du film, la grille est rincée pour éliminer les virus non adhérents et colorée avec UA ou PTA pendant quelques secondes à une minute, selon le type d'échantillon. L'excès de liquide est méchant de la grille en touchant un morceau de papier filtre au bord de la grille.

La méthode manuelle de gouttelette exige que chaque grille soit faite individuellement. Si elles ne sont pas manipulées avec précaution, les grilles TEM revêtues sont facilement perforées, courbées ou contaminées. Le traitement de multiples échantillons peut entraîner des difficultés dans le suivi des grilles et une coloration uniforme pour chaque échantillon. Cette procédure de coloration manuelle est beaucoup plus dSi difficile lorsqu'ils sont effectués dans des laboratoires de biocotour (BSL) -3 et -4 biocontainment, en raison de l'équipement de protection individuelle nécessaire (EPI) requis pour ces environnements. L'EPI est lourd et l'environnement biocontainment est beaucoup plus turbulent par rapport à un laboratoire régulier. Le personnel travaillant dans les laboratoires de bioconfinement BSL-3 doit porter 2 paires de gants et travailler dans un cabinet de biosécurité (BSC). Cette double couche de gants réduit la sensibilité tactile et limite le mouvement du moteur. Le flux d'air du BSC qui protège l'utilisateur et contribue à prévenir la contamination de l'échantillon peut provoquer une séchage trop rapide des échantillons et des taches, ce qui affecte la qualité de la tache. Le fort flux d'air turbulent dans le BSC peut également épuiser rapidement une grille qui n'est pas bien sécurisée. Dans les laboratoires de biocontainment BSL-4, il existe des exigences de sécurité supplémentaires. Le personnel doit porter une combinaison de pression positive, ce qui limite davantage le mouvement physique et la capacité de visualiser et de manipuler clairementGrilles ulateuses. Le technicien travaillant dans BSL-4 porte également au moins 2 paires de gants, la paire extérieure étant un gant épais qui réduit considérablement la dextérité et la sensation tactile. Enfin, les pinces utilisées pour traiter les grilles TEM sont nettes, ce qui pose un risque pour le technicien en raison de leur capacité à perforer les gants. Avec des capsules contenant des grilles, les pinces ne sont pas nécessaires, fournissant ainsi une alternative sans danger pour la manipulation des grilles dans le biocontainment. Enfin, les capsules fournissent également un moyen efficace de stocker les grilles pendant le traitement, la décontamination de la vapeur d'osmium et pendant le stockage; Ce qui permet de garder les grilles organisées et à l'abri des dégâts.

Dans ce rapport, nous introduisons une nouvelle méthode pour les grilles TEM de coloration négative dans les laboratoires de biocontainment qui utilisent des capsules mPrep / g, un dispositif à base de capsules pour la manipulation du réseau et la coloration ^{10 , 11 , 12} . La capsule accomMode deux grilles de TEM, minimise la manipulation directe et réduit le risque de dégâts du réseau. La capsule s'attache directement à une pipette à une ou plusieurs canaux de la même manière qu'une pointe de pipette, ce qui permet l'application de divers liquides dans des grilles contenues à l'intérieur. Ceci permet la préparation simultanée d'échantillons multiples avec des réseaux en double ( figure 1B ). Pour une coloration négative avec des capsules, l'échantillon de virus est aspiré dans la capsule et maintenu pendant 10 minutes pour permettre aux virus d'adsorber sur les surfaces de la grille. Les grilles avec le virus adsorbé sont ensuite lavées avec de l'eau désionisée (DI) et colorées avec UA ou PTA pendant quelques secondes à 1 min. Ce processus utilise les mêmes étapes de protocole et réactifs que la méthode de gouttelettes manuelle; La différence étant que tous les travaux se produisent à l'intérieur de la capsule sans manipulation physique des grilles. ( Figures 1C , 1D ).

Le but de cette étude était d'évaluer les capsules commeUne nouvelle méthode pour la coloration négative des échantillons de virus dans les environnements de biocontainment. Cette étude a également examiné la qualité des images TEM produites à partir de deux procédures d'inactivation de virus différentes: 1) inactivation rapide, avec 1% de vapeur de tétroxyde d'osmium, et 2) une inactivation de 24 h avec 2% de glutaraldéhyde. Les deux ont été conduits en utilisant les capsules. Enfin, nous avons évalué deux taches négatives couramment utilisées, UA et PTA, pour une utilisation dans la capsule. ¹³

Protocole

1. Préparation de l'expérience dans un environnement BSL-2 avant de travailler avec les échantillons de virus

1. Préparez ou achetez des grilles de cuivre FORMvar et revêtues de carbone, habituellement 200-400 mesh.
2. Insérez les grilles TEM revêtues en capsules.
   1. Utilisez un objectif agrandi pour rendre ce processus facile à réaliser. Une ou deux grilles peuvent être insérées dans chaque capsule. Des capsules préchargées peuvent être achetées pour éliminer cette étape si vous le souhaitez.
3. Transférez les capsules avec des grilles revêtues TEM insérées, ainsi que d'autres fournitures et réactifs, au biocontainment où les virus seront colorés négativement.

2. La méthode de la capsule pour la coloration négative dans le développement biologique en utilisant du glutaraldéhyde aqueux et 1% d'inactivation de vapeur de tétraxyde d'osmium

1. À l'intérieur du BSC de biocontainment, aspirer 40 μL de suspension de virus dans la capsule attachée à une pipette.
   REMARQUE: la pipette reste attachée à laE capsule jusqu'à ce que le processus soit terminé. La préparation des virus est conforme à notre publication précédente ¹⁴ .
2. Placez la pipette sur le côté pendant 10 min avec des grilles orientées horizontalement. Il s'agit de favoriser une répartition uniforme des particules virales sur les grilles revêtues.
3. Inactive le virus dans la capsule à l'intérieur du BSC biocontainment.
   1. Ramenez la pipette et appuyez sur le piston pour distribuer la solution de virus dans un récipient à déchets.
   2. Aspirer 40 μL de fixateur à 2% de glutaraldéhyde dans les capsules.
      Attention: Le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Le glutaraldéhyde peut être utilisé pendant de courtes périodes dans un BSC normal, mais le réactif ouvert étendu nécessite de travailler dans un BSC canalisé ou une hotte chimique.
   3. Placez la pipette sur le côté pendant 20 min. C'est pour s'assurer que les échantillons sont bien réparés.
   4. Expulser le fixateur et aspirer 40 μL d'eau DI dans les capsules à wCasser le fixateur. Répétez cette étape de lavage pour un total de 3 cycles de rinçage.
4. Aspirer 40 μL de 1% d'acétate d'uranyle (UA) ou 1% d'acide phosphotungstique de potassium (PTA) dans les capsules et laisser reposer pendant 30 s.
   NOTE: Le temps de coloration peut varier de 10 s à 1 min en fonction de l'échantillon de virus.
   Attention: l'UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipulez-le avec une protection appropriée.
5. Retirez la capsule de la pipette et essorez les grilles en appuyant sur un morceau de papier filtre vers le bord des grilles pendant que les grilles restent dans la capsule.
6. Osmium Tetroxide Procédure d'inactivation de la vapeur.
   1. Placez la capsule, avec le couvercle ouvert, dans un tube de centrifugation de 50 ml contenant du papier filtre trempé dans une solution de tétraxyde d'osmium à 1%.
      Attention: le tétroxyde d'osmium est extrêmement toxique avec une faible pression de vapeur. Il doit être utilisé dans un conduit BSC ou une hotte chimique. Manipulez-le avec une protection appropriée. Message d'alerteInformations dans la zone de travail.
   2. Sceller le tube de centrifugation de 50 ml pendant 1 h pour permettre une perméation complète de la vapeur de tétroxyde d'osmium. Ensuite, décontaminez ensuite et transférez le tube hors du biocontainment à l'installation de BSL-2 EM.
7. Retirez les grilles EM de la capsule.
   1. Dans l'installation EM BSL-2, retirez la capsule du tube de la centrifugeuse et placez-la sur une pipette.
   2. Aspirer 40 μL d'eau DI dans la capsule et distribuer l'eau dans un récipient à déchets trois fois.
   3. Retirez la capsule de la pipette et nettoyez les grilles à l'aide de papier filtre pour toucher le bord des grilles.
   4. Après séchage à l'air, rangez les grilles pour l'imagerie TEM ultérieure.

3. La méthode de la capsule pour l'inactivation dans le développement biologique avec 2% de glutaraldéhyde, suivie d'une coloration négative dans un laboratoire BSL-2

1. Procédure d'inactivation de virus.
   1. À l'intérieur du BSC de biocontainment, mélanger bien la suspension de virus avec le même volume de glutaraldéhyde à 4% pour obtenir une concentration finale de 2% de glutaraldéhyde.
      Attention: Le glutaraldéhyde est un produit chimique dangereux et nécessite une protection appropriée. Le glutaraldéhyde peut être utilisé pendant de courtes périodes dans un BSC normal, mais le réactif ouvert étendu nécessite de travailler dans un BSC canalisé ou une hotte chimique.
   2. Inactive les virus avec un fixateur pendant au moins 24 h avant l'emballage, la décontamination et le transfère à l'installation EM BSL-2.
2. Dans l'installation EM BSL-2, aspirer le virus et le mélange fixatif dans la capsule, contenant deux grilles de TEM, attachées à une pipette.
3. Placez la pipette horizontalement pendant 10 minutes avec les grilles orientées horizontalement.
   REMARQUE: il s'agit de promouvoir une répartition uniforme des particules virales sur les grilles TEM.
4. Ramassez la pipette et appuyez sur le piston pour expulser le virus vers un conteneur de déchets. Aspirer 40 μL de dIL'eau dans les capsules et l'expulser dans le conteneur de déchets pour 3 cycles de rinçage.
5. Aspirer 40 μL de 1% d'UA ou 1% de PTA dans les capsules pendant 30 s.
   NOTE: Le temps de coloration varie de 10 s à 1 min en fonction de l'échantillon de virus.
   Attention: l'UA est un émetteur alpha et une toxine cumulative. Manipulez-le avec une protection appropriée.
6. Retirez la capsule de la pipette et essuyez les grilles en touchant le bord des grilles sur un papier filtre. Séchez à l'air les grilles et rangez-les pour l'imagerie TEM ultérieure.

Résultats

La méthode de la capsule produit une coloration négative de bonne qualité pour l'imagerie TEM:

Tout d'abord, nous avons évalué la qualité des images générées en utilisant à la fois la méthode de gouttelette manuelle et les méthodes de capsule pour la coloration négative du ebolavirus Zaire. Les ebolavirus sont membres de la famille Filoviridae , ainsi que le virus de Marburg. L'ebolavirus a gén?...

Discussion

La coloration négative est une technique TEM précieuse pour évaluer et dimensionner les virus, les complexes protéiques et les nanoparticules. La préparation des gouttelettes de ces éprouvettes par déplacement manuel des grilles du réactif aux taches négatives a été le protocole classique depuis plus d'un demi-siècle. C'est un processus simple, mais nécessite une expertise acquise grâce à la formation pour réussir. Une excellente coloration négative est toujours considérée comme un ensemble de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Formvar/carbon coated TEM grids	SPI	3420C-MB	200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules	EMS	85010-01	box
mPrep/f couplers	EMS	85010-11	standard 16/Pk
glutaraldehdyde	EMS	16320	50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide	EMS	19190	4% aqueous solution
Uranyl Acetate	EMS	22400	powder
Potassium phosphotungstic acid	EMS	19500	powder
filter paper	Whatman	1450-090	size 50
Tranmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1011	TEM