JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כתב יד זה מתאר במבחנה מיקרוסקופ וידאו פרוטוקולים להערכת הפונקציה כלי הדם בעכברוש מוחי התנגדות העורקים. כתב היד מתאר גם טכניקות להערכת צפיפות microvessel עם fluorescently שכותרתו זלוף לקטין ורקמות באמצעות לייזר Flowmetry דופלר.

Abstract

פרוטוקול זה המתאר את השימוש במבחנה טלוויזיה מיקרוסקופ כדי להעריך את תפקוד כלי הדם ההתנגדות מוחי מבודד העורקים (ובכל כלי אחר), ומתאר שיטות להערכת זלוף רקמות באמצעות לייזר דופלר Flowmetry (LDF ) ומתויגים צפיפות microvessel ניצול fluorescently Griffonia simplicifolia (GS1) לקטין. שיטות לימוד מבודד התנגדות העורקים בזמן transmural לחצים נתקל ויוו , בהיעדרו של תאים parenchymal השפעות ומספקות לך קישור קריטי בין ויוו מחקרים ומידע שנרכשו מ מולקולרית הרדוקציוניסטית המספקים מוגבל תובנה תגובות אינטגרטיבית ברמת כל בעלי חיים. LDF וטכניקות רבים לזהות באופן סלקטיבי נימים עם fluorescently-ידי לקטין GS1 לספק פתרונות מעשיים כדי לאפשר חוקרים כדי להרחיב את הידע שנרכש ממחקרים מבודד התנגדות העורקים. מאמר זה מתאר את היישום של טכניקות אלה כדי לצבור ידע בסיסי של כלי הדם פיזיולוגיה, פתולוגיה בחולדה כמודל ניסויי כללי, במגוון מיוחדים מהונדסים גנטית זנים "מעצבים" עכברוש יכול לספק תובנה חשובה השפעת גנים ספציפיים על חשוב פנוטיפים כלי הדם. ניצול גישות ניסיוניות יקרי ערך אלה בעכברוש הזנים שפותחו על ידי אסטרטגיות מלאכותית וטכנולוגיות חדשות לייצור מודלים נוקאאוט גנטי בחולדה, יתרחב הקשיחות של המקומי המדעי פיתח במודלים נוקאאוט של העכבר, להרחיב את הידע הזה כדי במודל חיה רלוונטי יותר, עם רקע פיזיולוגי הבין היטב, התאמתם מחקרים פיזיולוגיים בגלל הגודל שלה גדול יותר.

Introduction

המחקרים המוקדמים של תפקוד כלי הדם העורקים מנוצל conduit עורקים, וכן רבים במקרים אבי העורקים. יצירת כח בעורקים גדולים נחקר בדרך כלל על ידי הצמדת קטע טבעת של העורק מתמר כוח באמבט רקמות; במקרה של אבי העורקים, על ידי חיתוך לוליינית רצועות של כלי השיט כך סיבי שריר חלק היו אוריינטציה בכיוון האורך בין הנקודה החזקה המתמר בכוח, כדי לספק את האומדן הטוב ביותר של הכוח שנוצר על ידי שריר חלק לאורך ציר האורך. הטכניקה הסטנדרטי לחיתוך רצועות לוליינית aortas היה למקם את מוט זכוכית לומן של כלי השיט, עושים חתך על הקיר כלי בזווית הרצויה של תחזיק בקצה של הקצה החשוף של הקיר כלי כמו גזירה הוארך כדי לייצר שלמה רצועת הסליל של כלי השיט. בשלב זה, הצד אנדותל של כלי השיט כלל נמוג ונעלם להסרת פסולת לפני הצמדת רצועת כלי מתמר כוח, השוקע ההכנה ב חמצן, טמפרטורה מבוקרת רקמות אמבט. בסופו של דבר, כי הגישה בראשות לאחת התגליות החשוב והמפורסם ביותר בהיסטוריה של פיזיולוגיה Furchgott ו- Zawadski1, כלומר את התפקיד של אנדותל נגזר גורם מרגיע (EDRF), לאחר מכן זוהה תחמוצת החנקן, ב ויסות תפקוד כלי הדם. האירוע מכריע שמוביל שגילוי היה מצב שבו החוקרים המתוחזקים של אנדותל ללא פגע על ידי הימנעות קשר של הצד אנדותל של העורק במשטחים זרים, והבחנתי כי רצועת אבי העורקים לא להפגין את הצפוי הציר כדי אצטילכולין (ACh), אבל במקום רגוע, בתגובה ACh. בהתבסס על המידע החיוני, החוקרים פיתח הכנה "כריך" שבו חיברו מקטע אבי העורקים עם אנדותל שלם (אך אין אפשרות ליצור כוח כויץ) לקבל רצועה לוליינית סטנדרטי של אבי העורקים, המרה של ACh-induced התכווצות לתוך הרפיה.

שני התקדמות גדולה באזור זה הנמצאים בשימוש נרחב כיום הם ההתפתחות של ההכנות למדוד פעיל כויץ כוח התנגדות קטן העורקים2,3 (כגון אלה של מצע המעי המעי3 ) ו לצינוריות עמידות העורק ההכנות4,5,6. באחד הדיווחים המוקדמים, Mulvany ו הלפרן3 תיאר את השימוש ההכנה myograph תיל ללמוד פעיל כויץ כוח מבודדים התנגדות העורקים מ מצע המעי המעי באופן ספונטני עם יתר לחץ דם העכברים (שומר), פקדים WKY normotensive. לאחר הפיתוח של מערכת myograph תיל, פותחו לצינוריות עמידות העורק ההכנות להתיר מחקרים של כלי קרוב ל ויוו 5,4,התנאים6.  בעוד שתי הגישות לספק תוצאות יקר, הכנת לצינוריות בעורק יש את היתרונות הוסיף יותר ביעילות שמירה על הטון פעיל מהותי בעורקים; ומאפשר החוקרים ללמוד תגובות myogenic הפעיל לשינויים תגובות הלחץ ואת כלי transmural שינויי קצב הזרימה ואת אנדותל גזירה (ראו סקירה על ידי הלפרן, קלי6).

יעד מרכזי של המאמר הנוכחי היא לתאר כיצד להעסיק את הטכניקה ששורשיה של מיקרוסקופ וידאו באמצעות התנגדות מבודדת, לצינוריות העורקים על מנת לקבל מידע מדויק לגבי המנגנונים המווסתים טון פעילים אלה חיוני . כלי, עצמאית של השפעות עצביות, ההורמונאלית או parenchymal תא. מידע בסיסי זה, העסקת דגם עכבר סטנדרטי ודוגמאות מן המחקרים שלנו של חדש גנטית זני עכברים מהונדסים, תספק את הקורא עם רעיון של סוגי לתובנות לגבי תפקוד כלי דם שניתן להשיג עם טלוויזיה גישות מיקרוסקופ, אשר יכול להיות מועסק ב מחקרים שכללו כל שליטה, בקבוצות ניסיוני של החוקר בוחר, כולל דגמים עכברוש ניסיוני חדש חזק המיוצר על ידי הרבעה סלקטיבית ולא מחדש פיתח גנטי טכניקות הנדסה.

בזכות הדיוק של גישות מיקרוסקופ טלוויזיה, במדידת קוטר שינויים בהכנות לצינוריות עורק יכול לספק מידע רב ערך מאוד לגבי מנגנונים תלויי-אנדותל ועצמאי אנדותל של כלי הדם הרפיה, כמו גם שינויים חשובים (וגם לפעמים בלתי צפויות) מנגנוני בקרה וסקולרית המתרחשים עם יתר לחץ דם, תזונה מלח גבוהה של התערבויות אחרות ניסיוני. בנוסף, מדידה של הלחץ-קוטר היחסים מבודדים, לצינוריות עורקים עמידות מקסימאלית רגועות על ידי טיפול עם Ca2 +-ללא פתרון או תרופה תרופתי מרחיב כלי דם, מתירה לחוקר להעריך ביצוע שינויים מבניים העורקים בשל שיפוץ כלי הדם, כדי לחשב יחסים מתח פאסיבי-זן7 שיכול לספק תובנה חשובה שינויים במאפייני מכני פסיבי של העורקים אשר יכולים להשפיע על תפקוד עורקי עצמאית של (או בנוסף) שינויים מנגנוני בקרה פעילה. חשוב גם לציין כי המידע הנרכש ממחקרים מבודד התנגדות העורקים ניתן להשלים על ידי מידע שהושג ניצול LDF, שיטה מעשית להערכת רקמות זלוף-כל בעלי החיים ברמה8,9 ,10, ומאגד לפי מידע שנרכש מתוך הערכת הצפיפות microvessel באמצעות fluorescently שכותרתה GS1 לקטין, אשר במפורש גליקופרוטאין moieties ב קרום המרתף של רבים, נימים קטנים11 , 12. השיטה השנייה מספק הערכה מאוד מדויקת של צפיפות microvessel שאינו כפוף הקשיים קלאסי באומדן צפיפות microvessel על ידי ספירת כלי ויוו, לדוגמה חסרים שאינם perfused כלי שבו זרימת הדם מופסק עקב סגירת פעילים רבים. כאשר נעשה שימוש יחד, גישות אלה יכולים לספק תובנה חשוב לתאם שינויים פונקציונליים העורקים מבודד התנגדות לשינויים רקמות זלוף ברמת microcirculatory; כמה דוגמאות לשימוש גישות יקרי ערך אלה בשילוב עם טכניקות עורק לצינוריות יסופקו בכתב היד הנוכחי.

המאמר הנוכחי מתמקד השימוש של טכניקות במיקרוסקופ וידאו כדי להעריך שינויים בכלי הדם העורקים של חולדות ספראג-Dawley outbred. עם זאת, חשוב לציין כי שיטות אלה הוכיחו להיות בעלי ערך גבוה ב שחקרתי שינויים פנוטיפי זני עכברים מהונדסים גנטית מאוד מיוחדים שנוצרו על ידי ברירה מלאכותית או ג'ין עריכה תוך שימוש בטכניקות. כתב יד זה, אנו מספקים דוגמאות איך וידאו טכניקות במיקרוסקופ סיפקו מידע חשוב לגבי תפקוד כלי הדם במספר של עכברוש יקר דגמים, כולל דאל רגיש מלח (הה) עכברים, עכברושים המפגרים המתח הוא נרחב ביותר משמש דגם ניסיוני ללמוד על מנגנוני מלח hypertenson רגיש18,19,20,21,22,23; חולדות consomic שנוצרו באמצעות ברירה מלאכותית של האס. אס חולדות עם המתח מלח-רגישות של עכברוש בראון נורבגיה (בסון). הלוחות עכברוש consomic, בכל כרומוזום מהחולדה נורבגיה בראון כבר introgressed בנפרד לרקע דאל SS24,25,26 גנטי. השימוש פנלים עכברוש consomic סיפקה ערך רמזים לגבי כרומוזומים מסוימים שתורמים מלח הרגישות של לחץ הדם ואת פנוטיפים אחרים, כולל תגובתיות וסקולרית24,25,26 27, ,28.

אסטרטגיות רבייה סלקטיבית ניצול SS עכברים וחולדות consomic נושא כרומוזומים בודדים בסון אפשרו גם הדור של זנים הצרת congenic עם מקטעים קטנים של הפרט בראון נורבגיה כרומוזומים introgressed לתוך האס דאל גנטי 22,רקע29. אלה יכולים לספק יקרי קלט על גנים ספציפיים או לצמצם אזורים של כרומוזומים אשר יכולים להשפיע על משתנים פיזיולוגיים קריטי, כגון לחץ דם, כליות נזק לכלי הדם תגובתיות22,29. בנוסף חזק אחר הכלים גנטית עכברים היא הפיתוח של עכברוש ג'ין נוקאאוט דגמי ניצול גנים מתקדם עריכה כולל ZFNs, מפעיל-כמו-אפקטור תעתיק nucleases (TALENS), שיטות, לאחרונה CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. כניסתו של טכניקות אלה עוצמה המאפשרים גנים לנוק אאוט בחולדה הוא פיתוח שלמוזיקה יש חשיבות מרובה כי מחקרים נוקאאוט גנטי עד כה השתמשו (ועכברים להמשיך להשתמש) כמעט באופן בלעדי. רכיב נסיוני נוסף בעיתון הנוכחי מדגים את הערך של העורק לצינוריות וטכניקות מיקרוסקופ וידאו כדי להעריך את מנגנוני הבקרה פיזיולוגיים בחולדות נוקאאוט חסר בסיס נוגד חמצון ותא שעתוק מגן פקטור, גרעיני גורם (נגזר erythroid 2) - כמו - 2 (NRF2)30,31, אשר פותחו באמצעות טכנולוגיית TALEN הרקע הגנטי של ספראג-Dawley17. בניסויים האלה, במבחנה טכניקות במיקרוסקופ וידאו שימשו כדי לספק אימות פונקציונלי של אובדן של הגן NRF2, כדי לבדוק את ערך פוטנציאלי גישה טיפולית המבוססת על קולטנים upregulation ישירה של נוגדי חמצון בתיווך NRF2 הגנות. ה-NRF-2 יש חשיבות טיפולית משמעותית ב הייהוד שלה סטרס חמצוני וסקולרית בבני אדם, לאור תוצאות מאכזבות של ניסויים קליניים הכוללים ניהול ישיר של נוגדי חמצון כגון ויטמינים C ו- E32.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

המכללה של ויסקונסין מוסדיים חיה טיפול רפואי ועל שימוש הוועדה (IACUC) אישרה כל הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה, כל ההליכים הם בהתאם נבחרת מכונים לבריאות (NIH) במשרד של מעבדה חיה רווחה (OLAW) תקנות.

1. הכנת כלי קאמרית והפתרונות

  1. לפני ביצוע סדרה של ניסויים, להכין 2 ל' של 20 x תמיסת מלח מניות מרוכזת בהיקף של 278 g/L NaCl; אשלגן כלורי 14 g/L; 11.52 g/L MgSO4. 7 שעות2O; 9.4 g/L CaCl2. 2H2O. גם להכין 2 ל' של 20 x מלאי מאגר מרוכז המורכב 80.8 g/L NaHCO3 ו 0.4 g/L EDTA, 2 ל' של 20 x מרוכז Ca2 +-פתרון מלאי חינם המורכב 281.6 g/L NaCl; אשלגן כלורי 14 g/L ו- 11.52 g/L MgSO4. 7 שעות2O.
    הערה: 20 X פתרונות מניות ניתן לאחסן במקרר עד לשימוש.
  2. ביום של הניסוי, להכין 2 ל' של תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS) 20 x מרוכזים פתרונות מניות כדלקמן: להוסיף 100 מ של 20 x מניות מלח 1,800 מ ל מים יונים 2 ל' Erlenmeyer בקבוק או כוס כימית על צלחת מלהיב ממונע. להוסיף 100 מ של מלאי מאגר x 20 תוך ברציפות equilibrating הפתרון עם תערובת גז המכיל 21% או2, 5% CO2, איזון N2, לדבר על זה עם בר מלהיב מגנטי. לאט לאט להוסיף 0.28 g2PO NaH4 תוך ניטור pH; להתאים לפי הצורך כדי pH 7.4 על-ידי הוספת טיפות של 6 N HCl או פתרון N NaOH 6.5 מ פיפטה פסטר. לאחר מוכן PSS ה-pH מכוונן, להוסיף 1.98 גר' גלוקוז PSS.
    הערה: חשוב להוסיף לאט את2PO NaH4 אחרונה תוך ניטור pH של PSS כי התוספת של2PO NaH4 כדי פתרון אלקליין (pH > 7.4) יכולים להוות את התמיסה סידן פוספט, כפי שמציין המראה של פתרון מעוננים או של התמיסה לבן בתחתית המיכל.
    הערה: ההרכב הסופי של PSS זה 119 מ מ/L NaCl; אשלגן כלורי 4.7 מ מ/ליטר; 1.17 מ מ/L מ ג2אז4; 1.6 מ מ/L CaCl2; מ מ 1.18/L NaH2PO4; 24 מ מ/L NaHCO3; מ מ 0.03 נקודות/L EDTA; 5.5 מ מ/L גלוקוז. למרות ההרכב של PSS יכולים להיות שונים בין מעבדות, המתכון הזה מתאים מאוד לשמירה על הטון וסקולרית פונקציה אנדותל, התגובות סוכנים vasoactive מבודדים התנגדות העורקים.
  3. כדי לקבוע את הקוטר המרבי וכדי להעריך את הטון פעיל בעורק על ידי ייצור מקסימלית התרחבות של כלי השיט, הכנת 500 מ"ל של Ca2 +-חינם PSS על-ידי הוספת 25 מיליליטר 20 X Ca2 +-ללא מניות מלח 450 מ של מים יונים , ואחריו 25 מ ל 20 x מלאי מאגר Erlenmeyer בקבוק או כוס כימית דומה לשלב 1.2 לעיל. להוסיף 0.07 גר' NaH2PO4 הפתרון תוך פיקוח והתאמה של ה-pH של התמיסה. Ca2 +-PSS חינם מתווסף PSS המאגר ואת כלי התא בסוף הניסוי כדי להימנע depleting תאיים Ca2 + חנויות העלולה להשפיע על כלי השיט תגובות ב PSS נורמלי. כי Ca2 +-פתרון ללא תשלום נוסף בסוף הניסוי כדי לייצר הרפיה מקסימלית של העורקים, אין צורך להוסיף גלוקוזה PSS.
    הערה: כאשר להשלים, ההרכב הסופי של Ca2 +-PSS חינם הוא מ"מ 120.6/L NaCl; אשלגן כלורי 4.7 מ מ/ליטר; 1.17 מ מ/L מ ג2אז4; מ מ 1.18/L NaH2PO4; 24 מ מ/L NaHCO3; 0 מ מ/L CaCl2; מ מ 0.03 נקודות/L EDTA.
    הערה: למחקרים רבים הדורשים התארכות המרבי של העורק, חוסם ערך סידן כגון verapamil (1 מיקרומטר) ו/או תורם תחמוצת החנקן כגון חמצן (10 מיקרומטר) ניתן להוסיף את הפתרון, בנוסף להסרת Ca2 + (pss).
  4. לשמר את פו2PCO2, ה-pH של PSS על-ידי ברציפות equilibrating של PSS זורם אל החדר כלי באמבט רגיל איברים חקר טבעות אבי העורקים מבודד, שריר חלק המעי או רקמות אחרות (איור 1). להשתמש fluoropolymer סינתטי של אבובים tetrafluoroethylene כדי להתחבר למיכל הדלק לאמבטיה איברים מפני סוג זה של צינורות גז אטום, בניגוד צורות רבות אחרות של אבובים, למשל, ב- latex.
  5. המקום אבן אוויר קטן המחובר תערובת גז equilibration בבית הבליעה כלי כדי לסייע בשמירה על הרכב גז PSS.
    הערה: כלי התגובות לשינויים פו2 יכול להיבדק על-ידי equilibrating של PSS כלי תא, luminal perfusate עם תערובות גז המכיל אחוזים שונים של O2, למשל, 21% O2, 10% או2, 5% O2 , ו- 0% או2, עם 5% CO2 ואיזון N233,34,35. עבור עורקים גדולים יותר עם קירות עבים, שבו דיפוזיה של חמצן לתוך המרכז של הקיר כלי עשוי להיות מגבלה, אחוז גבוה יותר של חמצן, למשל, 95% O2 יכול לשמש.
  6. לפקח על הטמפרטורה בחדר כלי מקרוב, כפי צ'יימברס בודדים עשוי להשתנות ב המאפיינים העברת החום שלהם.
    הערה: רבים צ'יימברס מסחרית איך מכינים כלי המשמש ללימודי לצינוריות התנגדות העורקים לנצל משאבה סחרור לספק חמצן PSS מאגר גז-equilibrated ולספק שליטה מדויקת מאוד של טמפרטורת אמבטיה, חמצון של PSS.
  7. מקם את PSS בבקבוק גדול (2 ליטר) אדם, עם פקק, מבחנה מרכזי כדי לשמש מאגר ברציפות לספק PSS לאמבטיה איבר, אשר מחמם גז-equilibrates של PSS זורם אל החדר כלי (איור 1 א').
  8. מקום לפתיחת הצינור זכוכית המרכזי הבקבוק אדם באותה רמה כמו העליון של PSS באמבטיה איברים, כדי לשמור על ראש לחץ הידרוסטטי קבוע עבור משלוח של PSS לאמבטיה איברים. צינורות פוליאתילן לשימוש מחובר זכוכית בצורת J או צינור פלסטיק כדי לספק את PSS מהבקבוק אדם לתוך האמבט איברים.
  9. זלוף luminal (איור 1 א'), להשתמש צינורות פוליאתילן להתחבר פיפטה תזרים את מאגר PSS מורכב 60 cc פלסטיק מזרק מוגברות למיקום המתחזק את הלחץ הרצוי תזרים (בדרך כלל 80 מ מ כספית ללימודים של עכברוש מוחי מתמר העורקים), כפי שנמדד עם לחץ קשורים למערכת דרך צימוד.
  10. להתחבר פיפטה תזרים את צינור פוליאתילן כדי לאפשר את PSS לזרום דרך הכלי בתגובה הדרגתי לחץ, להתחבר לקו יצוא מאגר דומה המאגר תזרים. להשתמש בחיבור רגשי דומה, צימוד ולחץ כדי למדוד את הלחץ יצוא.
    הערה: נהלי הגדרת לחץ transmural ובקרת זרימה דרך הכלי שיפורטו בסעיף 2, להלן.
  11. בסוף הניסוי, שטפים היטב את החדר, מסירה קווים ומערכות מאגר עם מים מזוקקים. במרווחים תכופים, להחליף את הקווים אבובים ואספקה, נקי או להחליף את stopcocks במערכת ולאחר מעת לעת לחשוף כל מאגרי PSS זכוכית ושטוף חומצה כדי למנוע את התפתחותם של חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים לגרום זיהום, משפיעים על קיבול תגובתיות.

2. לצינוריות עורק הכנה

  1. עזים ומתנגד חולדה ספראג-Dawley עם 5% איזופלוריין ולתחזק את ההרדמה באמצעות חמצן רפואי כיתה 1.5-2.5%36. לחלופין, לניהול זריקה תוך שרירית המכילה קטמין (75.0 מ"ג/ק"ג), איזופרומאזין (2.5 מ"ג/ק"ג), חריגות השירותים הווטרינריים (10.0 מ"ג/ק"ג); זריקה בקרום הבטן של פנטוברביטל (50-60 מ"ג/ק"ג); או כל שיטה אחרת המאושרת של הרדמה, תלוי פרוטוקולים ו/או החוקר העדפות.
  2. לערוף את החולדה תחת הרדמה עמוקה, מסירים את המוח ללימודי מוחי התנגדות העורקים.
  3. לאחר ההסרה של המוח, בזהירות לבודד עורק המוח התיכון (MCA) (או העורקים אחרים מעניינים, למשל, בעורק או עורק המוח האחורי)37,38. כדי לבודד את MCAs, במקום את המוח פרקדן בצלוחית זכוכית מלאים PSS כקרח (איור 2).
  4. השתמש Vannas מספריים ומלקחיים עצה בסדר דומונט #5 לסלק את MCA מהמוח.  לנקות את כל רקמת המוח שיורית מ MCA עם המלקחיים ולהעביר את העורק תא כלי מבוקר טמפרטורה המכיל PSS כפי שתואר לעיל. 33 , 34  .
  5. כדי להעביר את העורק אל התא כלי השיט, בעדינות להחזיק את כלי הקיבול נכרת על ידי כן או על קטע עורק המקיימים תקשורת האחורי, הניחו בזהירות לתוך החדר.
    הערה: בנוסף MCA, מערכת כלי לצינוריות מתאימה למגוון רחב של ההכנות כלי קטן, לרבות שרירי השלד התנגדות העורקים33,39,40, העורקים ההתנגדות מצע המעי העליון 38 , 41 , 42, גדול (מסדר ראשון) רבים של שריר cremaster43, וכן רבים כלילית אנושי, אנושי רבים המתקבל רקמת השומן התת עורית במהלך ביופסיה gluteal44,45, 46,47.
  6. לצרף את העורק micropipette תזרים על-ידי משיכתו כלפי הבסיס פיפטה עד הקצה מקדמות לתוך לומן של MCA. אבטח את העורק על פיפטה תזרים על ידי קשירת לולאה מוכנה מסיב יחיד סטרנד בעבר התגרו מ 10-0 התפרים סביב העורק (איור 1B). לאבטח בצד השני של MCA על פיפטה יצוא על ידי הידוק לולאה התפר השני סביב הספינה (איור 1B).
    הערה: מניחים את לולאות התפר על micropipettes לפני הרכבה את כלי הקיבול, למקם אותם קרוב הנקודה הסופית של הקובץ המצורף, לאפשר להם להיות החליקה בקלות מעל העורק ומאובטחים במהירות כאשר הספינה נמצא במצב אשר ממזער את הסיכון של עורק להתקלף מדי סוכר.
    הערה: Micropipettes מוכנים מ זכוכית בורוסיליקט צינורות קפילר (2 מ מ קוטר חיצוני; הקוטר הפנימי של 1 מ"מ; 10 ס מ) תוך שימוש של פולר micropipette אנכי. לפני צירוף העורק, להתאים על הקוטר עצה של micropipettes ככל האפשר כדי למנוע אי-התאמות של תזרים והתנגדות יצוא במערכת זלוף.
  7. לאחר העורק קשורה היטב micropipettes, להשתמש את מיקרומטר מחובר למחזיק פיפטה תזרים למתוח יכול להגיע אורכו של באתרו .
  8. תקשור כל בצד סניפים עם הגדילים יחיד התגרו מ 10-0 תפרים על מנת לשמור על לחץ קבוע בעורק.
  9. ודא היעדר נזילות על-ידי בדיקה כי הלחץ intraluminal (transmural) נשאר קבוע לאחר סוגר זמנית על פיפטה תזרים. . תקשור בכל הסניפים או לחפש חורים בתוך הכלי אם הלחץ נופל. שחזור זלוף לאחר וידוא כי הלחץ transmural נשאר קבוע.
    הערה: תעלות מבודד התנגדות העורקים דורשת מיומנות ידנית ותרגול. אמצעי הזהירות העיקריים שחלים הם כדי למנוע פריצה של מדי סוכר כדי לוודא כי העורק לא להחליק את מדי סוכר. זה חשוב להיות עדין עם העורקים מבודד לאורך ההליך כולו, כמו טראומה לכלי השיט עלול לגרום נזק של אנדותל ו/או להפריע תפקוד תקין של השריר החלק בכלי הדם.
  10. למדוד את קוטר פנימי של העורק באמצעות מלכודת מיקרוסקופ וידאו (איור 1 א') בהיקף של מצלמת וידאו מצורף מיקרוסקופ ויבתר ומחובר מיקרומטר וידאו וצג הטלוויזיה (דמויות 1B, 1c). פעולה זו מאפשרת לצופה למדידת קיבול קטרים באופן ידני על ידי הנחת קווי הפניה להזזה על החומה הפנימית של העורק ובמידת הצורך, על הקיר החיצוני של העורק, על מנת למדוד את עובי הקיר כלי השיט.
    הערה: מיקרומטר וידאו מסוימים מציעים מעקב אוטומטי אחר מידות קיבול.
    הערה: לכייל את הסרטונים מיקרומטר עם מיקרומטר הבמה מיקרוסקופ, מהזרימה, יצוא לחץ מתמרים עם manometer כספית (0 מ מ כספית, 50 מ מ כספית, 100 מ מ כספית, 150 מ מ כספית, ו- 200 מ מ כספית) בין ניסויים כדי להבטיח מדידות מדויקות של כלי קוטר הלחץ intraluminal.
    הערה: הלחץ transmural שליטה רגיל לניסויים MCA עכברוש הוא 80 מ מ כספית. כיול עבור רמות גבוהות ונמוכות הלחצים מבטיח דיוק ללימודים של תגובות myogenic לשינויים transmural הלחץ והן פסיביות עקומות לחץ בקוטר העורקים מורחבים מקסימאלית.
  11. להתאים את הגובה של המאגרים תזרים, יצוא כדי לשמור על הלחץ הרצוי transmural ברמה קבועה. העלאת המאגר תזרים עד כמות קטנה (< 5 מ מ כספית) והורדת המאגר יצוא באותה מידה שומר על הלחץ transmural רשע ויוצר זרימה זלוף ב לומן כלי6.
    הערה: העלאת המאגר תזרים והורדת המאגר יצוא על ידי כמויות שוות שומרת את transmural רשע באותה distending הלחץ בעורק, אך יוצרת מעבר צבע בלחץ הידרוסטטי שגורמת זרימה, גזירה הכלי, המאפשר החוקר להעריך תגובות אנדותל תלוית לשינויים intraluminal גזירה בקבוצות שונות ניסיוני48.
  12. כדי להעריך תגובות myogenic ואת כלי תגובות לגירויים מרחיב כלי דם, ודא כי העורק תערוכות רמה מתאימה של הטון פעיל (כ-40%) לפני הניסוי. למחוק את כל העורקים חסר הטון הפעילים במנוחה למעט כלי, למשל, עורקים מצע המעי העליון קטנים זה לא מוצג בדרך כלל הטון מנוחה פעילה.
    הערה: עבור כלי זה לא מוצג בדרך כלל הטון ספונטנית, מתכווצים מראש את העורקים על ידי כמות שווה ניצול אגוניסט מצר את כלי הדם כגון נוראדרנלין או phenylephrine. גישה טובה לבחירת המינון של אגוניסט נהגה מראש מתכווצים העורק זה לנצל את המינון50 EC של מצר את כלי הדם סוכן, למשל, נוראדרנלין41,42. עם זאת, סוכנים תרופתי מצר את כלי הדם לא צריך להיות מוחל על העורקים כי התערוכה הטון פעיל ספונטנית תחת נח תנאים.
  13. מבחן אנדותל תלוית תגובתיות של העורק לצינוריות ההתנגדות על ידי מדידת הקיבול קטרים במהלך התוספת של הגדלת ריכוזים של ACh (10-10 M-10-5 מ') לתא כלי השיט. מבחן רגישות תחמוצת החנקן אנדותל עצמאית השריר החלק בכלי הדם על ידי מדידת הקיבול קטרים במהלך התוספת של ריכוז (10-10 M-10-5 מ') תורם חנקן חמצן כלי קאמרית.
    הערה: רגישות סוכנים מצר את כלי הדם, אגוניסטים מרחיב כלי דם אחרים יכול להיבדק באופן דומה על-ידי הוספת הגדלת ריכוזים של אגוניסט לתא כלי השיט.
    הערה: בנוסף vasoactive סוכנים, תרופות שונות, מעכבי, וסוכני תרופתי אחרים ניתן להוסיף לאמבטיה רקמות ו/או את perfusate luminal. שינויים פו2 (כמו גם PCO2 ו pH) יכול באופן סלקטיבי ינוהלו הצד אנדותל או הצד luminal-תוספת של העורק על ידי נפרדים equilibration של perfusate luminal עם אבן אוויר מחובר תערובת דלק מכויל שונה מן התערובת נהגה equilibrate של PSS ב34,4933,אמבט רקמות. תגובות myogenic שינויים בלחץ transmural ניתן יהיה ללמוד על ידי סגירת פיפטה תזרים את העלאת (או הנמכת) הגובה של המאגר PSS מחובר תזרים פיפטה49,50,51 ל להגדיל או להקטין את הלחץ intraluminal.
  14. כדי לבחון את התפקיד של אנדותל מתווכים כלי תגובות לגירויים ספציפיים, להסיר את אנדותל כלי הדם והשווה כלי תגובות לגירויים אלו נוכחות או העדר אנדותל. כדי להסיר את אנדותל, בזהירות להתיר את העורק של פיפטה תזרים, לאט perfuse לומן של העורק עם בולוס אוויר (0.5-1.0 מ"ל). לאחר אוויר זלוף, שחזר PSS זלוף כדי לנקות את הלכלוך הסלולר לפני הקשירה מחדש את כלי-קיבול פיפטה של יצוא43.
    הערה: בעקבות ההליך חסיפה אנדותל, חשוב לוודא כי אנדותל הוסר על-ידי בדיקת כלי הדם התגובות אגוניסט (בדרך כלל ACh) ידוע לייצר אנדותל vasodilation תלויים בסוג זה כלי הקיבול. עם זאת, בתנאים מסוימים פיפטות, תלויי-אנדותל vasoconstrictors משתחררים, בכל מקרה, חשוב לוודא כי התגובה μ חוסלה בעקבות הסרת אנדותל.
  15. בסוף הניסוי, לקבוע הקוטר המרבי של העורק על ידי הוספת2 +Ca-חינם PSS perfusate ו- superfusate. לחשב פעיל מנוחתו טון (%) כמו ((Dמקס-Dמנוחה) /Dמקסימום) x 100, כאשר Dmax הוא הקוטר המרבי בנוכחות Ca2 +-ללא פתרון ו- Dמנוחה הוא בקוטר שליטה בזמן מנוחה.
    הערה: מידות קוטר העורקים מקסימאלית רגועה לקבוצות שונות ניסיוני יקרים בהשוואה בין פעיל בגוון מנוחתו, שיפוץ מבניות (קרי, שינויים בקוטר עובי ו לומן קיר) ובאופן פסיבי תכונות מכניות (מתח-זן יחסים שמחושבים קטרים פסיבי ברמות שונות של לחץ transmural).

3. הערכה של תגובות זרימת דם מוחי עם LDF

  1. עזים ומתנגד החיה עם 5% איזופלוריין ולאבטח את החולדה9,מכשיר stereotaxic10.
  2. לשמור על החיה תחת הרדמה מתמדת תוך ניטור נשימה תדר, סוף גאות CO2ועומק של הרדמה עם קמצוץ הבוהן36.
  3. בזהירות דק הגולגולת כדי המוגבהת באמצעות מהירות נמוכה מקדחת שיניים שמן מינרלי לספק צימוד אופטי10. בזהירות כדי למנוע יצירת חום עודף וכדי למנוע חדירה לעצם.
    הערה: דילול של הגולגולת מאפשר אור הלייזר להגיע הרקמה הבסיסית, יבוא לידי ביטוי בחזרה אל המכשיר על מנת למדוד את דופלר, שסדר נקבעת על ידי מספר חלקיקים נעים (קרי, כדוריות דם אדומות), המהירות שלהם.
  4. לאבטח את המכשיר LDF micromanipulator ומקמו אותו ישירות על האזור ורקמת של הגולגולת. במהלך הניסוי, חשוב מאוד למנוע תנועת החללית LDF או ההכנה עצמה, כמו LDF נועד למדוד את זרימת באזור מוגבל אחד של הרקמה, הוא רגיש מאוד חפצים תנועה.
    הערה: כל תנועה של המכשיר הרחק מעמדה הראשונית תספק הערכה של זרימת הדם באיזור שונה של הרקמה, מסלק השוואות. בעוד LDF אינו מספק ערכים זרימה מוחלטת ואינה מתאימה לשם השוואה בין הנבדקים, זה דרך מצוינת להעריך noninvasively לשינויים רקמות זלוף בתגובה התערבויות ניסיוני במקצועות בודדים; יחסית לשינויים LDF האיתות ערכי בקרה ניתן בממוצע, בהשוואה לשינויים LDF אות מ שליטה בקבוצות אחרות ניסיוני.
    הערה: LDF היא גישה נוחה כדי לזכות בתובנה גורמי ויסות זרימת הדם ברמה של המיטה כל כלי הדם קבוצות שונות ניסיוני8,9,10. הערכה של רקמות זלוף עם LDF מספק גישה פרקטית להטמיע ידע שנרכש ממחקרים כלי מבודד בפרספקטיבה כל המיטה. אלא אם כן יהיו הבדלים אזוריים מנגנוני בקרה כלי הדם בין התנגדות העורקים את microcirculation, מדידות שהושג עם LDF לספק סימן טוב של בקרת זרימה של דם רקמות כי הוא בדרך כלל בקנה אחד עם התוצאות המתקבלות עם ההכנות לצינוריות העורק.

4. הערכה של שרירי השלד צפיפות Microvessel עם GS1 לקטין

  1. הסר את השריר cremaster חולדה זכר על ידי חיתוך פתוח האשכים עם מספריים כירורגיים בסדר רגיל ולאחר מכן באמצעות מלקחיים דומונט #5 להבין את השריר.
    הערה: שרירי רזה (למשל, שריר cremaster, כמו גם את פושט האצבעות הארוך השוקתי הקדמי שרירי שנמצאו אצל חולדות גם זכר וגם נקבה) מתאימים באופן אידיאלי לשימוש כמו כל mounts ללימודים לקטין, למרות היסטולוגית סעיפים יכול לשמש בשביל לרקמות עבה יותר.
  2. הסר את השריר cremaster האשך בעזרת חתך אחד. מניחים אותה PSS כקרח ולהדק אותו בצלוחית עם בטנה elastomer סיליקון בתחתית בתוך השטח. בעדינות להקניט משם רקמת חיבור באמצעות מלקחיים דומונט #5.
  3. לשטוף את דגימות שריר עם 2 מ של PSS במאגר, ואז לטבול אותם התווית על-ידי rhodamine GS1 לקטין (20 µg/mL PSS) למשך 50 דקות בצלחת התרבות התא. ובכן 12 עם 2 מ"ל/טוב זה עטופה רדיד אלומיניום כדי לא לכלול אור.
  4. הסרת הרקמות הפתרון לקטין, לשטוף אותם שלוש פעמים ב PSS עם 5 דקות incubations "לשטוף" על כיסא נדנדה, והר אותם על שקופיות מיקרוסקופ. ודא דגירה הרקמות בחושך ולאחסן את השקופיות בחושך כדי למנוע אובדן של זריחה.
    הערה: אם אין אפשרות להשתמש השקופיות באופן מיידי, הם ניתן לשמור במקרר ללא אובדן של זריחה. לאחסון ממושך, השקופיות ניתן לשמור במקפיא כדי למנוע הידרדרות11.
  5. הערכת microvessel בצפיפות על ידי ספירת מספר הצטלבויות של microvessels שכותרתו עם קווי רשת שנוצרו על-ידי המחשב נקודות המגע המוצגים על התמונה52, או עם כיסוי הרשת ברור נקודות המגע המוצגים על המסך בשימוש להצגת השקופיות.
    הערה: GS1 לקטין גישות שימשו כדי להדגים: מלח-induced rarefaction microvascular53, ההשפעה המגנה של מניעת מלח המושרה אנגיוטנסין II דיכוי עבור שחזור microvessel צפיפות שלצאן מלח17 ,53,54; תפקידו של NRF2 תיווכה ההשפעה המגנה של מינון נמוך אנגיוטנסין II אינפוזיה למנוע microvessel rarefaction מלח-fed חולדות17; גם להעריך את התפקיד של אנגיוטנסין II בשמירה על תגובות האנגיוגנזה גירוי השריר במלח האכלת חולדות54,55. אחד היתרונות של הטכניקה לקטין GS1 הוא כי ניתן להשתמש כדי להעריך את צפיפות microvessel החיות באותה המשמש ללימודי לצינוריות התנגדות העורקים או LDF.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

במבחנה מיקרוסקופ לצינוריות התנגדות העורקים מאפשר חקר הגורמים המשפיעים על הטון הפעיל התנגדות קטן העורקים (ובכל רבים גדולים יותר) נורמלי ויוו transmural לחצים, בהיעדרו של תאים parenchymal השפעות. בנוסף מעריכים את תגובתיות של כלי לגירויים שונים מרחיב כלי דם, מצר את כלי הדם, ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאמור במבוא, מאמר זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ הטלוויזיה ואת ההתנגדות מבודד עורק גישות להעריך את תפקוד כלי הדם לא רק במודלים עכבר סטנדרטי (כמו המועסקים וידאו), אבל גם ב שהתשתית גנטית זני עכברים מהונדסים, אשר מציגות את הרומן ואת התובנות עוצמה שניתן להשיג ניצול גישות אלה. השימוש של טכניקות עו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים יש אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים אקספרס שלהם כנה תודה קייטי פינק ולין Dondlinger עבור שלהם בפז סיוע בהכנת כתב היד הזה.

תמיכה גרנט: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; #R01-HL128242.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
SS RatMedical College of WisconsinSS/JHsd/Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 5BN/Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic RatMedical College of WisconsinSS-Chr 13BN/Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic RatMedical College of WisconsinSS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic RatMedical College of WisconsinSS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic RatMedical College of WisconsinSS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type LittermatesMedical College of WisconsinSD-Nfe212em1Mcwi strainContact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76ADyets, Inc.113756
Colorado Video CaliperColorado Video, Inc.Model 308
Video CameraHitachiKPM1AN
MicroscopeOlympus Life ScienceCKX41
Television MonitorPanasonicWVBM1410
Pressure TransducersStoelting56360
Blood Pressure Display UnitStoelting50115
Cannulated Artery ChamberLiving Systems InstrumentationCH-1Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single ChamberLiving Systems InstrumentationTC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,StraightLiving Systems InstrumentationGD-MSProvides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, MiniatureLiving Systems InstrumentationOXAllows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler FlowmeterPerimedPeriFlux 5000 LDPM
GS1 LectinVector LabsRL-1102
Glass Capillary Tubes for MicropipettesFredrich Haer Co.27-33-12 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette PullerDavid Kopf InstrumentsModel 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLYAshaway Line and Twine Manufacturing Co.114-ANM-10Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-InoxFine Science Tools11254-20
Vannas ScissorsFine Science Tools15003-08
ProtandimProtandimNRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium ChlorideFisher BioreagentsBP358-212
Sodium BicarbonateFisher ChemicalS233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrousFisher ChemicalD16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)Sigma AldrichM1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)SigmaC5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)SigmaS0751-500G
Potassium Chloride (KCl)Fisher ChemicalP217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)SigmaED255-500G

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433(2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10(2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5(2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

130

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved