Valutazione dei meccanismi di controllo vascolare utilizzando Video microscopia del arterie di resistenza isolata dei ratti

Riepilogo

Questo manoscritto descrive protocolli di video microscopia in vitro per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale del ratto. Il manoscritto descrive anche tecniche per la valutazione di densità del microvessel con aspersione di lectine e tessuto fluorescente contrassegnato utilizzando flussometria del Laser Doppler.

Abstract

Questo protocollo descrive l'uso di in vitro televisione microscopia per valutare la funzione vascolare nelle arterie di resistenza cerebrale isolata (e altre navi) e vengono descritte le tecniche per valutare la perfusione tissutale mediante Laser Doppler flussometria (LDF ) e la densità del microvessel utilizzando fluorescente denominata lectina di Griffonia simplicifolia (GS1). Attuali metodi per lo studio isolato di arterie di resistenza alle pressioni incontrate transmurale in vivo e in assenza di influenze delle cellule parenchimatiche forniscono un collegamento critico tra gli studi in vivo e le informazioni acquisite da molecolare approcci riduzionisti che forniscono approfondimenti limitato di risposte integrative a livello animale intero. LDF e tecniche per identificare in modo selettivo le arteriole e capillari con fluorescente-etichetta GS1 lectina forniscono soluzioni pratiche per consentire ai ricercatori di estendere le conoscenze acquisite dagli studi delle arterie di resistenza isolata. Questo articolo descrive l'applicazione di queste tecniche per acquisire conoscenze fondamentali della fisiologia vascolare e della patologia nel ratto come modello sperimentale generale e in una varietà di specializzato geneticamente ceppi di ratti "designer" che possono fornire importante approfondire l'influenza dei geni specifici sui fenotipi vascolari importanti. Utilizzando questi approcci sperimentali preziosi in ceppi di ratti sviluppati da strategie di allevamento selettivo e nuove tecnologie per la produzione di modelli di knockout del gene nel ratto, si espanderà il rigore delle premesse scientifiche sviluppate in modelli murini knockout e estendere tale conoscenza per un modello animale più rilevante, con una priorità bassa fisiologica ben compreso e idoneità per studi fisiologici a causa delle sue dimensioni più grandi.

Introduzione

I primi studi di funzione vascolare nelle arterie utilizzate condotto arterie e in molti casi l'aorta. Generazione di forza nelle grandi arterie è stato studiato in genere allegando un segmento anello dell'arteria a un trasduttore di forza in un bagno di tessuto; nel caso dell'aorta, di taglio elicoidale strisce della nave affinché le fibre di muscolo liscio sono state orientate in senso longitudinale tra il punto di attacco e il trasduttore di forza, di fornire la migliore stima della forza generata dalla contrazione del il muscolo liscio lungo il suo asse longitudinale. La tecnica standard per il taglio elicoidale strisce delle aorte era quello di inserire un bastoncino di vetro nel lume del vaso, fare un taglio nella parete del vaso all'angolazione desiderata e resisti fino alla fine del bordo esposto della parete del vaso, come il taglio è stato esteso per produrre un'intera striscia elicoidale della nave. A quel punto, lato endoteliale della nave generalmente è stato cancellato per rimuovere detriti prima di agganciare la striscia di nave per il trasduttore di forza e sommergendo la preparazione in un ossigenato e bagno tessuto a temperatura controllata. Alla fine, che approccio ha portato a una delle scoperte più famose e importanti nella storia della fisiologia di Furchgott e osservando¹, vale a dire il ruolo dell'endotelio ha derivato il fattore rilassante (EDRF), successivamente identificato come l'ossido di azoto, in che regolano la funzione vascolare. L'evento cruciale che conduce a quella scoperta era una situazione in cui i ricercatori hanno mantenuto un endotelio intatto da evitando il contatto del lato endoteliale dell'arteria con superfici straniere e notato che la striscia aortica non ha esibito il previsto contrazione di acetilcolina (ACh), ma invece rilassato in risposta a ACh. Sulla base di tale osservazione, i ricercatori hanno sviluppato una preparazione di "sandwich" in cui hanno attaccato un segmento aortico con un endotelio intatto (ma in grado di generare forza contrattile) ad una striscia elicoidale standard dell'aorta e convertito ACh-indotta contrazione in un rilassamento.

Due importanti novità in questo settore che sono ampiamente utilizzati oggi sono lo sviluppo di preparazioni per misurare forza contrattile attiva resistenza piccole arterie^2,3 (come quelli nel mesentere intestinale³ ) e cannulati resistenza arteria preparazioni^4,5,6. In uno dei rapporti più iniziali, Mulvany e Halpern³ descritto l'impiego del filo myograph preparato per studiare la forza contrattile attiva nelle arterie di resistenza isolata dal mesentery intestinale di ratti spontaneamente ipertesi (SHR) e comandi WKY normotesi. Successivamente lo sviluppo del sistema myograph filo, cannulate resistenza arteria preparati sono stati sviluppati per consentire studi dei vasi più vicino a in vivo condizioni^4,5,6.  Mentre entrambi gli approcci forniscono risultati importanti, la preparazione dell'arteria cannulate ha il vantaggio aggiunto di più efficacemente preservare tono attivo intrinseco nelle arterie; e consentendo ai ricercatori di studiare le risposte myogenic attive ai cambiamenti nelle risposte di vaso e pressione transmurale alle variazioni di portata ed endoteliali shear stress (Vedi recensione di Halpern e Kelley⁶).

Degli obiettivi principali del presente lavoro è descrivere come impiegare la tecnica "classica" di video microscopia utilizzando isolato, cannulate resistenza arterie al fine di ottenere informazioni precise per quanto riguarda i meccanismi che regolano il tono attivo in queste cruciali vasi, indipendente da influenze delle cellule neurali, umorale o parenchimatica. Queste informazioni di base, impiegando un modello standard del ratto ed esempi dai nostri studi di nuovo geneticamente ingegnerizzati ceppi di ratti, fornirà al lettore un'idea dei tipi di approfondimenti per quanto riguarda la funzione vascolare che può essere acquisita con la televisione approcci di microscopia, e che possono essere impiegati in studi condotti su qualsiasi controllo e gruppo sperimentale di scelta dello sperimentatore, tra cui potenti nuovi modelli di ratto sperimentale prodotto da incroci selettivi e genetiche di nuova concezione tecniche di ingegneria.

Grazie alla precisione di televisione microscopia approcci, misurazione delle variazioni di diametro nelle preparazioni cannulate arteria può fornire informazioni altamente importanti meccanismi endotelio-dipendente e indipendente dall'endotelio vascolare relax, nonché importante (e a volte inaspettate) alterazioni nei meccanismi di controllo vascolare che si verificano con ipertensione, alta dieta del sale e altri interventi sperimentali. Inoltre, misurazione dei rapporti di pressione-diametro in isolato e cannulati arterie di resistenza che sono rilassate al massimo dal trattamento con Ca^{2 +}-libera soluzione o un farmaco vasodilatatore farmacologici, consente al ricercatore di valutare cambiamenti strutturali nelle arterie a causa di rimodellamento vascolare e per calcolare la sollecitazione-deformazione passiva relazioni⁷ che può fornire la comprensione importante nei cambiamenti nelle proprietà meccaniche passive delle arterie che possono influenzare la funzione arteriosa indipendente di (o in aggiunta a) cambiamenti nei meccanismi di controllo attivo. È anche importante notare che le informazioni ottenute da studi di arterie di resistenza isolata possono essere integrati da informazioni ottenute utilizzando LDF, un metodo pratico per valutare la perfusione tissutale al livello animale intero^{8,9 ,10}, e da informazioni ottenute dalla valutazione di densità del microvessel utilizzando fluorescente etichettati GS1 lectina, che si lega specificamente a moiety glicoproteina nella membrana dello scantinato di piccole arteriole e capillari^{11 , 12}. il metodo di quest'ultimo fornisce una stima molto accurata di densità del microvessel che non è soggetto alle classiche difficoltà incontrate nello stimare la densità del microvessel contando le navi in vivo, ad esempio mancanti non perfusi navi dove il flusso sanguigno è interrotto a causa di chiusura attivo delle arteriole. Quando utilizzati insieme, questi approcci possono fornire la comprensione importante per correlare le alterazioni funzionali nelle arterie di resistenza isolata ai cambiamenti nella perfusione tissutale a livello microcircolatorio; e alcuni esempi dell'uso di tali approcci preziosi in combinazione con tecniche di arteria cannulate saranno fornite anche nel presente manoscritto.

Il presente documento si concentra sull'uso di tecniche di video microscopia per valutare i cambiamenti vascolari nelle arterie dei topi Sprague Dawley nazionali. Tuttavia, è importante notare che queste tecniche hanno dimostrato di essere molto prezioso nel delucidamento alterazioni fenotipiche in ceppi di ratti geneticamente altamente specializzato creati da allevamento selettivo o gene editing utilizzando tecniche. In questo manoscritto, forniamo esempi di come il video tecniche di microscopia hanno fornito informazioni importanti per quanto riguarda la funzione vascolare in una serie di prezioso ratto modelli, compreso il ceppo di ratto-un topo inbred Dahl sale sensibili (SS) è il più ampiamente usato modello sperimentale per studiare i meccanismi di sale sensibili hypertenson^{18,19,20,21,22,23}; e consomic ratti creato tramite allevamento selettivo dei ratti di SS con il ceppo di ratto marrone Norvegia (BN) sale-insensibile. Nei pannelli del ratto consomic, ogni cromosoma dal ratto di chiavica di Brown è stato introgressi singolarmente nel background genetico Dahl SS^24,25,26 . Utilizzo di pannelli di ratto consomic ha fornito indizi preziosi per quanto riguarda specifici cromosomi che contribuiscono alla sensibilità del sale di pressione sanguigna e altri fenotipi, compreso la reattività vascolare^{24,25,26 ,27,28}.

Strategie di allevamento selettivo utilizzando ratti consomic portando singoli cromosomi BN e SS hanno anche permesso la generazione di ceppi Congenici ristretto con piccoli segmenti di singoli Brown Norvegia cromosomi introgressi negli SS Dahl genetica sfondo^22,29. Questi possono fornire estremamente preziosi input su geni specifici o restringere le regioni dei cromosomi che possono influire sulle variabili fisiologiche cruciali, come la pressione sanguigna, danno renale e reattività vascolare^22,29. Un'altra potente aggiunta alla casella degli strumenti genetici di ratto è lo sviluppo di modelli di knockout del gene del ratto utilizzando gene avanzate tra cui ZFNs, transcriptional activator-come-effector nucleasi (TALENS), tecniche di editing e più recentemente CRISPR-Cas9^{13 ,14,15,16,17}. L'avvento di queste potenti tecniche che permettono di geni essere buttato nel ratto è uno sviluppo immensamente importante perché gli studi di knockout del gene fino ad oggi hanno usato (e continuano a utilizzare) topi quasi esclusivamente. Un altro componente sperimentale nella carta attuale dimostra il valore di arteria cannulate tecniche e video microscopia di valutare i meccanismi di controllo fisiologici in topi knockout difettare la trascrizione di protezione antiossidante e cella master fattore, fattore nucleare (derivato degli eritrociti 2) - come - 2 (NRF2)^30,31, che sono stati sviluppati utilizzando la tecnologia TALEN a Sprague-Dawley background genetico¹⁷. In questi esperimenti in vitro video microscopia tecniche sono state usate per fornire la verifica funzionale di perdita del gene NRF2 e testare un approccio terapeutico potenzialmente importante basato sul diretto upregulation di NRF2-mediata antiossidante difese. NRF-2 è di notevole importanza terapeutica nella lotta contro lo sforzo ossidativo vascolare in esseri umani, alla luce dei deludenti risultati di studi clinici che coinvolgono l'amministrazione diretta di antiossidanti quali le vitamine C ed E³².

Protocollo

Il Medical College del Wisconsin istituzionali cura degli animali e uso Committee (IACUC) ha approvato tutti i protocolli descritti in questa carta e tutte le procedure sono conforme ai National Institutes of Health (NIH) ufficio di laboratorio Animal Welfare (OLAW) regolamenti.

1. preparazione di soluzioni e vaso camera

1. Prima di svolgere una serie di esperimenti, preparare 2 L di 20x concentrata soluzione madre sale composto da 278 g/L NaCl; 14 g/L KCl; 11,52 Co.GE MgSO₄^. 7H₂O; e 9,4 g/L CaCl₂^. 2H₂O. Anche preparare 2 L di 20x stock tampone concentrato composto da 80,8 g/L di NaHCO₃ e 0,4 g/L EDTA e 2L di 20x concentrata Ca^{2 +}-soluzione gratuita di stock composto da 281,6 g/L NaCl; 14 g/L KCl e 11,52 Co.GE MgSO₄^. 7H₂O.
   Nota: 20 X soluzioni di riserva può essere conservato in frigorifero fino all'uso.
2. Il giorno dell'esperimento, preparare 2 L di soluzione salina fisiologica (PSS) da 20 x concentrate soluzioni di riserva come segue: aggiungere 100 mL di 20x stock sale a 1.800 mL di acqua deionizzata in un matraccio di Erlenmeyer 2L o Becher su una piastra di agitazione motorizzata. Aggiungere 100 mL di 20 scorte x mentre vengono continuamente la soluzione con una miscela di gas contenente 21% O₂, 5% CO₂, equilibrio, N₂e mescolare con una barra di agitazione magnetica. Lentamente aggiungere 0,28 g NaH₂PO₄ durante il monitoraggio del pH; regolare se necessario a pH 7.4 con l'aggiunta di gocce di HCl N 6 o 6,5 N NaOH soluzione da una pipetta Pasteur. Dopo il PSS viene preparata e viene regolato il pH, aggiungere 1,98 g di glucosio al PSS.
   Nota: È importante aggiungere lentamente il NaH₂PO₄ Ultima durante il monitoraggio del pH del PSS, perché l'aggiunta di NaH₂PO₄ per una soluzione alcalina (pH > 7,4) potrebbe formare un precipitato di fosfato di calcio, come indicato dal aspetto di una soluzione nuvolosa o un precipitato bianco nella parte inferiore del contenitore.
   Nota: La composizione finale del PSS è 119 mM/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg₂così₄; 1.6 mM/L CaCl₂; 1,18 mM/L NaH₂PO₄; 24 mM/L NaHCO₃; 0,03 mM/L EDTA; e glucosio 5,5 mM/L. Anche se la composizione del PSS possa differire tra laboratori, questa ricetta è molto adatta per mantenere il tono vascolare, la funzione endoteliale e risposte agli agenti vasoattivi nelle arterie di resistenza isolata.
3. Per determinare il diametro massimo e per valutare il tono attivo nell'arteria producendo dilatazione massima della nave, preparare 500 mL di Ca^{2 +}-gratis PSS aggiungere 25 mL di 20 X Ca^{2 +}-gratis stock sale a 450 mL di acqua deionizzata , seguita da 25 mL di 20x scorte regolatrici in un matraccio di Erlenmeyer o Becher simile al punto 1.2. su indicato. Aggiungere alla soluzione 0,07 g di NaH₂PO₄ mentre monitorando e regolando il pH della soluzione. Il Ca^{2 +}-PSS gratuito viene aggiunto alla sezione del serbatoio e la nave PSS alla fine dell'esperimento per evitare di esaurire il Ca^{2 +} i depositi intracellulari che potrebbero influenzare le risposte di nave in PSS normale. Perché il Ca^{2 +}-soluzione gratuita è aggiunto alla fine dell'esperimento per produrre il massimo rilassamento delle arterie, non c'è nessuna necessità di aggiungere glucosio al PSS.
   Nota: Quando completato, la composizione finale del Ca^{2 +}-libero PSS è 120,6 mM/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1,17 mM/L Mg₂così₄; 1,18 mM/L NaH₂PO₄; 24 mM/L NaHCO₃; 0 mM/L CaCl₂; e 0,03 mM/L EDTA.
   Nota: Per molti studi che richiedono massima dilatazione dell'arteria, uno stampo di voce del calcio come verapamil (1 µM) e/o un donatore dell'ossido nitrico come nitroprusside del sodio (10 µM) può essere aggiunto alla soluzione, oltre a rimuovere Ca^{2 +} da PSS.
4. Mantenere il pH del PSS, PO₂e PCO₂di equilibrare continuamente il PSS che fluisce nella camera di vaso in un bagno di organo standard utilizzato per studiare gli anelli aortici isolati, muscolatura liscia intestinale o in altri tessuti (Figura 1). Utilizzare del fluoropolymer sintetico di tetrafluoroetilene tubi per collegare il serbatoio di gas al bagno dell'organo, perché questo tipo di tubo è impermeabile, a differenza di molte altre forme di tubi, per esempio, lattice gas.
5. Posto una pietra piccola aria collegato alla miscela di gas di equilibrazione nella camera di nave per aiutare a mantenere la composizione del gas PSS.
   Nota: Risposte di nave ai cambiamenti in PO₂ possono essere testate da equilibrare il PSS nella camera di nave e luminal perfusato con miscele di gas contenenti diverse percentuali di O₂, ad esempio, 21% O₂, 10% O₂, 5% O₂ e 0% O₂, con 5% CO₂ ed equilibrio N₂^33,34,35. Per più grandi arterie con pareti più spesse, dove la diffusione dell'ossigeno nel centro della parete del vaso può essere una limitazione, una percentuale maggiore di ossigeno, per esempio, 95% O₂ può essere utilizzata.
6. Monitorare la temperatura nella camera di nave da vicino, come singole camere possono variare nelle loro caratteristiche di trasferimento di calore.
   Nota: Molti alloggiamenti di nave preparati commercialmente utilizzati per lo studio delle arterie di resistenza cannulate utilizzano una pompa peristaltica per consegnare PSS ossigenato da un serbatoio di gas equilibrati e fornire un controllo molto preciso della temperatura del bagno e l'ossigenazione del il PSS.
7. Posizionare il PSS in una grande bottiglia di Mariotte (2 L), con tappo e tubo di vetro centrale per servire come un serbatoio per trasportare continuamente PSS nel bagno di organo che riscalda e gas-equilibra il PSS che fluisce nella camera di nave (Figura 1A).
8. Luogo l'apertura del tubo centrale in vetro in bottiglia Mariotte allo stesso livello come il top del PSS in un bagno d'organo per mantenere una testa di pressione idrostatica costante per la consegna di PSS nel bagno di organo. Tubazione del polietilene uso collegato ad un vetro a forma di J o tubo di plastica per consegnare il PSS dalla bottiglia Mariotte nel bagno di organo.
9. Per aspersione luminal (Figura 1A), usare tubi in polietilene per collegare la pipetta di afflusso ad un serbatoio PSS composto da una siringa da 60 cc plastica elevato a una posizione che mantiene la pressione di afflusso desiderato (solitamente 80 mmHg per gli studi del ratto cerebrale trasduttore di arterie), come misurato con una pressione collegato al sistema tramite un rubinetto di arresto.
10. Collegare la pipetta di deflusso di un tubo di polietilene per consentire la PSS di fluire attraverso il vaso in risposta ad un gradiente di pressione e collegare la linea di deflusso di un serbatoio simile al serbatoio di afflusso. Utilizzare un simile collegamento del trasduttore di pressione e rubinetto per misurare la pressione di uscita.
    Nota: Le procedure per l'impostazione di pressione transmurale e controllo del flusso attraverso il vaso sono descritti nella sezione 2, di sotto.
11. Alla fine dell'esperimento, sciacquare accuratamente la camera, linee di alimentazione e sistemi di serbatoio con acqua distillata. A intervalli frequenti, sostituire le righe della tubazione e consegna, pulire o sostituire il rubinetto di arresto del sistema e sottoporre periodicamente eventuali serbatoi PSS di vetro a un lavaggio acido per prevenire la crescita di batteri e altri microrganismi che causano la contaminazione e influisce sulla reattività di nave.

2. cannulate arteria preparazione

1. Anestetizzare un ratto Sprague-Dawley con 5% isoflurane e mantenere l'anestesia utilizzando 1,5-2,5% grado medico ossigeno³⁶. In alternativa, somministrare un'iniezione intramuscolare contenenti ketamina (75,0 mg/kg), acepromazina (2,5 mg/kg) e xilazina (10,0 mg/kg); un'iniezione intraperitoneale di pentobarbital (50-60 mg/kg); o qualsiasi altro metodo approvato di anestesia, dipendendo da protocolli e/o preferenze di investigatore.
2. Decapitare il ratto sotto anestesia profonda e rimuovere il cervello per gli studi delle arterie cerebrali resistenza.
3. Dopo la rimozione del cervello, accuratamente isolare l'arteria cerebrale media (MCA) (o altre arterie di interesse, ad esempio, dell'arteria basilare o dell'arteria cerebrale posteriore)^37,38. Per isolare l'importi compensativi monetari, posizionare il cervello supina in una capsula di Petri vetro riempito con PSS ghiacciata (Figura 2).
4. Utilizzare Allerød forbici e una pinzetta punta fine Dumont #5 per asportare la MCA dal cervello.  Pulire qualsiasi tessuto cerebrale residua da MCA usando il forcipe e trasferimento dell'arteria in una camera a temperatura controllata vaso contenente PSS come descritto in precedenza. ^{33 , 34}  .
5. Per trasferire l'arteria alla camera di nave, premere delicatamente il vaso asportato da ACA o segmento dell'arteria comunicante posteriore e attentamente posizionarlo nella camera.
   Nota: Oltre alla MCA, il sistema cannulate nave è adatto per un'ampia varietà di preparazioni dei piccoli vasi, compreso il muscolo scheletrico resistenza arterie^33,39,40, le arterie mesenteriche resistenza ^{38 , 41 , 42}e grande (primo ordine) arteriole del muscolo cremastere⁴³, nonché arteriole coronarie umane e arteriole umane ottenute da tessuto adiposo sottocutaneo durante la biopsia gluteal^{44,45, 46,47}.
6. Collegare l'arteria per la micropipetta afflusso tirandola verso la base di pipetta fino a quando la punta avanza nel lumen del MCA. Fissare l'arteria sulla pipetta di afflusso legando un ciclo preparato da una fibra di singolo filo precedentemente preso in giro da 10-0 suturare intorno all'arteria (Figura 1B). Fissare l'estremità opposta del MCA per la pipetta di deflusso stringendo un secondo anello di sutura intorno al vaso (Figura 1B).
   Nota: Posizionare i loop di sutura sulle Micropipette prima del montaggio della nave e posizionarle vicino al punto finale di allegato, consentendo loro di essere facilmente scivolato sopra l'arteria e rapidamente fissata quando la nave è in posizione, che riduce al minimo il rischio dei arteria scivolare le pipette.
   Nota: Micropipette sono preparate da tubazione capillare di vetro borosilicato (diametro esterno 2 mm; diametro interno di 1 mm e 10 cm di lunghezza) con l'estrattore micropipetta verticale. Prima di fissare l'arteria, corrispondere i diametri di punta delle micropipette quanto più possibile per evitare disallineamenti di afflusso e deflusso di resistenza del sistema di perfusione.
7. Dopo l'arteria è saldamente legato alle micropipette, usate il micrometro collegato al titolare della pipetta di afflusso per allungare l'arteria alla sua lunghezza in situ .
8. Fissare tutti i rami laterali con singoli fili presi in giro da 10-0 suturare al fine di mantenere costante la pressione nell'arteria.
9. Verificare l'assenza di perdite facendo in modo che la pressione intraluminale (transmurale) rimane costante dopo aver chiuso temporaneamente la pipetta di afflusso. Legare i rami o individuare i fori nel vaso se la pressione scende. Ripristinare la perfusione dopo aver verificato che la pressione transmurale rimane costante.
   Nota: Inserimento di una canula di arterie di resistenza isolata richiede pratica e destrezza manuale. Le principali precauzioni da osservare per evitare di rompere le pipette e per assicurarsi che l'arteria non sfilare le pipette. È importante essere gentile con le arterie isolate durante tutta la procedura, come trauma alla nave può danneggiare l'endotelio e/o interferire con la normale funzione del muscolo liscio vascolare.
10. Misurare il diametro interno dell'arteria utilizzando una configurazione di video microscopia (Figura 1A) composto da una videocamera collegata ad un microscopio per dissezione e collegato ad un micrometro dei video e un monitor televisivo (figure 1B, 1C). Questo consente all'osservatore di misurare diametri vaso manualmente inserendo le linee di riferimento mobile sulla parete interna dell'arteria e, se lo si desidera, sulla parete esterna dell'arteria pure, al fine di misurare lo spessore di parete del vaso.
    Nota: Alcuni micrometri video offrono tracciamento automatico delle dimensioni del vaso.
    Nota: Calibrare il micrometro dei video con un micrometro per microscopio e l'afflusso e deflusso trasduttori di pressione con un manometro di mercurio (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg e 200 mmHg) fra gli esperimenti al fine di assicurare misurazioni accurate della pressione del serbatoio diametro e intraluminal.
    Nota: La pressione transmurale di controllo standard per gli esperimenti del ratto MCA è 80 mmHg. Calibrazione per i livelli superiori e inferiori di pressione assicura precisione per studi di risposte myogenic ai cambiamenti in transmurale curve di pressione-diametro per pressione e passivo in arterie dilatate al massimo.
11. Regolare l'altezza dei serbatoi di afflusso e deflusso di mantenere la pressione transmurale desiderata a livello costante. Alzare il serbatoio di afflusso da una piccola quantità (< 5 mmHg) ed abbassare il serbatoio di deflusso della stessa quantità mantiene la pressione transmurale media e crea flusso di perfusione in vaso lumen⁶.
    Nota: Il serbatoio di afflusso di alzare ed abbassare il serbatoio di deflusso di uguali quantità mantiene la stessa transmurale media pressione nell'arteria di distensione, ma genera un gradiente di pressione idrostatica che provoca il flusso e shear stress nel vaso, consentendo la investigatore per valutare endotelio-dipendente risposte ai cambiamenti nella sollecitazione di taglio intraluminal in differenti gruppi sperimentali⁴⁸.
12. Per valutare le risposte myogenic e nave le risposte agli stimoli vasodilatatori, assicurarsi che l'arteria presenta un livello adatto di tono attivo (circa 40%) prima dell'esperimento. Scartare qualsiasi arterie carente tono attivo a riposo con l'eccezione di navi, per esempio, piccole arterie mesenteriche che non manifestano normalmente tono di riposo attivo.
    Nota: Per le navi che non manifestano normalmente tono spontaneo, pre-restringono le arterie di un importo equivalente utilizzando un agonista di vasocostrittori quali noradrenalina o fenilefrina. Un buon approccio alla scelta della dose dell'agonista utilizzato pre-costrizione dell'arteria è di utilizzare una dose di₅₀ CE dell'agente vasocostrittore, per esempio, norepinefrina^41,42. Tuttavia, gli agenti farmacologici vasocostrittore non dovrebbero applicarsi alle arterie che esibiscono spontanea tono attivo in condizioni di riposo.
13. Testare la reattività di endotelio-dipendente dell'arteria cannulate resistenza da misurare diametri vaso durante l'aggiunta di aumento delle concentrazioni di ACh (10^-10 M-10^-5 M) alla camera di nave. Testare la sensibilità di ossido di azoto endotelio-indipendente del muscolo liscio vascolare di misurare diametri vaso durante l'aggiunta di aumento delle concentrazioni (10^-10 M-10^-5 M) della nitroprusside del sodio del donatore di ossido nitrico per la Camera di nave.
    Nota: Sensibilità ai vasocostrittori e altri agonisti vasodilatatore può essere testata in modo simile con l'aggiunta di concentrazioni crescenti di agonista alla camera di nave.
    Nota: Oltre agli agenti vasoattivi, varie droghe, gli inibitori e altri agenti farmacologici possono essere aggiunto al bagno del tessuto e/o al perfusato luminal. Cambiamenti nel PO₂ (così come PCO₂ e pH) possono essere selettivamente somministrati a lato endoteliale o lato extra-luminal dell'arteria di equilibrazione separata del perfusato luminal con una pietra di aria collegata ad una miscela di gas calibrato diversi dalla miscela utilizzata per equilibrare il PSS nel tessuto bagno^33,34,49. Le risposte myogenic ai cambiamenti nella pressione transmurale possono essere studiate chiudendo la pipetta di deflusso e innalzamento (o abbassamento) l'altezza del serbatoio PSS collegato all'afflusso pipetta^49,50,51 a aumentare o ridurre la pressione intraluminal.
14. Per testare il ruolo dell'endotelio nella mediazione della nave risposta a stimoli specifici, rimuovere l'endotelio vascolare e confrontare le risposte di nave a quegli stimoli in presenza o assenza dell'endotelio. Per rimuovere l'endotelio, attentamente slegare l'arteria dalla pipetta deflusso e lentamente irrorare il lume dell'arteria con un bolo di aria (0,5-1,0 mL). Dopo perfusione aria, ripristinare l'aspersione PSS per deselezionare i detriti cellulari prima di ri-legare la nave per il deflusso pipetta⁴³.
    Nota: Seguendo la procedura di decumulazione endoteliale, è importante verificare che l'endotelio è rimosso dai test risposte vascolari ad un agonista (solitamente ACh) conosciuta per produrre vasodilatazione endotelio-dipendente in quel tipo di nave. Tuttavia, in determinate circostanze patologiche, dipendente dall'endotelio vasocostrittori vengono rilasciati, nel qual caso, è importante verificare che la risposta di constrictor è eliminata dopo rimozione endoteliale.
15. Alla fine dell'esperimento, è necessario determinare il diametro massimo dell'arteria con l'aggiunta di Ca^{2 +}-gratis PSS al perfusato e superfusate. Calcolare il tono riposo attivo (%) come (D_max-D (_resto) /D_max) x 100, dove D_max è il diametro massimo in presenza di Ca^{2 +}-libera soluzione e D_resto è il diametro di controllo che riposa.
    Nota: Misure di diametro delle arterie al massimo rilassate in differenti gruppi sperimentali sono preziose in confronto di tono di riposo attivo, rimodellamento strutturale (vale a dire, cambiamenti di diametro di lumen e spessore di parete) e proprietà meccaniche passive (rapporti di sforzo-deformazione calcolata da diametri passivi a diversi livelli di pressione transmurale).

3. valutazione delle risposte del flusso sanguigno cerebrale con LDF

1. Anestetizzare l'animale con 5% isoflurane e fissare il ratto in un apparato stereotassiche^9,10.
2. Mantenere l'animale in anestesia costante durante il monitoraggio di frequenza di respirazione, end tidal CO₂e profondità dell'anestesia con un pizzico di punta³⁶.
3. Con attenzione sottile il cranio alla traslucenza utilizzando un trapano odontoiatrico a bassa velocità e olio minerale per fornire accoppiamento ottico¹⁰. Cautela per evitare di generare calore eccessivo e per evitare la penetrazione dell'osso.
   Nota: Assottigliamento del cranio consente la luce laser per raggiungere il tessuto sottostante e per essere riflessa verso la sonda per misurare lo spostamento Doppler, la cui entità è determinata dal numero di particelle in movimento (cioè, globuli rossi) e la loro velocità.
4. Fissare la sonda LDF in un micromanipolatore e posizionarla direttamente sopra la zona assottigliata del cranio. Durante l'esperimento, è molto importante impedire il movimento della sonda LDF o preparato stesso, come il LDF è progettato per misurare il flusso in una zona limitata del tessuto ed è estremamente sensibile agli artefatti di movimento.
   Nota: Qualsiasi movimento della sonda dalla sua posizione iniziale fornirà una stima del flusso sanguigno in una zona diversa del tessuto, precludendo i confronti. Mentre LDF non fornisce valori assoluti per flussi e non è adatto per il confronto tra soggetti, è un ottimo modo per non invadente valutare i cambiamenti in perfusione tissutale in risposta a interventi sperimentali nei singoli soggetti; e relativi cambiamenti nel segnale LDF dai valori di controllo possono essere una media e rispetto ai cambiamenti nel segnale LDF dal controllo in altri gruppi sperimentali.
   Nota: LDF è un approccio conveniente per avere comprensione di fattori che regolano il flusso di sangue a livello del letto vascolare intero in differenti gruppi sperimentali^8,9,10. Valutazione della perfusione tissutale con LDF fornisce un approccio pratico per assimilare la conoscenza acquisita con studi vaso isolato in una prospettiva di tutto il letto. Il blocco delle differenze regionali nei meccanismi di controllo vascolare tra arterie della resistenza e la microcircolazione, misurazioni ottenute con LDF forniscono una buona indicazione di controllo di flusso di sangue del tessuto che sono generalmente coerente con i risultati ottenuti con preparazioni di arteria cannulate.

4. valutazione di densità del Microvessel del muscolo scheletrico con lectina GS1

1. Rimuovere il muscolo cremastere da un topo maschio di taglio aperto lo scroto con forbici chirurgiche bene standard e quindi utilizzando una pinza Dumont #5 per afferrare il muscolo.
   Nota: I muscoli sottili (ad esempio, il muscolo cremastere, come pure dell'estensore digitorum longus e tibiale anteriori muscoli che si trovano in ratti maschi e femminili) sono ideali per uso come tutta la monta per gli studi di lectina, sebbene istologico sezioni possono essere utilizzate per i tessuti più spessi.
2. Rimuovere il muscolo cremastere dal testicolo utilizzando un solo taglio. Inserirlo nella gelida PSS e pin fuori in una capsula di Petri con un rivestimento di elastomero in silicone sul fondo superficie interna. Delicatamente prendere in giro lontano tessuto connettivo usando il forcipe Dumont #5.
3. Sciacquare i campioni di muscolo con 2 mL di PSS tamponata e poi immergerli in rodamina-etichetta GS1 lectin (PSS 20 µ g/mL) per 50 min in una piastra di coltura delle cellule 12-pozzetti con 2ml/ben avvolto in carta stagnola per escludere la luce.
4. Rimuovere i tessuti dalla soluzione lectina, sciacquare tre volte in PSS con 5 min "lavare" le incubazioni su un rocker e montarli su vetrini da microscopio. Assicurarsi di incubare i tessuti nel buio e conservare i vetrini al buio per prevenire la perdita di fluorescenza.
   Nota: Se le diapositive non possono essere utilizzate immediatamente, essi possono essere tenuti in frigorifero senza perdita di fluorescenza. Per una conservazione prolungata, le diapositive possono essere tenute in un congelatore per prevenire il deterioramento¹¹.
5. Valutare la densità del microvessel contando il numero di intersezioni tra i microvasi etichettati con linee di griglia computerizzata sovrapposte l' immagine⁵², o con una sovrapposizione di Cancella griglia sovrapposta il monitor viene utilizzato per visualizzare le diapositive.
   Nota: GS1 lectina approcci sono stati utilizzati per dimostrare: indotta da sale microvascolare rarefazione⁵³, l'effetto protettivo di prevenire sale indotta soppressione dell'angiotensina II nel ripristino di densità del microvessel in animali alimentati sale^{17 ,53,54}; il ruolo di NRF2 che mediano l'effetto protettivo di infusione dose bassa dell'angiotensina II per impedire la rarefazione del microvessel in ratti sale-federazione¹⁷; e anche per valutare il ruolo di angiotensina II nel mantenere risposte angiogeniche alla stimolazione muscolare cronica in sale fed ratti^54,55. Uno dei vantaggi della tecnica di lectin del GS1 è che può essere utilizzato per valutare la densità del microvessel negli stessi animali utilizzati per studi di arterie di resistenza cannulate o LDF.

Risultati

In vitro la microscopia del arterie della resistenza cannulate permette per lo studio dei fattori che influenzano il tono attivo nelle arterie di piccola resistenza (e più grande arteriole) alle pressioni di transmurale normale in vivo e in assenza di cellule parenchimatiche influenze. Oltre a valutare la reattività dei vasi ai vari stimoli vasodilatatori e vasocostrittori e risposte myogenic all'elevazione di pressione transmurale in normale PSS, il Ca^{2 +}-P...

Discussione

Come indicato nell'introduzione, questo articolo descrive l'uso di microscopia di televisione e dell'arteria resistenza isolata si avvicina per valutare la funzione vascolare non solo nei modelli standard del ratto (come impiegato nel video), ma anche in altamente specializzata geneticamente ceppi di ratti ingegnerizzati, che mostrano il romanzo e le intuizioni potente che possono essere acquisite utilizzando questi approcci. L'utilizzo di queste potenti tecniche per valutare il tono attivo e passivo proprietà meccanich...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS Rat	Medical College of Wisconsin	SS/JHsd/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat	Medical College of Wisconsin	SS-Chr 5BN/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat	Medical College of Wisconsin	SS-Chr 13BN/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates	Medical College of Wisconsin	SD-Nfe212em1Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.	113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.	113756
Colorado Video Caliper	Colorado Video, Inc.	Model 308
Video Camera	Hitachi	KPM1AN
Microscope	Olympus Life Science	CKX41
Television Monitor	Panasonic	WVBM1410
Pressure Transducers	Stoelting	56360
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Cannulated Artery Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1	Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber	Living Systems Instrumentation	TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight	Living Systems Instrumentation	GD-MS	Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature	Living Systems Instrumentation	OX	Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin	Vector Labs	RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes	Fredrich Haer Co.	27-33-1	2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY	Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.	114-ANM-10	Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Scissors	Fine Science Tools	15003-08
Protandim	Protandim		NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous	Fisher Chemical	D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)	Sigma Aldrich	M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)	Sigma	C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)	Sigma	S0751-500G
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Chemical	P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	ED255-500G