Évaluation des mécanismes de contrôle vasculaire utilisant la microscopie vidéo des artères de résistance isolée de Rats

Résumé

Ce manuscrit décrit les protocoles de microscopie vidéo in vitro pour l’évaluation de la fonction vasculaire dans les artères de résistance cérébral de rat. Le manuscrit décrit également les techniques pour l’évaluation des microvaisseaux densité avec la perfusion lectine et tissu fluorescent étiquetée à l’aide de débitmétrie Doppler Laser.

Résumé

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie television in vitro pour évaluer la fonction vasculaire dans les artères isolées de résistance cérébrale (et d’autres bateaux) et décrit les techniques permettant d’évaluer la perfusion tissulaire en utilisant le Laser Doppler débitmétrie (LDF ) et densité microvaisseaux utilisant fluorescent étiqueté lectine de Griffonia simplicifolia (GS1). Les méthodes actuelles pour l’étude isolement des artères de résistance au transmurale pressions rencontrées en vivo et en l’absence de cellules parenchymateuses influences fournissent un lien essentiel entre les études in vivo et les renseignements obtenus à partir de moléculaire approches réductionnistes qui donnent un aperçu limité de réponses intégratives au niveau animaux. LDF et techniques pour identifier sélectivement les artérioles et capillaires avec fluorescent marqué GS1 lectine fournissent des solutions pratiques pour permettre aux enquêteurs d’étendre les connaissances tirées de l’étude des artères de résistance isolée. Cet article décrit l’application de ces techniques d’acquérir des connaissances fondamentales de la physiologie vasculaire et de la pathologie chez le rat comme modèle expérimental général et dans une variété de spécialisées génie les souches de rats « designer » qui peuvent fournir important aperçu de l’influence des gènes spécifiques sur les phénotypes vasculaires importants. Utilisant ces approches expérimentales précieux dans les souches de rats mis au point par des stratégies de reproduction sélective et nouvelles technologies de production de modèles de knock-out du gène chez le rat, élargira la rigueur des scientifiques locaux mis au point dans les modèles de souris knock-out et étendre cette connaissance à un modèle animal plus pertinent, avec un contexte physiologique bien compris et les qualités d’études physiologiques en raison de sa plus grande taille.

Introduction

Les premières études de la fonction vasculaire dans les artères de conduit artères utilisées et dans de nombreux cas, l’aorte. Mise sur pied dans les grosses artères a été généralement étudiée en attachant un segment de l’anneau de l’artère d’un capteur de force dans un bain de tissu ; dans le cas de l’aorte, par une coupe hélicoïdale bandes du navire afin que les fibres musculaires lisses étaient orientés dans la direction longitudinale entre le point d’attache et le capteur de force, de fournir la meilleure estimation de la force générée par la contraction de le muscle lisse le long de son axe longitudinal. La technique standard pour la découpe de bandes hélicoïdales d’aortes consistait à placer une baguette de verre dans la lumière du vaisseau, faire une incision dans la paroi des vaisseaux sur l’angle désiré et accrochez-vous à la fin du bord de la paroi des vaisseaux exposé comme la coupe a été étendue afin de produire l’intégralité d’une bande hélicoïdale du navire. À ce moment-là, la face endothéliale du navire était généralement effacée afin d’éliminer les débris avant de fixer la bande du navire pour le capteur de force et submergeant la préparation dans une oxygéné et préparation tissulaire à température contrôlée. Finalement, qu’approche conduit à une des découvertes plus célèbres et importants dans l’histoire de la physiologie par Robert Furchgott et Zawadski¹, à savoir le rôle de l’endothélium dérivé facteur relaxant (EDRF), par la suite identifié comme l’oxyde nitrique, dans régulation de la fonction vasculaire. L’événement crucial ayant mené à cette découverte est une situation dans laquelle les enquêteurs maintient un endothélium intact en évitant le contact du côté de l’artère avec surfaces étrangères endothélial et remarqué que les bandes d’aortes ne montrent pas les attendus contraction à l’acétylcholine (ACh), mais plutôt détendu en réponse à l’ACh. Basé sur cette observation, les enquêteurs ont mis au point une préparation « sandwich » dans laquelle ils ont attachaient un segment aortique avec un endothélium intact (mais il est incapable de générer une force contractile) sur une bandelette hélicoïdale standard de l’aorte et converti induite par l’ACh contraction dans une détente.

Deux avancées majeures dans ce domaine qui sont largement utilisées aujourd'hui sont le développement de préparations pour mesurer la force contractile active dans la résistance petites artères^2,3 (comme dans le mésentère intestinal³ ) et canulé résistance artère préparations^4,5,6. Dans un des premiers rapports, Mulvany et Halpern³ décrit l’utilisation de la préparation de myographe fil pour étudier la force contractile active dans les artères de résistance isolée du mésentère intestinal des rats spontanément hypertendus (SHR) et contrôles WKY normotendus. À la suite de l’élaboration du système fil myographe, préparations d’artères de résistance canulés ont été développées afin de permettre des études des vaisseaux plus près en vivo conditions^4,5,6.  Alors que les deux approches fournissent des résultats précieux, la préparation de l’artère canulées a l’avantage supplémentaire de plus effectivement préserver tonus actif intrinsèque dans les artères ; et en permettant aux chercheurs de l’étude actives myogènes réactions aux changements transmurale pression et navire réponses aux variations de débit et endothéliale contrainte de cisaillement (voir examen de Halpern et Kelley⁶).

Des principaux objectifs du présent document sont de décrire comment employer la technique séculaire des artères de résistance isolés, canulées microscopie vidéo afin d’obtenir des informations précises quant aux mécanismes qui régulent la tonalité active dans ces crucial navires, indépendantes des influences de cellules neurales, humorale ou parenchymateux. Cette information de base, utilisant un modèle de rat standard et des exemples de nos études de nouveau génétiquement machiné des souches de rats, fournira au lecteur une idée des types de la perspicacité au sujet de la fonction vasculaire qui peut être obtenu avec la télévision méthodes de microscopie, et qui peuvent être utilisés dans les études impliquant n’importe quel contrôle et expérimentales ou les groupes de choix de l’enquêteur, y compris les puissants nouveaux modèles expérimentaux rat produit par consanguinité sélective et nouvellement développé génétique techniques d’ingénierie.

Grâce à la précision des méthodes de microscopie de télévision, mesure des changements de diamètre dans des préparations d’artères canulées peut fournir des informations très utiles concernant les mécanismes de l’endothélium-dépendante et indépendante de l’endothélium de vasculaire relaxation, ainsi que des modifications importantes (et parfois inattendues) dans les mécanismes de contrôle vasculaire survenant avec l’hypertension, régime hypersodé et autres interventions expérimentales. En outre, mesure des relations pression-diamètre en isolé et canulé artères de résistance qui sont détendus au maximum par un traitement avec Ca^{2 +}-gratuit solution ou un médicament vasodilatateur pharmacologique, permet à l’enquêteur d’évaluer changements structurels dans les artères en raison de remodelage vasculaire et pour calculer la contrainte passive relations⁷ qui peut donner un aperçu important de changements des propriétés mécaniques passives des artères qui peuvent affecter la fonction artérielle autonome de (ou en plus) changements dans les mécanismes de contrôle actif. Il est également important de noter qu’information tirée des études des artères de résistance isolée peut être complétée par les informations obtenues utilisant LDF, une méthode pratique pour l’évaluation de la perfusion tissulaire à l’animal tout niveau^{8,9 ,10}, et de l’information obtenue grâce à l’évaluation des microvaisseaux de densité à l’aide de fluorescent étiqueté lectine de GS1, qui se lie spécifiquement aux portions de glycoprotéine dans les membranes basales des petites artérioles et capillaires^{11 , 12}. la dernière méthode fournit une estimation très précise des microvaisseaux densité qui ne relève pas des classiques difficultés rencontrées dans l’estimation de densité des microvaisseaux en comptant les navires en vivo, par exemple manquant non perfusés navires où le débit sanguin est arrêté en raison de la fermeture active des artérioles. Utilisés ensemble, ces approches peuvent fournir un aperçu important pour mettre en corrélation les altérations fonctionnelles dans les artères isolées de résistance aux changements de perfusion tissulaire au niveau microcirculatoire ; et quelques exemples de l’utilisation de ces approches précieux conjointement avec artère canulées techniques seront également fournis dans le présent manuscrit.

Le présent document met l’accent sur l’utilisation des techniques de microscopie vidéo pour évaluer des changements vasculaires dans les artères des rats Sprague-Dawley non consanguins. Cependant, il est important de noter que ces techniques se sont avérés pour être très utiles dans l’élucidation des altérations phénotypiques de souches hautement spécialisés rat génétiquement créés par reproduction sélective ou de gène en utilisant des techniques d’édition. Dans ce manuscrit, nous fournir des exemples des techniques de microscopie vidéo comment ont fourni des renseignements importants au sujet de la fonction vasculaire dans un certain nombre de rat précieux modèles, dont la souche de rat-an consanguins rat Dahl sensibles au sel (SS) qui est le plus largement modèle expérimental permettant d’étudier les mécanismes du sel hypertenson sensible^{18,19,20,21,22,23}; et les rats de tendance créés par reproduction sélective des rats SS avec la souche de rat Brown Norway (BN) sel-insensible. Dans les panneaux de rat tendance, chaque chromosome chez le rat Brown Norway a été introduits individuellement dans le bagage génétique Dahl SS^24,25,26 . Utilisation de panneaux de rat tendance a fourni des indices précieux sur les chromosomes spécifiques qui contribuent au sel sensibilité de la pression artérielle et d’autres phénotypes, y compris la vasoréactivité^{24,25,26 ,27,28}.

Stratégies de reproduction sélective utilisant SS rats et rats de toutes porteuses de chromosomes individuels de BN ont également permis la génération de souches congéniques rétrécie avec petits segments d’individuels Brown Norvège chromosomes introduits dans la SS Dahl génétique fond^22,29. Ceux-ci peuvent fournir des gènes spécifiques extrêmement précieux d’entrée sur ou réduire leur régions des chromosomes qui peuvent affecter les variables physiologiques essentiels, tels que l’hypertension, lésions rénales et réactivité vasculaire^22,29. Un autre plus puissant à la boîte à outils génétique du rat est le développement de modèles de rats gène knockout utilisant avancée gène édition techniques y compris ZFNs, transcriptionnelles activator-like-effecteur nucléases (TAPS) et plus récemment CRISPR-Cas9^{13 ,14,15,16,17}. L’avènement de ces techniques puissantes qui permettent des gènes d’être assommé chez le rat est une évolution extrêmement importante parce que le gène knockout études à ce jour ont utilisé (et continuent à utiliser) souris presque exclusivement. Une autre composante expérimentale dans le présent document démontre la valeur des techniques de l’artère canulés et microscopie vidéo afin d’évaluer les mécanismes de contrôle physiologique chez les rats knockout manque la transcription de protection antioxydante et cellule maître facteur, facteur nucléaire (2 dérivés érythroïdes) - like - 2 (NRF2)^30,31, qui ont été développés à l’aide de la technologie TALEN dans le bagage génétique de Sprague-Dawley¹⁷. Dans ces expériences, techniques de microscopie vidéo in vitro ont été utilisés pour assurer la vérification fonctionnelle de la perte du gène NRF2 et tester une approche thérapeutique potentiellement précieuse basée sur directe upregulation de NRF2-mediated antioxidant défenses. NRF-2 est de grande importance thérapeutique dans la lutte contre le stress oxydant vasculaire chez les humains, à la lumière des résultats décevants des essais cliniques portant sur l’administration directe d’antioxydants comme les vitamines C et E,³².

Protocole

Le Medical College of Wisconsin Institutional Animal Care et à l’utilisation Comité (IACUC) a approuvé tous les protocoles décrits dans le présent document et toutes les procédures sont en conformité avec les National Institutes of Health (NIH) Office de laboratoire Animal Welfare (OLAW) règlement d’exécution.

1. préparation des Solutions et chambre de navire

1. Avant d’effectuer une série d’expériences, préparer 2 L de 20 x concentré salin stock composé de 278 g/L de NaCl ; 14 g/L KCl ; 11,52 g/L MgSO₄^. 7H₂O ; et 9,4 g/L de CaCl₂^. 2H₂O. Aussi préparer 2 L de 20 x stock tampon concentré composé de 80,8 g/L de NaHCO₃ et EDTA de 0,4 g/L et 2 L de 20 x concentré Ca^{2 +}-gratuite solution stock comprenant 281,6 g/L de NaCl ; 14 g/L KCl et 11,52 g/L MgSO₄^. 7H₂O.
   Remarque : 20 X solutions mères peuvent être stockés dans le réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.
2. Le jour de l’expérience, préparer 2 L de solution saline physiologique (PSS) de 20 x solutions concentrées de stock comme suit : ajouter 100 mL de 20 x stock sel à 1 800 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L ou un bécher sur un plateau vibrant motorisé. Ajouter 100 mL de stock de réserve x 20 tout en équilibre en permanence la solution avec un mélange gazeux contenant 21 % O₂, 5 % de CO₂, équilibre N₂et en remuant avec un barreau d’agitateur magnétique. Ajouter lentement 0,28 g NaH₂PO₄ tout en contrôlant le pH ; ajuster au besoin à pH 7,4 en ajoutant des gouttes de HCl N 6 ou 6,5 solution de NaOH N d’une pipette Pasteur. Une fois le PSS est établi et le pH est ajusté, ajouter 1,98 g de glucose à la PSS.
   Remarque : Il est important d’ajouter lentement le NaH₂PO₄ dernière tout en contrôlant le pH du SSP, parce que l’ajout de NaH₂PO₄ à une solution alcaline (pH > 7,4) pourraient former un précipité de phosphate de calcium, comme en témoigne le apparition d’une solution trouble ou un précipité blanc dans le fond du récipient.
   Remarque : La composition finale du PSS est 119 mM/L de NaCl ; 4. 7 mM/L KCl ; 1,17 mM/L Mg₂SO₄; 1,6 mM/L CaCl₂; 1,18 mM/L NaH₂PO₄; 24 mM/L NaHCO₃; 0,03 mM/L EDTA ; et 5,5 mM/L de glucose. Bien que la composition du PSS peut différer entre les laboratoires, cette recette est parfaitement adaptée au maintien du tonus vasculaire, la fonction endothéliale et réponses aux agents vasoactifs dans les artères de résistance isolée.
3. Pour déterminer le diamètre maximal et d’évaluer le tonus actif dans l’artère en produisant une dilatation maximale du bateau, préparer 500 mL de Ca^{2 +}-gratuits PSS en ajoutant 25 mL de la 20 X Ca^{2 +}-free stock sel à 450 mL d’eau désionisée , puis 25 mL 20 x stock régulateur dans une fiole Erlenmeyer ou un bécher similaire à l’étape 1.2 ci-dessus. Ajouter 0,07 g de NaH₂PO₄ à la solution tout en surveillance et en ajustant le pH de la solution. Le Ca^{2 +}-PSS gratuit est ajouté à la chambre PSS de réservoir et le navire à la fin de l’expérience pour éviter l’épuisement de Ca^{2 +} des réserves intracellulaires qui pourraient affecter les réponses de navire en PSS normal. Parce que la Ca^{2 +}-solution gratuite est ajouté à la fin de l’expérience pour produire une détente maximum des artères, il n’y a pas besoin d’ajouter le glucose pour le SSP.
   Remarque : Lorsque terminé, la composition finale du Ca^{2 +}-PSS gratuit est 120,6 mM/L de NaCl ; 4. 7 mM/L KCl ; 1,17 mM/L Mg₂SO₄; 1,18 mM/L NaH₂PO₄; 24 mM/L NaHCO₃; 0 mM/L CaCl₂; et 0,03 mM/L EDTA.
   Remarque : Pour de nombreuses études nécessitant une dilatation maximum de l’artère, un bloqueur d’entrée de calcium comme le vérapamil (1 µM) et/ou un donneur de monoxyde d’azote comme le nitroprussiate de sodium (10 µM) peut être ajouté à la solution, en plus de retirer Ca^{2 +} le SSP.
4. Maintenir les PO₂et BCP₂pH du SSP par équilibration continuellement le PSS qui se jettent dans la chambre du bateau dans un bain d’orgue standard utilisé pour étudier les anneaux aortiques isolés, muscle lisse intestinal ou autres tissus (Figure 1). Synthétique polymère fluoré de tétrafluoroéthylène tube permet de raccorder le réservoir d’essence à la préparation car ce type de tube est imperméable, contrairement à beaucoup d’autres formes de tubes, par exemple, latex de gaz.
5. Placer un petit air Pierre connecté pour le mélange de gaz d’équilibration dans la chambre de navire pour aider à maintenir la composition des gaz PSS.
   NOTE : Réactions de navire aux changements PO₂ peuvent être testées par équilibration le PSS dans la chambre de navire et le perfusat luminal avec des mélanges de gaz contenant des pourcentages différents d’O₂, par exemple, 21 % O₂, 10 % O₂, 5 % O₂ et 0 % O₂, avec 5 % CO₂ et équilibre N₂^33,34,35. Pour les plus grandes artères avec des murs plus épais, où la diffusion de l’oxygène dans le centre de la paroi des vaisseaux peut-être être une limitation, un pourcentage plus élevé d’oxygène, par exemple, 95 % O₂ peut être utilisé.
6. Suivre de près, la température de la chambre de navire comme chambres individuelles peuvent varier dans leurs caractéristiques de transfert de chaleur.
   Remarque : Plusieurs chambres de navire préparés commercialement utilisées pour l’étude des artères de résistance canulées utilisent une pompe péristaltique pour livrer PSS oxygéné provenant d’un réservoir de gaz-équilibrés et fournir un contrôle très précis de la température du bain et l’oxygénation du le SSP.
7. Placer le PSS dans une grande bouteille de Mariotte (2 L), avec un bouchon et un tube de verre central pour servir de réservoir à continuellement offrir PSS dans le bain d’orgue qui chauffe et gaz-équilibre le PSS qui se jettent dans la chambre de navire (Figure 1 a).
8. Placez l’ouverture du tube central de verre dans la bouteille de Mariotte au même niveau que le dessus du SSP dans le bain de l’orgue, de maintenir une tête de pression hydrostatique constante pour la livraison du PSS dans la préparation. Tuyaux en polyéthylène utilisation connecté à un verre en forme de J ou tube en plastique pour livrer le SSP de la bouteille de Mariotte dans le bain de l’orgue.
9. Pour perfusion luminale (Figure 1 a), utilisez en polyéthylène pour connecter la pipette d’entrée à un réservoir PSS composé d’une seringue de 60 cc plastique élevé à une position qui maintient la pression d’entrée souhaitée (généralement 80 mmHg pour l’étude de rat cérébrale transducteur (artères), telle que mesurée avec une pression connecté au système via un robinet d’arrêt.
10. Branchez la pipette de sortie dans un tube de polyéthylène pour permettre le PSS s’écouler à travers le navire en réponse à un gradient de pression et la ligne de sortie jusqu'à un réservoir similaire vers le réservoir de l’afflux. Utiliser une connexion de capteur pression et robinet d’arrêt similaire pour mesurer la pression de sortie.
    NOTE : Procédures de réglage de la pression transmurale et contrôle du flux dans le vaisseau sont décrites à l’article 2 ci-dessous.
11. À la fin de l’expérience, bien rincer la chambre, lignes de livraison et les systèmes de réservoir avec de l’eau distillée. À intervalles réguliers, remplacer les lignes tubes de production et de livraison, propres ou remplacer les robinets d’arrêt du système et périodiquement sous réserve des réservoirs PSS de verre un lavage acide pour empêcher la croissance des bactéries et autres micro-organismes qui causent la contamination et affecter la réactivité de navire.

2. canulées artère préparation

1. Anesthésier un rat Sprague-Dawley avec 5 % isoflurane et maintenir l’anesthésie à l’aide de 1,5 à 2,5 % de l’oxygène de qualité médicale³⁶. Vous pouvez également administrer une injection intramusculaire contenant acépromazine (2,5 mg/kg), la kétamine (75,0 mg/kg) et xylazine (10,0 mg/kg) ; une injection intrapéritonéale de pentobarbital (50 à 60 mg/kg) ; ou toute autre méthode approuvée de l’anesthésie, selon des protocoles ou des préférences de l’enquêteur.
2. Décapiter le rat sous anesthésie profonde et enlever le cerveau pour l’étude des artères de résistance cérébral.
3. Après l’ablation du cerveau, soigneusement isoler l’artère cérébrale moyenne (MCA) (ou autres artères d’intérêt, par exemple, artère basilaire ou artère cérébrale postérieure)^37,38. Pour isoler les MCAs, placer le cerveau en décubitus dorsal dans une boîte de Pétri verre rempli de PSS glacee (Figure 2).
4. Ciseaux de Vannas utilisation et une pince Dumont #5 de pointe fine d’annexer le MCA du cerveau.  Nettoyer n’importe quel tissu de cerveau résiduelle de l’ACM à l’aide de la pince et transférer l’artère dans une chambre de navire contrôlées de température contenant PSS comme décrit précédemment. ^{33 , 34}  .
5. Pour transférer l’artère à la chambre de navire, tenez délicatement le navire excisé de l’ACA ou le segment postérieur de l’artère communicante et placez-le soigneusement dans la chambre.
   NOTE : En plus de la MCA, le système canulé navire convient pour une grande variété de préparations de petit bateau, y compris le muscle squelettique résistance artères^33,39,40, artères mésentériques résistance ^{38 , 41 , 42}et du grand (premier ordre) artérioles muscle cremaster⁴³, ainsi que des artérioles coronaires humains et artérioles humaines provenant du tissu adipeux sous-cutané au cours de la biopsie fessier^{44,45, 46,47}.
6. Fixez l’artère à la micropipette afflux en le tirant vers la base de la pipette jusqu'à ce que la pointe des avances dans la lumière de la MCA. Fixez l’artère sur la pipette de l’afflux en attachant une boucle préparée à partir d’une fibre simple brin précédemment taquinée de 10-0 sutures autour de l’artère (Figure 1 b). Fixez l’extrémité opposée de la MCA à la pipette de l’écoulement en serrant une deuxième boucle de suture autour du navire (Figure 1 b).
   NOTE : Placer les boucles de suture sur les micropipettes avant de monter le navire et positionnez-les à proximité du point final de l’attachement, ce qui leur permet d’être facilement glissé sur l’artère et rapidement obtenu lorsque le navire est en position, qui minimise le risque de la artère en faisant glisser les pipettes.
   NOTE : Micropipettes sont préparés de tubes capillaires de verre borosilicate (diamètre intérieur de 1 mm, 2 mm de diamètre extérieur ; 10 cm de long) à l’aide d’une verticale de micropipettes. Avant de fixer l’artère, correspondent les diamètres de la pointe des micropipettes autant que possible pour éviter les incompatibilités de la résistance d’entrée et de sortie dans le système de perfusion.
7. Après que l’artère est solidement amarrée aux micropipettes, utilisez le micromètre connecté à la titulaire de pipette afflux d’étirer l’artère pour sa longueur in situ .
8. Attacher toutes les branches latérales avec simples brins taquinés de sutures de 10-0 afin de maintenir une pression constante dans l’artère.
9. Vérifier l’absence de fuites en veillant à ce que la pression intraluminale (transmurale) reste constante après avoir fermé temporairement la pipette afflux. Attacher les branches ou recherchez les trous dans la cuve si la pression chute. Restauration de perfusion après avoir vérifié que la pression transmurale reste constante.
   Remarque : Le cathétérisme des artères de résistance isolée nécessite le pratique et dextérité manuelle. Les principales précautions à observer sont pour éviter de casser les pipettes et pour s’assurer que l’artère ne glisse pas hors les pipettes. Il est important d’être doux avec les artères isolées pendant toute la procédure, comme un traumatisme au navire peut endommager l’endothélium et/ou interférer avec la fonction normale du muscle lisse vasculaire.
10. Mesurer le diamètre interne de l’artère en utilisant une configuration de microscopie vidéo (Figure 1 a) composé d’une caméra vidéo associé à un microscope à dissection et connecté à un micromètre vidéo et un écran de télévision (Figures 1 b, 1C). Cela permet à l’observateur mesurer les diamètres de navire manuellement en plaçant des lignes de référence mobile sur la paroi interne de l’artère et, si vous le souhaitez, sur la paroi externe de l’artère ainsi, afin de mesurer l’épaisseur de paroi de navire.
    NOTE : Quelques micromètres vidéo offrent un suivi automatique des dimensions du navire.
    NOTE : Calibrer le micromètre vidéo avec un micromètre de microscope et l’entrée et sortie des capteurs de pression avec un manomètre de mercure (mm Hg 0 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg et 200 mmHg) entre les expériences afin d’assurer des mesures précises de pression de diamètre et intraluminale de navire.
    Remarque : La pression transmurale de contrôle standard pour des expériences MCA de rat est de 80 mmHg. Étalonnage des niveaux de pression supérieur et inférieur assure précision pour les études de myogènes réactions aux changements transmurale des courbes pression-diamètre passive et de la pression dans les artères dilatées au maximum.
11. Régler la hauteur de l’entrée et sortie des réservoirs à maintenir la pression transmurale désirée à un niveau constant. Soulever le réservoir d’entrée par une petite quantité (< 5 mmHg) et l’abaissement du réservoir de l’écoulement du même montant maintient la pression transmurale moyenne et crée le débit de perfusion dans le lumen de bateau⁶.
    Remarque : Soulever le réservoir de l’afflux et réduisant le réservoir de l’écoulement de quantités égales maintient la même transmurale moyenne pression dans l’artère de distension, mais génère un gradient de pression hydrostatique qui provoque des flux et la contrainte de cisaillement dans le vaisseau, ce qui permet la enquêteur pour évaluer les réponses endothélium-dépendante à l’évolution de la contrainte de cisaillement intraluminale dans différents groupes expérimentaux⁴⁸.
12. Pour évaluer les réponses myogéniques et navire réponses aux stimuli vasodilatateur, assurez-vous que l’artère présente un degré acceptable de tonalité active (environ 40 %) avant l’expérience. Jeter les artères manque de tonus actif au repos à l’exception des navires, par exemple, petites artères mésentériques qui ne présentent pas normalement ton repos actif.
    Remarque : Pour les navires qui ne présentent pas normalement ton spontané, pré se contractent les artères d’un montant équivalent utilisant un agoniste vasoconstricteurs tels que la noradrénaline ou de la phényléphrine. Une bonne approche pour choisir la dose de l’agoniste utilisé préalablement constriction de l’artère est d’utiliser une dose de₅₀ EC de l’agent vasoconstricteur, par exemple, la norépinéphrine^41,,⁴². Cependant, agents vasoconstricteurs pharmacologiques ne devraient pas être appliquées aux artères qui présentent un tonus actif spontané sous conditions de repos.
13. Test de réactivité endothélium-dépendante de l’artère de résistance canulées en mesurant le diamètre du vaisseau lors de l’ajout de concentrations croissantes de ACh (10^-10 M-10^-5 M) à la chambre de navire. Tester la sensibilité de l’oxyde nitrique indépendante de l’endothélium du muscle lisse vasculaire en mesurant le diamètre du vaisseau lors de l’ajout de concentrations croissantes (10^-10 M-10^-5 M) du nitroprussiate de sodium donneur d’oxyde nitrique à la chambre de navire.
    NOTE : Sensibilité aux agents vasoconstricteurs et d’autres agonistes de vasodilatateurs peut être testée de manière similaire en ajoutant des concentrations croissantes de l’agoniste à la chambre de navire.
    Remarque : En plus d’agents vasoactifs, divers médicaments inhibiteurs et autres agents pharmacologiques peuvent être ajoutés à la préparation tissulaire et/ou le perfusat luminal. Changements PO₂ (ainsi que BCP₂ et pH) peuvent être sélectivement administrés à la face endothéliale ou le côté extra-luminale de l’artère par équilibration distincte du perfusat luminal avec une pierre à air relié à un mélange de gaz calibré différent du mélange utilisé pour équilibrer le SSP dans le tissu bain^33,34,49. Myogènes réponses aux changements dans la pression transmurale peuvent être étudiés en fermant la pipette de sortie et de lever (ou baisser) la hauteur du réservoir PSS relié à l’afflux pipette^49,50,51 à Augmentez ou diminuez la pression intraluminale.
14. Pour évaluer le rôle de l’endothélium dans la médiation navire réponses à des stimuli spécifiques, retirez l’endothélium vasculaire et comparer les réponses de navire à ces stimuli en présence ou en absence de l’endothélium. Pour supprimer l’endothélium, soigneusement délier l’artère de la pipette d’écoulement et perfuse lentement la lumière de l’artère avec un bol d’air (0,5 à 1,0 mL). Après la perfusion de l’air, restauration de perfusion PSS pour dégager les débris cellulaires avant de ré-attacher le navire à la pipette de sortie⁴³.
    Remarque : En suivant la procédure de dénudation endothéliale, il est important de vérifier que l’endothélium est supprimé en testant des réponses vasculaires à un agoniste (habituellement ACh) connu pour sa production de vasodilatation dépendante de l’endothélium dans ce type de navire. Toutefois, dans certaines conditions pathologiques, dépendante de l’endothélium vasoconstricteurs sont libérés, dans ce cas, il est important de vérifier que la réponse constrictrice est éliminée après ablation endothéliale.
15. À la fin de l’expérience, déterminer le diamètre maximal de l’artère en ajoutant Ca^{2 +}-gratuits PSS le perfusat et liquide. Calculer ton repos actif (%) comme (D_max-D (_repos) /D_max) x 100, où D_max est le diamètre maximum en présence de Ca^{2 +}-une solution et D_reste est le diamètre de contrôle au repos.
    NOTE : Mesures du diamètre des artères au maximum détendus dans différents groupes expérimentaux sont précieux en comparant le tonus de repos actif, rénovation structurelle (p. ex., changements de diamètre épaisseur et lumen de mur) et les propriétés mécaniques passives (relations contrainte-déformation calculée à partir des diamètres passives à différents niveaux de pression transmurale).

3. évaluation des réponses du débit sanguin cérébral avec LDF

1. Anesthésier l’animal avec 5 % isoflurane et fixer le rat dans un appareil stéréotaxique^9,10.
2. Maintenir l’animal sous anesthésie constante tout en contrôlant la fréquence respiratoire, fin marée CO₂et profondeur de l’anesthésie avec une pincée d’orteil³⁶.
3. Soigneusement mince le crâne à la transparence à l’aide d’une fraise dentaire à vitesse réduite et l’huile minérale pour offrir de couplage optique¹⁰. Faire preuve de prudence pour éviter de générer une chaleur excessive et d’éviter la pénétration de l’OS.
   NOTE : Amincissement du crâne permet à la lumière du laser pour atteindre les tissus sous-jacents et être réfléchie vers la sonde afin de mesurer l’effet Doppler, dont l’amplitude est déterminée par le nombre de particules mobiles (i.e., globules rouges) et leur vitesse.
4. Fixez la tige LDF est un micromanipulateur et placez-la directement au-dessus de la zone amincie du crâne. Pendant l’expérience, il est très important empêcher tout déplacement de la sonde de la LDF ou la préparation elle-même, comme la LDF est conçue pour mesurer le flux dans une zone restreinte du tissu et est extrêmement sensible aux artefacts de mouvement.
   Remarque : Tout mouvement de la sonde loin de sa position initiale fournira une estimation du débit sanguin dans une région différente du tissu, excluant les comparaisons. Alors que la LDF ne fournit pas de valeurs absolues et n’est pas approprié pour la comparaison entre les sujets, c’est un excellent moyen de façon non invasive évaluer les changements dans la perfusion tissulaire en réponse aux interventions expérimentales chez des sujets individuels ; et les changements relatifs au signal de la LDF des valeurs témoins peuvent être en moyenne et par rapport aux changements dans le signal de la LDF de contrôle dans les autres groupes expérimentaux.
   NOTE : LDF est une approche pratique pour avoir un aperçu des facteurs régulant le débit sanguin au niveau du lit vasculaire ensemble dans différents groupes expérimentaux^8,9,10. Évaluation de la perfusion tissulaire avec LDF fournit une approche pratique pour assimiler les connaissances acquises grâce à des études isolées navire dans une perspective de lit tout entier. Si l'on excepte les différences régionales dans les mécanismes de contrôle vasculaire entre les artères de résistance et de la microcirculation, mesures obtenues avec LDF donnent une bonne indication de contrôle de flux sanguin tissulaire qui est généralement conforme aux résultats obtenus avec préparations d’artères canulé.

4. evaluation de Muscle squelettique microvaisseaux densité avec GS1 lectine

1. Enlever le muscle cremaster un rat mâle en coupe ouverte le scrotum avec des ciseaux chirurgicaux fines standards, puis en utilisant une pince Dumont #5 à saisir le muscle.
   Remarque : Des muscles minces (par exemple, le muscle crémaster, ainsi que les muscles extenseur commun des orteils et le muscle jambier antérieurs que l'on retrouvent chez les rats mâles et femelles) sont idéales pour utilisation comme ensemble monte pour les études de la lectine, bien qu’histologique sections peuvent être utilisées pour les tissus plus épais.
2. Enlever le muscle cremaster du testicule à l’aide d’une seule coupe. Placez-la dans PSS glacée et épinglez-le dehors dans une boîte de Pétri avec une doublure d’élastomère de silicone sur le bas à l’intérieur de la surface. Doucement taquiner à l’extérieur du tissu conjonctif à l’aide de pinces Dumont #5.
3. Rincer les échantillons de muscle avec 2 mL de tampon PSS et puis immergez-les dans lectine GS1 rhodamine-étiqueté (20 µg/mL PSS) pendant 50 min dans une plaque de culture de cellules de 12 puits avec 2 mL/bien qui est enveloppé dans du papier d’aluminium pour éliminer la lumière.
4. Retirer les tissus de la solution de la lectine, rincer trois fois à PSS avec 5 min des incubations de « laver » sur une base berçante et montez-les sur lames de microscope. Veillez à incuber les tissus dans l’obscurité et de stocker les lames dans l’obscurité pour prévenir la perte de fluorescence.
   Remarque : Si les diapositives ne peut pas être utilisés immédiatement, il peuvent être conservés dans le réfrigérateur sans perte de fluorescence. Pour une conservation prolongée, les lames peuvent être conservés dans un congélateur afin d’éviter la détérioration¹¹.
5. Évaluer les microvaisseaux densité en comptant le nombre d’intersections des microvaisseaux étiquetées avec les lignes de la grille de synthèse superposées sur l' image⁵², ou avec une superposition d’une grille claire superposées sur le moniteur utilisé pour visionner les diapositives.
   NOTE : GS1 lectine approches ont été utilisées pour démontrer :⁵³de raréfaction microvasculaire causée par le sel, l’effet protecteur d’empêcher sel induit suppression II l’angiotensine dans le rétablissement des microvaisseaux densité chez les animaux nourris avec du sel^{17 ,53,54}; le rôle de NRF2 médiant l’effet protecteur du faible dose l’angiotensine II perfusion afin d’éviter les microvaisseaux raréfaction des rats nourris avec du sel¹⁷; et aussi pour évaluer le rôle de l’angiotensine II dans le maintien d’angiogénique réponses à la stimulation musculaire chronique en sel nourris rats^54,,⁵⁵. Un des avantages de la technique de lectine GS1 sont qu’il peut être utilisé pour évaluer la densité des microvaisseaux dans ces mêmes animaux utilisés pour l’étude des artères de résistance canulées ou LDF.

Résultats

In vitro la microscopie des artères de résistance canulées permet pour l’étude des facteurs influençant la tonalité active dans les artères de faible résistance (et plus grandes artérioles) à des pressions normales en vivo transmurale et en l’absence de cellules parenchymateuses influences. En plus d’évaluer la réactivité des navires à divers stimuli vasodilatateur et vasoconstricteur et myogènes réponses à l’élévation de la pression transmural...

Discussion

Tel que mentionné dans l’introduction, ce document décrit l’utilisation de la microscopie de télévision et artère résistance isolée s’approche pour évaluer la fonction vasculaire non seulement dans les modèles standard de rat (tel qu’employé dans la vidéo), mais aussi en hautement spécialisée génétiquement souches de rats machiné, qui montrent le roman et les aperçus puissants qui peuvent être obtenus en utilisant ces approches. L’utilisation de ces techniques puissantes pour évaluer ton acti...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
SS Rat	Medical College of Wisconsin	SS/JHsd/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat	Medical College of Wisconsin	SS-Chr 5BN/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat	Medical College of Wisconsin	SS-Chr 13BN/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat	Medical College of Wisconsin	SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates	Medical College of Wisconsin	SD-Nfe212em1Mcwi strain	Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.	113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A	Dyets, Inc.	113756
Colorado Video Caliper	Colorado Video, Inc.	Model 308
Video Camera	Hitachi	KPM1AN
Microscope	Olympus Life Science	CKX41
Television Monitor	Panasonic	WVBM1410
Pressure Transducers	Stoelting	56360
Blood Pressure Display Unit	Stoelting	50115
Cannulated Artery Chamber	Living Systems Instrumentation	CH-1	Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber	Living Systems Instrumentation	TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight	Living Systems Instrumentation	GD-MS	Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature	Living Systems Instrumentation	OX	Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter	Perimed	PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin	Vector Labs	RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes	Fredrich Haer Co.	27-33-1	2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller	David Kopf Instruments	Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY	Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.	114-ANM-10	Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox	Fine Science Tools	11254-20
Vannas Scissors	Fine Science Tools	15003-08
Protandim	Protandim		NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride	Fisher Bioreagents	BP358-212
Sodium Bicarbonate	Fisher Chemical	S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous	Fisher Chemical	D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)	Sigma Aldrich	M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)	Sigma	C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)	Sigma	S0751-500G
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Chemical	P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	ED255-500G