אינטגרציה חופשית של גזירה אנושית של תאים גזעיים Pluripotent באמצעות Laminin 521 מטריקס

Summary

גזירה חזקים של האדם המושרה האדם pluripotent גזע (hiPS) תאים הושג באמצעות שילוב של וירוס Sendai וירוס (Sev) וקטור בתיווך תיכנות של fibroblasts עורי. HiPS התא תחזוקה התרחבות המשוב בוצע באמצעות xeno חופשי ו מוגדר תנאי תרבות כימית עם laminin רקומביננטי אנושי 521 (LN-521) מטריקס Essential E8 (E8) בינוני.

Abstract

Xeno ללא תנאים מוגדרים לחלוטין הם פרמטרים מרכזיים עבור הדור חזק לשחזור של הומוגני האדם המושרה גזע pluripotent (hiPS) תאים. תחזוקה של תאים hiPS על תאים מזין או מטריצות לא מוגדר רגישים הבדלים אצווה, זיהום פתוגני הסיכון של immunogenicity. ניצול המוגדר רקומביננטי האנושי laminin 521 (LN-521) מטריצה ​​בשילוב עם פורמטים ללא xeno ו מוגדרים התקשורת מפחית השתנות ומאפשר את הדור עקבי של תאים hiPS. וירוס סנדאי (SeV) הוא וקטור שאינו שילוב מערכת RNA, ובכך לעקוף את החששות הקשורים השפעה משבשת פוטנציאלית על שלמות הגנום שילוב וקטורים יכול להיות. יתר על כן, אלה וקטורים הוכיחו יעילות גבוהה יחסית תכנות מחדש של fibroblasts עורי. בנוסף, אנזימטית תא יחיד passaging של תאים מקלה אחזקה הומוגנית של תאים hiPS ללא ניסיון קודם משמעותי של גזע ceLl תרבות. כאן אנו מתארים פרוטוקול זה נבדק בהרחבה ופיתח עם דגש על reproducibility וקלות השימוש, מתן דרך מעשית ויציבה כדי ליצור מוגדר ו xeno ללא תאים hips האדם מן fibroblasts.

Introduction

מאז הגזירה הראשונה של שורות תאים hiPS ידי טקהאשי et al. ^{1 , 2} , תאים hiPS סיפקו כלי שימושי עבור דוגמנות המחלה, גילוי סמים כחומר המקור להפקת טיפולי התא ברפואה רגנרטיבית ³ . תרבות hiPS התא כבר זמן רב תלוי תרבות שיתוף עם תאים מזין fibroblast ^{4 , 5} או על Matrigel ⁶ ו עם ניסוחים התקשורת המכיל בסרום שור עוברית (FBS). שינויי אצווה אל אצווה הם תוצאה נפוצה של הטבע הבלתי מוגדר של תנאי תרבות אלה, וכתוצאה מכך וריאציות בלתי צפויות, המהווה תורם מרכזי האמינות של פרוטוקולים אלה ⁷ . פיתוח של בינוני מוגדר כגון Essential 8 (E8) ⁸ ו מטריצות תרבות מוגדר תא למשל LN-521 ⁹ , לאפשרS להקמת פרוטוקולים לשחזור מאוד וסיוע הדור החזקה ותחזוקה של תאים hiPS הומוגני ^{7 , 8 , 9 , 10} .

פיתוח של אינטגרציה חינם תכנות מחדש טכניקות כבר זינוק קדימה. במקור, תכנות מחדש היה תלוי על וקטורים retroviral אשר משולבים באופן אקראי לתוך הגנום עם השפעות משבשות על שלמות גנומית ¹¹ . ההתקדמות במתודולוגיות של תכנות מחדש כוללת את הפיתוח של וקטורים מבוססי RNA. RNA וקטורים יש יתרון על פני שיטת ה- DNA מבוסס תכנות מחדש כמו אינטגרציה לא מכוונת באמצעות רקומבינציה גנומית אינו אפשרי ¹² . SEV וקטורים לספק ביטוי גבוה וחולף של גורמים אקסוגניים באמצעות RNA יחיד תקועים ללא שלב ה- DNA ¹¹ . את וקטורים תכנות מחדש שנמסר על ידי SEVהם מדולל ברחבי הרחבת התא ובסופו של דבר לשפוך מהתרבות לספק דרך הדפסה חופשית של תכנות מחדש. לאחר מכן, תחזוקה של pluripotency תלויה ביטוי אנדוגני של גנים pluripotency ² .

כמו טיפולים חלופיים מבוססי תאים hiPS מתחילים לעבור ניסויים קליניים, הדרישות עבור אצווה סטנדרטית, reproducibility, ובטיחות הם נושאים חיוניים כדי לענות על ¹³ . לכן, מוצרים בעלי חיים יש להימנע. לדוגמה, השימוש במוצרים קסנוגניים קשור לסיכון לזיהום פתוגן לא אנושי. כמו כן, תאים מתורבת בנוכחות של בעלי חיים מרכיבים התרבות הנגזרים הוכחו לשלב חומצות siliac לא אנושיים לתוך קרום התא המאיים להבהיר תאים נגזרים immunogenic ¹⁴ . לפיכך, הצורך לחסל מוצרים xenogeneic הוא הכרחי על כל עיסוקים קליניים עתידיים. פרוטוקול זה חל על xeללא חופשי ומוגדר התרבות תחזוקה של תאים תאים hiPS נעים קרוב יותר תאימות קלינית.

פרוטוקול זה מתאר שיטה עקבית, לשחזור מאוד וקל לשימוש, שיוצר תאים hiPS סטנדרטי מ fibroblasts. הוא גם מציע מערכת ידידותית למשתמש תרבות עבור תחזוקה של תאים hiPS הוקמה. פרוטוקול זה שימש כדי להפיק יותר מ 300 שורות תאים hiPS ב שבדיה האדם הלאומי iPS מתקן הליבה בבית Institutet Karolinska אשר כמה שורות בעבר תוארו ^{15 , 16} .

Protocol

האוסף של חומר המטופל ו הגזירה של תאים hiPS מאושר על ידי מועצת המנהלים של סקירה אתית, שטוקהולם, 28 מרס 2012, מספר רישום: 2012 / 208-31 / 3. צעדים תרבות תאים צריך להתבצע בארונות biosafety אלא אם כן צוין אחרת. תמיד תרגול טכניקות טיפול סטרילית בעת עבודה עם תאים. אפשר מדיה, צלחות ריאגנטים להגיע לטמפרטורת החדר לפני שמתחילים. דגירה התאים ב 37 ᵒC, 5% CO ₂ בלחץ גבוה.

1. בידוד של פיברובלסטים אנושיים מ ביופסיה דרמל

1. תכשירים של אנזימים בינוניים של תרבות, עיכול, ציפוי של כלים וכלים לנתח.
   1. הכן בינוני פיברובלסטים: 44.5 מ"ל Iscove השתנה של Dulbecco בינוני (IMDM), 5 מ"ל בסרום שור העובר (FBS) ו 500 μic פניצילין / סטרפטומיצין (PEST) (ראה טבלה 1 ), חנות ב 4 ° C.
   2. הכן אנזימים העיכול בריכוז עבודה של 1 מ"ג / מ"ל: WeiAliquots gh של 4 מ"ג dispase ו collagenase סוג אני אבקה צינורות נפרדים 15 מ"ל ו להתמוסס 4 מ"ל של DMEM / F12 + 1% PEST. לעקר את הפתרון האנזימטי על ידי העברת אותו דרך מסננת 0.22 מיקרומטר. הכן פתרונות אנזים טרי בכל פעם.
   3. מעיל אחד טוב צלחת 6-רקמה תרבותית (או 35 מ"מ צלחת רקמה תרבות) לכל ביופסיה גזור עם 1 מ"ל של ג'לטין 0.1% ב פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   4. החיטוי קבוצה אחת של מספריים כירורגי ו מלקחיים לכל ביופסיה לנתיחה.
2. טיפול ביופסיה
   הערה: תהליך ביופסיות מהר ככל האפשר לאחר נלקח. חנות PBS + 1% PEST עד 48 שעות ב 4 ° C. ביופסיה צריכה להיות בגודל של 2 מ"מ בקוטר ובהתאם לאישורים אתיים.
   1. מעבירים את הביופסיה לתוך צלחת 35 מ"מ. להעביר את הביופסיה לצלחת 35 מ"מ חדש לצלול הביופסיה ב 2 מ"ל של 70% אתנול במשך 30 s.
   2. להעביר את הביופסיה לשליש35 מ"מ צלחת לשטוף עם 1 מ"ל של תמיסת מלח איזון סטרילי של האנק (HBSS) בתוספת 1% PEST.
   3. מעבירים את הביופסיה לצלחת רביעית 35 מ"מ, מוסיפים 1 מ"ל של פתרון טריז מוכן 0.1% טרי.
   4. חותכים את ביופסיה העור לתוך 1 - 2 מ"מ ³ חתיכות בצלחת באמצעות מספריים כירורגי מלקחיים ולאחר מכן להעביר ביופסיה חתיכות כולל פתרון dispase לתוך צינור 15 מ"ל. הוסף 2 מ"ל נוספים של dispase.
   5. שוטפים את צלחת 35 מ"מ עם פתרון 1 מ"ל dispase ולהעביר את צינור 15-מ"ל.
   6. דגירה ביופסיה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   7. הוסף 4 מ"ל של 0.1% collagenase אני הצינור ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
   8. צנטריפוגה תאים מתעכל 300 xg במשך 3 דקות, לשאוב supernatant ו resuspend העיכול ב 2 מ"ל של מדיום fibroblast.
   9. הסר את הפתרון ג'לטין מהצלחת 6-רקמת התרבות. מעבירים את ההשעיה התא כולל כל החלקים הנותרים כדי 6-היטב צלחת תרבות רקמה (או 35 מ 'מ 'תרבות רקמה צלחת) precoated עם 0.1% ג'לטין DPBS.
   10. שנה מדי יום מדי יום.
3. התרחבות של fibroblasts האדם
   הערה: Fibroblasts מוכנים להיות passaged כדי T25 (25 ס"מ ² ) בקבוקון תרבות רקמה כאשר 80% confluent ( איור 2 ב ). Fibroblasts בדרך כלל להגיע confluency 80% בתוך 7 ימים. עם זאת, הזמן הנדרש יכול להשתנות במידה רבה, אבל צריך להיות לא יותר מ 4 שבועות.
   1. לשאוב בינוני לשטוף פעם עם 2.5 מ"ל של DPBS.
   2. הסר DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין- EDTA (0.05%) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד לתאים להציג קצוות מעוגלים ולהתחיל לנתק.
   3. הוסף 2 מ"ל של מדיום fibroblast, אם יש צורך לשטוף את התאים הבטחת disassociation תקין של תאים. מעבירים את הפתרון התא לצינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב XG 300 במשך 3 דקות.
   4. מחק supernatant ו resuspend תא גלולה ב 5 מ"ל של fibroblast בינוני fibroblasts צלחת בעל מצופה רקמת התא T25 בקבוק. כאשר הרחבת fibroblasts לאחר שלב זה, לנתק כמתואר לעיל זרע 12 x 10 ³ תאים / ס"מ ² .
   5. לאחר תאים confluent מוכנים להיות קפואים, להרחיב או צלחת עבור תכנות מחדש. להקפיא שני סיבובים של fibroblast לפני כל תכנות מחדש הוא התחיל (עיין בסעיף הבא עבור הליך הקפאת). יעילות תכנות מחדש היא בדרך כלל גבוהה יותר עבור fibroblasts מעבר נמוך יותר, תאים במעבר 2 - 4 הוא אופטימלי. עם זאת, תכנות מחדש מוצלח של fibroblasts עד מעבר 10 נעשה באמצעות פרוטוקול זה.
4. הקפאה והפשרה של fibroblasts
   1. הכן טרי פיברובלסטים טמפרטורה בינונית: 90% FBS + 10% dimethylsulfoxide (DMSO). שמור על 4 מעלות צלזיוס ( טבלה 1 ). לאחר confluent, T25 רקמה תרבות תרבות יכול להיות קפוא לתוך שלושה cryovials. הכן 500 μL של פיברובלסטים בינוני הקפאה לכל בקבוקון קפוא.
   2. כדי להקפיא תאים, לנתק גElls כמתואר בשלב 1.3, לספור תאים באמצעות hemocytometer ולהעביר חלקים של 3 x 10 ⁵ תאים צינורות 15 מ"ל. ספין צינורות ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב supernatant.
   3. Resuspend תא כדורי 500 μL של 4 ˚C fibroblast הקפאת בינוני ולהעביר cryovials. מניחים את צלוחיות במיכל מקפיא תאים דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת אותם חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
   4. כדי להפשיר את התאים, לצלול את החלק התחתון של cryovial ב 37 מעלות צלזיוס מים. לאחר מעובה, להעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום fibroblast. תאים ספין 300 xg במשך 3 דקות.
   5. הסר את supernatant ו resuspend תא גלולה ב 5 מ"ל של מדיום fibroblast. העברת תאים שאינם מצופים T25 רקמה תרבות תרבות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.

2. SEV וקטור תכנות מחדש של פיברובלסטים

1. הכנה של aliquots וקטור
   זהירות: ידית את ה - SEV מתחת למיכל הביולוגי. עיין בפרוטוקול היצרן ובהנחיות המקומיות. טמפרטורת הווירוסים משתנה בין קבוצות.
   1. לפני הכנת aliquots לחשב את כמות וקטור הצורך 5 x 10 ⁴ תאים על פי פרוטוקול של היצרן ( למשל , CytoTune 2.0). הווירוס titer בדרך כלל משתנה מ 8 x 10 ⁷ - 1.5 x 10 ⁸ . הפשרה ושילוב וקטורים 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 ו- hKlf4 = משרד הפנים 3). חלק הסכום מחושב עבור תכנות מחדש של 5 x 10 ⁴ תאים לתוך autoclaved 1.5 צינורות מ"ל. לדלל aliquots וירוס עם בינוני fibroblast כדי נפח סופי של 250 μL עבור תכנות מחדש.
      הערה: כל בקבוקון תקף עבור תכנות מחדש של באר אחת של 24 גם צלחת רקמה תרבות עם 5 x 10 ⁴ fibroblasts. חנות aliquots וירוס ב -80 מעלות צלזיוס.
2. סיומת וקטור
   1. לשאוב תאים cuLture בינוני לשטוף עם 1 מ"ל של DPBS. לשאוב DPBS ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין- EDTA (0.05%). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד התאים מנותקים.
   2. הוסף 2 מ"ל של בינוני fibroblast ו resuspend התאים ולהעביר צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה 300 xg במשך 3 דקות.
   3. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 2 מ"ל של מדיום fibroblast.
   4. ספירת fibroblasts באמצעות hemocytometer וזרע 5 x 10 ⁴ תאים היטב אחד של 24 גם צלחת תרבות רקמה. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   5. לשאוב בינוני בתרבית תאים, להוסיף 250 μL של פתרון SEV ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   6. שינוי בינוני מדי יום כדי בינוני fibroblast טריים. אפשר תאים transduced לגדול במשך 7 ימים לפני passaged ל LN-521 צלחות מצופה. הכן LN-521 צלחות יום לפני המעבר. עיין 2.3.1 עבור הליך ציפוי.
3. החזרת fibroblasts transduced
   1. הכנת LN-521 מנות מצופה: לדלל LN-521 ב DPBS לריכוז סופי של 0.63 מיקרוגרם / ² ס"מ. פיפטה 2 מ"ל של פתרון LN-521 לכל 60 מ"מ צלחת רקמה תרבות. חותם 60 מ"מ צלחת רקמה תרבות באמצעות parafilm. דגירה לילה ב 4 ° C.
   2. הכן Essential 8 בינוני (E8) aliquots לטיפול קל יותר: 48.5 מ"ל של מדיום E8, 1 מ"ל של E8 בתוספת 500 μL של PEST ( טבלה 1 ).
   3. 7 ימים לאחר התמרה, מעבר התאים LN-521 מצופה 60 מ"מ צלחת רקמה תרבותית. הוסף 250 μL של טריפסין- EDTA (0.05%) ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד התאים מנותקים. הוסף 2 מ"ל של fibroblast בינוני תאים צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
   4. לשאוב את supernatant. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל של מדיום fibroblast ו לספור תאים hemocytometer. לשאוב LN-521 פתרון מן הצלחת precoated וזרע 4 x 10 ⁴ תאים 5ml של בינוני fibroblast ב LN-521 precoated 60 מ"מ צלחת. הוסף מעכב Rho-kinase Y-27632(ROCKi) לריכוז סופי של 5 מיקרומטר. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
   5. חשוב לציין, למחרת, לשנות בינוני בינוני E8. שנה E8 בינוני מדי יום. מושבות תאים hiPS יגיחו בתוך 2 - 3 שבועות.

3. בחירת מושבות והרחבת תאי HiPS

הערה: השלבים הבאים נעשים מחוץ לארון biosafety תחת מיקרוסקופ סטריאו. השימוש במסכות שיער ומסיכות מומלץ. לעבוד בזהירות לא לזהם את התרבות התא.

1. הכן LN-521 תרבות רקמה מצופה 24-גם צלחות יום לפני בחירת. מדולל LN-521 ב DPBS 0.63 מיקרוגרם / ס"מ ² . פיפטה 250 μL של פתרון LN-521 לתוך באר אחת של 24 גם צלחת רקמה תרבות. חותמות צלחות באמצעות parafilm. דגירה לילה ב 4 ° C.
   הערה: המושבות מוכנים להיבחר כאשר הם מגיעים לגודל 1 מ"מ קוטר. המושבות צריך להציג קצוות חדים לגדול הומוגני מוןOlayers ( איור 2 ד ).
2. לשאוב את הפתרון LN-521 ולהוסיף 500 μL של E8 לתוך באר אחת של 24 גם צלחת רקמה תרבות.
3. גזור מושבות לחתיכות קטנות יותר עם איזמל ברשת כמו דפוס תחת stereomicroscope. מכני לגרד את הסדינים התא מהצלחת ולהעביר את הסדינים באמצעות פיפטה 200 μL היטב מוכן ( איור 2D -2E ). בחר מושבות לתוך בארות נפרדות.
4. אפשר תאים לצרף ללא שינוי בינוני עבור 48 שעות. לאחר מכן, לשנות E8 בינוני מדי יום.
5. כאשר המושבות הגיעו בגודל של 5 מ"מ, תאים אנזימטית המעבר כתאים בודדים לבאר חדשה של צלחת LN-521 מצופה.
6. לשאוב את התרבות בינוני התא מהתאים לשטוף עם 250 μL של DPBS.
7. לשאוב DPBS. הוסף 250 μL של מגיב disociation ו דגירה במשך 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
8. שימו לב כי התאים החלו להסתדר. לנתקתאים מן הצלחת על ידי שטיפת התאים עם מגיב ניתוק כמה פעמים.
9. הוסף 500 μL של מדיום E8 לצינור 15-מ"ל. מעבירים את התאים ריאגנט disociation לצינור צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 300 x גרם.
10. לשאוב את הפתרון LN-521 מן LN-521 precoated היטב ולהוסיף 500 μL טמפרטורת החדר E8 בינוני.
11. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה התא μL 500 של מדיום E8.
12. ספירת התאים באמצעות hemocytometer וזרע 2.5 x 10 ⁴ - 5 x 10 ⁴ תאים מוכן LN-521 precoated היטב (1.25 x 10 ⁴ - 2.5 x 10 ⁴ תאים / ס"מ ² ). תבנית התרבות התא יכול בקלות להיות upscaled כדי להתאים את המטרה המיועדת.
13. הוסף ROCKi לריכוז סופי של 10 מיקרומטר. דגירה תאים על 37 מעלות צלזיוס.
14. שנה E8 בינוני מדי יום. תאים בדרך כלל מוכנים לעבור לאחר 4-6 ימים. תאים מעבר אנזימטית כמו תאים בודדים כמתואר לעיל כאשר כ 90% confluent.
    הערה: וקטורים תיכנות מחדש הם מדולל בהדרגה במהלך הרחבת התא hiPS ולא ניתן לגילוי לאחר המעבר 12. תאים שאינם מתוכנתים מחדש באופן נפוץ להפסיק לשגשג סביב מעבר 6-10 או לאבד את האופייני pluripotent תא גזע מורפולוגיה ( איור 3 ב ).
15. הקפאה והפשרה של תאים hiPS
    1. כדי להקפיא תאים, אנזימטית לנתק תאים כמו תאים בודדים כמתואר לעיל, לספור תאים hemocytometer ולהעביר 2.5 x 10 ⁵ תאים צינור 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מדיום E8. צנטריפוגה ב XG 300 במשך 3 דקות. לשאוב את supernatant.
    2. Resuspend תא גלולה μL 250 של 4 ° C cryomedium PSC ולהעביר cryovial. מניחים את הבקבוקון במיכל מקפיא תאים דגירה ב -80 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות לפני העברת אותם חנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.
    3. כדי להפשיר תאים, להכין מראש LN-521 היטב של תרבות רקמות 24-היטבצלחת על ידי aspirating פתרון LN-521 והוספת 250 μL של E8 בינוני. לצלול את החלק התחתון של cryovial ב 37 מעלות צלזיוס מים עד רק נטיף קטן נשאר.
    4. הוסף 250 μL של E8 בינוני כדי cryovial ולהעביר את ההשעיה התא לצינור 15 מ"ל ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום E8. תאים ספין 300 xg במשך 3 דקות.
    5. הסר את supernatant ו resuspend תא גלולה μL 250 של טמפרטורת החדר E8 בינוני. מעבירים את ההשעיה תא היטב מוכן להוסיף 1% תאי הכדאיות התא או 10 מיקרומטר ROCKi. דגירה צלחת תרבות רקמה ב 37 מעלות צלזיוס.

תוצאות

מ ביופסיה לתאי hiPS

התהליך כולו מביופסיה לתאי hiPS הוקמה, ברור של וקטור תכנות מחדש מוכן לאפיון, לוקח בערך 16 שבועות ( איור 1 ). ציר זמן מפורט יותר מצוין באיור 2 א . כ 4 שבועו...

Discussion

התוצאה הצפויה של פרוטוקול זה הוא הדור המוצלח של מספר שורות תאים hiPS הנגזר clonally. חשוב לציין, השיטה לתחזוקה של הרחבת תאים hiPS הוקמה כאן המתואר הוא אמין יכול להתבצע עם ניסיון מוקדם מעט של תרבות תא גזע. אנזימטית תא יחיד passaging עם ROCKi יחד עם מטריקס LN-521 ידוע לשמור תאים כמו נורמלי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage