Derivazione libera dell'integrazione delle cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo usando la matrice Laminina 521

Riepilogo

Una robusta derivazione di cellule pluripotenti indotte da humano (hiPS) è stata ottenuta utilizzando riprogrammazione mediata dei fibroblasti dermici da virus Sendai (SeV) non integrante. La manutenzione delle cellule hiPS e l'espansione clonale sono state eseguite usando condizioni di coltura xeno-free e chimicamente definite con matrice umana laminina 521 (LN-521) e Essential E8 (E8) Medium ricombinante.

Abstract

Le condizioni prive di Xeno e completamente definite sono parametri fondamentali per una generazione robusta e riproducibile di cellule pluripotenti indotte da umano omogeneo (hiPS). La manutenzione delle cellule hiPS sulle cellule alimentatori o alle matrici non definite sono suscettibili a varianze di lotto, alla contaminazione patogena e al rischio di immunogenicità. Utilizzando la matrice umana ricombinante laminina umana 521 (LN-521) in combinazione con formulazioni di media xeno e definite, riduce la variabilità e consente la generazione costante di cellule hiPS. Il virus Sendai virus (SeV) è un sistema basato su RNA non integrato, evitando quindi le preoccupazioni associate al potenziale effetto dirompente sull'integrità genoma che i vettori integranti possono avere. Inoltre, questi vettori hanno dimostrato un'efficienza relativamente elevata nella riprogrammazione dei fibroblasti dermici. Inoltre, la passaggistica cellulare singola enzimatica agevola la manutenzione omogenea delle cellule hiPS senza una notevole esperienza precedente di ce ce ceCultura. Qui descriviamo un protocollo che è stato ampiamente testato e sviluppato con particolare attenzione alla riproducibilità e alla facilità d'uso, fornendo un modo robusto e pratico per generare cellule umane hiPS definite e prive di xeno dai fibroblasti.

Introduzione

Dal momento che la prima derivazione delle linee cellulari hiPS da Takahashi et al. ^{1 , 2} , le cellule hiPS hanno fornito uno strumento utile per la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e come materiale di origine per la generazione di terapie cellulari in medicina rigenerativa ³ . La coltura di cellule hiPS è da tempo dipendente dalla co-coltura con le cellule di alimentazione di fibroblasti ^{4 , 5} o su Matrigel ⁶ e con formulazioni di supporto contenenti serum bovino fetale (FBS). Le varianze batch-to-batch sono una conseguenza comune della natura indefinita di queste condizioni di coltura, con conseguente variazioni imprevedibili, che contribuiscono in modo significativo alla inaffidabilità di questi protocolli ⁷ . Lo sviluppo di un mezzo definito come Essential 8 (E8) ⁸ e le matrici di colture cellulari definite ad esempio LN-521 ⁹ , consentonoS per la creazione di protocolli altamente riproducibili e aiuti nella robusta generazione e manutenzione di cellule hiPS omologate ^{7 , 8 , 9 , 10} .

Lo sviluppo di tecniche di riprogrammazione gratuite di integrazione è stato un salto in avanti. Originariamente, la riprogrammazione dipendeva da vettori retrovirali che sono stati integrati in modo casuale nel genoma con effetti disruptivi sull'integrità genomica ¹¹ . I progressi nelle metodologie di riprogrammazione includono lo sviluppo di vettori basati su RNA. I vettori RNA hanno un vantaggio rispetto al metodo di riprogrammazione basata sul DNA, poiché l'integrazione involontaria attraverso la ricombinazione genomica non è possibile ¹² . I vettori SeV forniscono un'elevatissima e transitoria di fattori esogeni attraverso RNA a singolo filamento senza una fase DNA- ¹¹ . I vettori di riprogrammazione consegnati dal SeVSono diluiti per tutta l'espansione cellulare e, infine, spurgati dalla cultura fornendo un metodo di riprogrammazione libero. Successivamente, la manutenzione della pluripotenza dipende dall'espressione endogena dei geni pluripotenziali ² .

Poiché pionieristici terapie a base di cellule hiPS stanno cominciando a passare a studi clinici, le richieste di lotti standardizzati, la riproducibilità e la sicurezza sono questioni essenziali per affrontare ¹³ . Pertanto, i prodotti di origine animale devono essere evitati. Ad esempio, l'uso di prodotti xenogeneici è stato associato al rischio di contaminazione degli agenti patogeni non umani. Inoltre, le cellule colte in presenza di componenti animali della coltura animale hanno dimostrato di incorporare acidi silici non umani nelle membrane cellulari che minaccia di rendere le cellule derivate immunogeniche ¹⁴ . Quindi, la necessità di eliminare i prodotti xenogeneic è necessaria per qualsiasi futura ricerca clinica. Questo protocollo si applica xeCultura priva di libertà e definizione nel mantenimento delle cellule hiPS che muovono le cellule più vicine alla conformità clinica.

Questo protocollo descrive un metodo coerente, altamente riproducibile e facile da usare che genera cellule hiPS standardizzate dai fibroblasti. Offre inoltre un sistema di coltura di facile utilizzo per la manutenzione di cellule hiPS stabilite. Questo protocollo è stato utilizzato per ricavare più di 300 linee di cellule hiPS nel centro nazionale svedese di iPS Core a Karolinska Institutet di cui alcune linee sono state precedentemente descritte ^{15 , 16} .

Protocollo

La raccolta del materiale del paziente e la derivazione delle cellule hiPS è approvata dal Consiglio di revisione dell'etica, Stoccolma, 28 marzo 2012, Numero di registrazione: 2012 / 208-31 / 3. Le fasi della coltura cellulare devono essere eseguite in armadi di biosicurezza, salvo diversa indicazione. Praticare sempre tecniche di manipolazione sterili quando si lavora con le cellule. Lasciare che i supporti, le lastre e i reagenti raggiungano la temperatura ambiente prima di iniziare. Incubare le cellule a 37 ᵒC, 5% CO ₂ in alta umidità.

1. Isolamento di fibroblasti umani da biopsia cutanea

1. Preparazioni di medium di coltura, enzimi digestivi, rivestimento di piatti e strumenti di dissezione.
   1. Preparare il medium Fibroblast: 44,5 ml di Medius Dulbecco modificato (IMDM) di Iscove, 5 ml di fegato fetale bovino (FBS) e 500 μL di penicillina / streptomicina (PEST) (vedere tabella 1 ), conservare a 4 ° C.
   2. Preparare gli enzimi digestivi ad una concentrazione di lavoro di 1 mg / ml: weiGh aliquote di 4 mg di dispasi e collageno di tipo I in tubi separati da 15 ml e si sciolgono in 4 mi di DMEM / F12 + 1% PEST. Sterilizzare la soluzione enzimatica passandola attraverso un filtro da 0,22 μm. Preparare ogni volta le soluzioni enzimatiche fresche.
   3. Cappare un pozzetto in una piastra di coltura del tessuto a 6 pozzetti (o piatto da 35 mm di coltura tissutale) per biopsia sezionata con 1 ml di gelatina 0,1% in soluzione salina fosfata tamponata (DPBS). Incubare a temperatura ambiente per 30 min.
   4. Autoclave un set di forbici chirurgiche e pinze per biopsia per la dissezione.
2. Manipolazione biopsia
   NOTA: procedere alle biopsie del processo il più velocemente possibile dopo essere state prese. Conservare in PBS + 1% PEST per un massimo di 48 ore a 4 ° C. La biopsia dovrebbe essere di 2 - 4 mm di diametro e secondo i permessi etici.
   1. Trasferire la biopsia in un piatto da 35 mm. Spostare la biopsia in un nuovo piatto da 35 mm e immergere la biopsia in 2 ml di etanolo al 70% per 30 s.
   2. Spostare la biopsia in un terzoPiatto da 35 mm e lavare con 1 ml di soluzione salina equilibrata Hank (HBSS) sterile, completa di PEST 1%.
   3. Trasferire la biopsia in un quarto piatto da 35 mm, aggiungere 1 ml di soluzione di dispersione al 0,1% di preparati freschi.
   4. Tagliare la biopsia cutanea in 1 - 2 mm ³ pezzi nel piatto utilizzando forbici e pinze chirurgiche e trasferire pezzi di biopsia inclusa la soluzione di dispersione in un tubo da 15 ml. Aggiungere un ulteriore 2 ml di dispersione.
   5. Sciacquare il piatto da 35 mm con una soluzione di dispasione da 1 ml e trasferire nel tubo da 15 ml.
   6. Incubare la biopsia a 4 ° C per una notte.
   7. Aggiungere 4 ml di collagenasi I 0,1% al tubo e incubare a 37 ° C per 4 ore.
   8. Centrifugare le cellule digerite 300 xg per 3 min, aspirare il surnatante e risospendere il digest in 2 mL di mezzo di fibroblasto.
   9. Rimuovere la soluzione di gelatina dalla piastra di coltura del tessuto a 6 pozzetti. Trasferire la sospensione cellulare includendo eventuali pezzi rimanenti a una piastra di coltura di tessuti a 6 pozzetti (o 35 mM piatto di coltura tissutale) pre-rivestito con gelatina 0,1% in DPBS.
   10. Cambiare il terreno ogni terzo giorno.
3. Espansione dei fibroblasti umani
   NOTA: I fibroblasti sono pronti per essere passati a un pallone di coltura di tessuti T25 (25 cm2) quando l'80% confluente ( Figura 2B ). I fibroblasti in genere raggiungono l'80% confluenza entro 7 giorni. Tuttavia, il tempo richiesto può variare notevolmente ma non deve superare le 4 settimane.
   1. Aspirare il mezzo e lavare una volta con 2,5 mL di DPBS.
   2. Rimuovere DPBS e aggiungere 1 mL di Trypsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule visualizzano i bordi arrotondati e cominciano a staccarsi.
   3. Aggiungere 2 ml di mezzo di fibroblasti, se necessario sciacquare le cellule assicurando una disassociazione appropriata delle cellule. Trasferire la soluzione cellulare in un tubo da 15 mL e centrifugare a 300 xg per 3 min.
   4. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di fibroblasti e di fibroblasti di piastre in unColla T25 a coltura cellulare su tessuto cellulare. Quando si espandono i fibroblasti dopo questa fase, dissociare come sopra descritto e sementi 12 x 10 ³ cellule / cm ² .
   5. Una volta che le cellule confluenti sono pronte per essere congelate, espandere o piastra per riprogrammare. Fermare due cicli di fibroblasti prima di iniziare qualsiasi riprogrammazione (vedi sezione successiva per la procedura di congelamento). La riprogrammazione dell'efficienza è generalmente più elevata per i fibroblasti di passaggio più bassi, le cellule al passaggio 2 - 4 sono ottimali. Tuttavia, la riprogrammazione riuscita di fibroblasti fino al passaggio 10 è stata condotta usando questo protocollo.
4. Congelamento e scongelamento dei fibroblasti
   1. Preparare il mezzo fresco di fibroblast: 90% FBS + 10% dimetilsolfossido (DMSO). Tenere a 4 ° C ( Tabella 1 ). Una volta confluent, il pallone di coltura tessuto T25 può essere congelato in tre cryovials. Preparare 500 μL di mezzo di congelamento di fibroblasti per flaconcino congelato.
   2. Per bloccare le cellule, dissociare cCome descritto nel punto 1.3, contano le cellule usando un emocitometro e trasferiscono porzioni di 3 x 10 ⁵ cellule a 15-mL tubi. Infilare i tubi a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante.
   3. Resuspendere le pellicole di cellule in 500 μl di 4 ° C di fibroblasto e trasferire in crisi. Posizionare le fiale in un contenitore di congelamento e incubare le cellule a -80 ° C per 24 ore prima di trasferirle in azoto liquido per l'immagazzinamento a lungo termine.
   4. Per scongelare le celle, immergere la parte inferiore del crioviale in acqua di 37 ° C. Una volta liquefatto, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL e aggiungere 5 mL di mezzo di fibroblasto. Le cellule di spin 300 xg per 3 min.
   5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo di fibroblasti. Trasferire le cellule in un pallone di coltura tissuale T25 non rivestito e incubare a 37 ° C.

2. SeV Vector Riprogrammazione dei Fibroblasti

1. Preparazione di aliquote vettoriali
   ATTENZIONE: Maneggiare la SeV sotto il contenimento del livello 2 di biosicurezza. Fare riferimento al protocollo del produttore e alle linee guida locali ¹⁷ . Il titolo di virus varia tra i lotti.
   1. Prima di preparare aliquote calcolare la quantità di vettore necessaria per 5 x 10 ⁴ celle secondo il protocollo del produttore ( ad esempio , CytoTune 2.0). Il titolo del virus varia generalmente da 8 x 10 ⁷ - 1,5 x 10 ⁸ . Sciogliere e combinare i vettori 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 e hKlf4 = MOI 3). Portare la quantità calcolata per la riprogrammazione di 5 x 10 ⁴ cellule in tubi autoclavati da 1,5 ml. Aliquote del virus dilatate con il mezzo di fibroblasto a un volume finale di 250 μL per la riprogrammazione.
      NOTA: Ogni fiala è valida per la riprogrammazione di un pozzetto di una piastra di coltura del tessuto da 24 pozzetti con 5 x 10 ⁴ fibroblasti. Conservare le aliquote del virus a -80 ° C.
2. SeV Trasduzione vettoriale
   1. Aspira cu cuMescolare e lavare con 1 mL di DPBS. Aspirare DPBS e aggiungere 1 mL di Trypsin-EDTA (0,05%). Incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule sono staccate.
   2. Aggiungere 2 ml di mezzo di fibroblasti e risospendere le cellule e trasferire in un tubo da 15 ml. Centrifugare 300 xg per 3 min.
   3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 2 ml di mezzo di fibroblasti.
   4. Contare i fibroblasti usando un emocitometro e le sementi di 5 x 10 ⁴ cellule in un pozzo di una piastra di coltura del tessuto da 24 pozzetti. Incubare le cellule a 37 ° C per una notte.
   5. Aspirare il mezzo di coltura cellulare, aggiungere 250 μL della soluzione SeV e incubare a 37 ° C per una notte.
   6. Cambia media media giornaliera in fibroblasti fresche. Lasciare che le cellule trasmesse crescano per 7 giorni prima di essere passate alle piastre rivestite con LN-521. Preparare le piastre LN-521 il giorno prima del passaggio. Fare riferimento al punto 2.3.1 per la procedura di rivestimento.
3. Riproduzione di fibroblasti trasdurate
   1. Preparazione di LN-521 piatti rivestiti: Diluire LN-521 in DPBS fino ad una concentrazione finale di 0,63 μg / cm ² . Pipettare 2 ml della soluzione LN-521 per un piatto di coltura tissutale da 60 mm. Sigillare il piatto da 60 mm di coltura tissutale utilizzando il parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
   2. Preparare le aliquote Medie (E8) Essential 8 per una facile manipolazione: 48,5 ml di media E8, 1 ml di supplemento E8 e 500 μL di PEST ( Tabella 1 ).
   3. 7 giorni dopo la trasduzione, passare le cellule ad un LN-521 rivestito piatto da 60 mm di coltura tissutale. Aggiungere 250 μl di Trypsin-EDTA (0,05%) e incubare a 37 ° C per 5 minuti o fino a quando le cellule sono staccate. Aggiungere 2 mL di fibroblasti e centrifugare le cellule per 3 min a 300 x g.
   4. Aspirare il surnatante. Resuspendere il pellet in 2 ml di mezzo di fibroblasti e contare le cellule in un emocitometro. Aspirare la soluzione LN-521 dalla piastra pre-rivestita e seminare 4 x 10 ⁴ cellule in 5 ml di mezzo di fibroblasti nel piatto LN-521 pre-rivestito da 60 mm. Aggiungere inibitore della Rho-chinasi Y-27632(ROCKi) ad una concentrazione finale di 5 μM. Incubare a 37 ° C per una notte.
   5. Importante, il giorno successivo, cambiare media a media E8. Cambia E8 media ogni giorno. Le colonie cellulari hiPS emergono entro 2-3 settimane.

3. Raccolta delle colonie e espansione delle cellule hiPS

NOTA: i seguenti passaggi vengono eseguiti al di fuori dell'armadio della biosicurezza sotto un microscopio stereo. L'uso di hairnet e maschere di procedura è consigliato. Lavori attentamente per non contaminare la cultura cellulare.

1. Preparare la coltura del tessuto LN-521 a 24 pozzetti il ​​giorno prima della raccolta. Diluire LN-521 in DPBS 0,63 μg / cm ² . Pipettare 250 μL della soluzione LN-521 in un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 24 pozzetti. Piastre di tenuta con parafilm. Incubare per una notte a 4 ° C.
   NOTA: le colonie sono pronte per essere selezionate quando raggiungono una dimensione di diametro superiore a 1 mm. Le colonie dovrebbero presentare spigoli vivi e crescere in monogeno omogeneoOlayers ( figura 2D ).
2. Aspirare la soluzione LN-521 e aggiungere 500 μl di E8 in un pozzetto di una piastra di coltura di tessuti a 24 pozzetti.
3. Tagliare le colonie in pezzi più piccoli con un bisturi in un modello a griglia sotto uno stereomicroscopio. Raschiare meccanicamente i fogli delle cellule dal piatto e trasferire i fogli utilizzando una pipetta da 200 μl al pozzetto preparato ( Figura 2D -2E ). Raccogliere le colonie in pozzetti separati.
4. Lasciare che le cellule si attacchino senza cambiare mezzo per 48 h. Successivamente, cambiare E8 media giornalmente.
5. Quando le colonie hanno raggiunto dimensioni superiori a 5 mm, le cellule enzimatiche passano come singole cellule a un nuovo pozzetto di una piastra rivestita con LN-521.
6. Aspira il mezzo di coltura cellulare dalle cellule e lavare con 250 μL di DPBS.
7. Aspira DPBS. Aggiungere 250 μL di reagente di dissociazione e incubare per 3 minuti a 37 ° C.
8. Osservate che le cellule hanno cominciato a arrotondare. distaccareLe cellule dalla piastra sciacquando le cellule con reagente di dissociazione poche volte.
9. Aggiungere 500 μl di mezzo E8 a un tubo da 15 ml. Trasferire le cellule nel reagente di dissociazione nel tubo e centrifugare per 3 min a 300 x g.
10. Aspirare la soluzione LN-521 dal pozzetto pre-rivestito LN-521 e aggiungere 500 μl di temperatura ambiente E8.
11. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 500 μl di mezzo E8.
12. Contare le cellule usando un emocytometro e le sementi di 2,5 x 10 ⁴ - 5 x 10 ⁴ nel pozzetto preparato LN-521 preparato (1,25 x 10 ⁴ - 2,5 x 10 ⁴ cellule / cm ² ). Il formato della coltura cellulare può essere facilmente rielaborato per adattarsi allo scopo previsto.
13. Aggiungere ROCKi ad una concentrazione finale di 10 μM. Incubare le cellule a 37 ° C.
14. Cambia E8 media ogni giorno. Le cellule sono solitamente pronte al passaggio dopo 4 - 6 giorni. Le cellule di passaggio enzimatico come singole cellule come descritte sopra, quando il confluento circa il 90%.
    NOTA: I vettori di riprogrammazione sono progressivamente diluiti durante l'espansione delle cellule hiPS e non rilevabili dopo il passaggio 12. Le cellule che sono riprogrammate imparzialmente spesso cessano di proliferare attorno al passaggio 6 - 10 o perdono la loro caratteristica pluripotente morfologia delle cellule staminali ( Figura 3B ).
15. Congelamento e scongelamento delle cellule hiPS
    1. Per congelare le cellule, dissociare enzimaticamente le cellule come singole cellule come sopra descritto, contare le cellule in un emocitometro e trasferire le cellule di 2,5 x 10 ⁵ in un tubo da 15 mL contenente 1 mL di mezzo E8. Centrifugare a 300 xg per 3 min. Aspirare il surnatante.
    2. Resuspendere il pellet cellulare in 250 μl di cryomedium PSC a 4 ° C e trasferire in un cryovial. Posizionare il flaconcino in un contenitore di congelamento e incubare le cellule a -80 ° C per 24 ore prima di trasferirle in azoto liquido per l'immagazzinamento a lungo termine.
    3. Per scongelare le cellule, preparare un pozzetto LN-521 pre-stratificato di una coltura di tessuto da 24 pozzettiPiastra aspirando la soluzione LN-521 ed aggiungendo 250 μl di mezzo E8. Immergere la parte inferiore del crioviale in acqua di 37 ° C finché rimane solo un piccolo ghiaccio.
    4. Aggiungere 250 μl di E8 Medium al crioviale e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 15 ml e aggiungere 1 ml di mezzo E8. Le cellule di spin 300 xg per 3 min.
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 250 μl di media di temperatura ambiente E8. Trasferire la sospensione cellulare nel pozzetto preparato e aggiungere un supplemento di vitalità cellulare di 1% o 10 μM ROCKi. Incubare la piastra di coltura tissutale a 37 ° C.

Risultati

Dalla biopsia alle cellule hiPS

L'intero processo dalla biopsia alle cellule hiPS stabilite, lontano dal vettore di riprogrammazione e pronto per la caratterizzazione, richiede circa 16 settimane ( Figura 1 ). Una sequenza più dettagliata è specificata nella Figura 2A . Circa 4 settimane sono necessarie per stabilire e ampliare le colture di fibroblasti. Le prime c...

Discussione

Il risultato atteso di questo protocollo è la generazione di successo di diverse linee cellulari hiPS derivate clonali. Importante, il metodo per la manutenzione e l'espansione delle cellule hiPS stabilite qui descritto è affidabile e può essere eseguita con poca esperienza precedente della coltura delle cellule staminali. La passaggio di cellule enzimatiche con ROCKi insieme alla matrice LN-521 è noto per mantenere le cellule come cariotipicamente normali, pluripotenti e facilmente capaci di differenziarsi evit...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage