ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

要約

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。

要約

Xeno-freeおよび完全に定義された条件は、均一なヒト誘導多能性幹（hiPS）細胞の堅牢で再現性のある世代のための重要なパラメータである。フィーダー細胞または未定義マトリックス上のhiPS細胞の維持は、バッチの変動、病原性の汚染および免疫原性のリスクに影響されやすい。定義された組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスを異種非含有培地および規定培地と組み合わせて使用​​することにより、変動性が減少し、hiPS細胞の一貫した生成が可能になる。センダイウイルス（SeV）ベクターは、非組み込み型RNAベースのシステムであるため、組み込みベクターが有するゲノムの完全性に対する潜在的な破壊的効果に関連する懸念を回避することができる。さらに、これらのベクターは真皮線維芽細胞の再プログラミングにおいて比較的高い効率を示した。さらに、細胞の酵素的な単細胞継代は、実質的に以前の経験のないhiPS細胞の均質な維持を容易にする培養する。ここでは、再現性と使いやすさに重点を置いて広範囲に試験および開発され、線維芽細胞から定義された異種非含有ヒトhiPS細胞を生成するための堅牢で実用的な方法を提供するプロトコールについて説明します。

概要

Takahashi らによるhiPS細胞株の最初の誘導以来、 ^1、2 、hiPS細胞は、疾患モデル化、創薬、および再生医療における細胞療法を生成するための原材料として有用なツールを提供している³ 。 hiPS細胞培養は、線維芽細胞フィーダー細胞^4,5またはマトリゲル⁶および胎児ウシ血清（FBS）を含有する培地製剤との共培養に長く依存してきた。バッチ間の変動は、これらの培養条件の未定義の性質の共通の結果であり、予測不可能な変動をもたらし、これらのプロトコルの信頼性に大きく寄与する⁷ 。 Essential 8（E8） ⁸および定義された細胞培養マトリックス、例えばLN-521 ^9のような規定された培地の開発は、高度に再現可能なプロトコールの確立および均質なhiPS細胞の堅牢な生成および維持を助けるためのものである7,8,9,10。

統合型の再プログラミング技術の開発は飛躍的な進歩を遂げています。もともと、再プログラミングは、ゲノムの完全性に破壊的な影響を与えてゲノムにランダムに組み込まれたレトロウイルスベクターに依存していました¹¹ 。再プログラミング方法の進歩には、RNAに基づくベクターの開発が含まれる。 RNAベクターは、ゲノム組換えによる意図しない組込みが不可能であるため、DNAベースの再プログラミング方法よりも有利である¹² 。 SeVベクターは、DNA相^11を持たない一本鎖RNAを介して、外因性因子の高い一過性の発現を提供する。 SeVによって送達された再プログラミングベクター細胞の増殖の至るところで希釈され、最終的に培養から脱落して、フットプリントの自由な再プログラミング方法を提供する。その後、多能性の維持は、多能性遺伝子の内在的発現に依存する² 。

先駆的なhiPS細胞ベースの治療法が臨床試験に移行し始めているため、標準化されたバッチ、再現性、および安全性に対する要求は、 ¹³に対処するための重要な課題です。したがって、動物起源の製品は避けるべきである。例えば、異種産物の使用は、非ヒト病原体汚染のリスクと関連している。また、動物由来の培養成分の存在下で培養された細胞は、非ヒトのシリア酸を細胞膜に取り込ませ、誘導された細胞を免疫原性にすると脅かされている¹⁴ 。したがって、将来の臨床研究には、異種産物を排除する必要があります。このプロトコルはxeを適用しますhiPS細胞の維持における無細胞で規定された培養は、細胞を臨床コンプライアンスに近づける。

このプロトコルは、線維芽細胞から標準化されたhiPS細胞を生成する、一貫性があり、再現性があり、使い易い方法を記載しています。また、確立されたhiPS細胞の維持のための使いやすい培養システムを提供します。このプロトコールは、Karolinska Institutetのスウェーデン国内ヒトiPSコア施設で、300以上のhiPS細胞株を誘導するために使用されています。

プロトコル

患者物質の収集およびhiPS細胞の誘導は、2012年3月28日のストックホルム倫理審査委員会の登録番号：2012 / 208-31 / 3によって承認されています。細胞培養ステップは、特に明記しない限り、バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細胞を扱うときは、常に無菌操作技術を実践してください。開始前に培地、プレートおよび試薬を室温に戻す。高湿度下、37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートする。

1.皮膚生検からのヒト線維芽細胞の単離

1. 培養液の調製、消化酵素、皿のコーティング、切開器具。
   1. 線維芽細胞培地：イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）44.5mL、胎児ウシ血清（FBS）5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン（PEST）500μL（ 表1参照）を4℃で保存する。
   2. 1mg / mLの作用濃度で消化酵素を調製する：wei4mlのディスパーゼおよびコラーゲナーゼI型パウダーのアリコートを別の15mLチューブに入れ、4mLのDMEM / F12 + 1％PESTに溶解する。酵素溶液を0.22μmのストレーナーに通すことによって酵素溶液を滅菌する。毎回新鮮な酵素溶液を調製する。
   3. リン酸緩衝化生理食塩水（DPBS）中の0.1％ゼラチン1mLで切開した生検当たり6ウェル組織培養プレート（または35mm組織培養皿）に1ウェルをコートする。室温で30分間インキュベートする。
   4. 解剖のための生検あたりの外科用ハサミと鉗子のオートクレーブ1セット。
2. 生検処置
   注：採取後、できるだけ早く生検材料を処理する。 PBS + 1％PEST中で4℃で48時間保存する。生検のサイズは、直径2〜4 mmで、倫理的な許可が必要です。
   1. 生検を35mm皿に移す。生検を新しい35 mmの皿に移し、70％エタノール2 mLに生検を30秒間浸す。
   2. 生検を3番目に移動する35 mm皿に入れ、1％PESTを補充した滅菌ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）1 mLで洗浄する。
   3. 生検を第4の35mm皿に移し、新鮮に調製した0.1％ディスパーゼ溶液1mLを加える。
   4. 外科用はさみと鉗子を使用して、皮膚生検を1〜2mm ³個に切り、ディスパーゼ溶液を含む生検片を15mLチューブに移す。ディスパーゼを2 mL追加します。
   5. 35 mmディッシュを1 mLディスペース溶液ですすぎ、15 mLチューブに移す。
   6. 生検を4℃で一晩インキュベートする。
   7. 0.1％コラゲナーゼI 4mLをチューブに加え、37℃で4時間インキュベートする。
   8. 消化した細胞を300 xgで3分間遠心分離し、上清を吸引し、2 mlの線維芽細胞培地に消化液を再懸濁する。
   9. 6ウェル組織培養プレートからゼラチン溶液を除去する。残りの断片を含む細胞懸濁液を6ウェル組織培養プレート（または35μmDPBS中の0.1％ゼラチンでプレコートした。
   10. 3日ごとに培地を交換する。
3. ヒト線維芽細胞の増殖
   注：線維芽細胞は、80％コンフルエントになるとT25（25cm ² ）組織培養フラスコに継代する準備ができています（ 図2B ）。線維芽細胞は、典型的には、7日以内に80％の集密度に達する。ただし、必要な時間は大きく変わる可能性がありますが、4週間を超えてはなりません。
   1. 培地を吸引し、2.5mLのDPBSで1回洗浄する。
   2. DPBSを除去し、Trypsin-EDTA（0.05％）1 mLを添加し、37℃で5分間または細胞が丸みを帯びて剥がれ始めるまでインキュベートする。
   3. 必要に応じて細胞をすすぎ、細胞の適切な解離を確実にするために、2mLの線維芽細胞培地を加える。細胞溶液を15mLチューブに移し、300xgで3分間遠心分離する。
   4. 上清を捨て、細胞ペレットを5mLの線維芽細胞培地およびプレート線維芽細胞に再懸濁する。被覆された細胞組織培養T25フラスコ。この工程の後に線維芽細胞を増殖させる場合には、上記のように解離し、12x10 ³細胞/ cm ^2で播種する。
   5. コンフルエントな細胞が凍結する準備ができたら、再プログラミングのために拡大または平板培養する。再プログラムを開始する前に、2ラウンドの線維芽細胞を凍結する（凍結手順については次のセクションを参照）。再プログラミング効率は一般に、より低い継代線維芽細胞についてより高く、継代2〜4での細胞が最適である。しかし、このプロトコールを用いて、10代までの線維芽細胞の再プログラミングが成功した。
4. 線維芽細胞の凍結融解
   1. 新鮮な線維芽細胞凍結培地：90％FBS + 10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を調製する。 4℃に保つ（ 表1 ）。コンフルエントになると、T25組織培養フラスコを3つの冷凍庫に凍結することができる。バイアル凍結するごとに線維芽細胞凍結培地500μLを調製する。
   2. 細胞を凍結させるには、c細胞を血球計数器を用いて計数し、3×10 ⁵細胞の部分を15mLチューブに移す。 3分間300 xgでチューブを回転させます。上清を吸引する。
   3. 細胞ペレットを500μLの4℃線維芽細胞凍結培地に再懸濁し、クライオバイアルに移す。バイアルを凍結容器に入れ、細胞を-80℃で24時間インキュベートしてから、長期間保管するために液体窒素に移す。
   4. 細胞を解凍するには、クライオバイアルの底部を37℃の水に浸します。液化したら、細胞懸濁液を15mLチューブに移し、5mLの線維芽細胞を加える。細胞を300 xgで3分間回転させる。
   5. 上清を除去し、5mLの線維芽細胞培地で細胞ペレットを再懸濁する。細胞を非被覆T25組織培養フラスコに移し、37℃でインキュベートする。

2.線維芽細胞のSeVベクターの再プログラミング

1. ベクターアリコートの調製
   注意：生物安全性レベル2の格納容器の下でSeVを取り扱ってください。製造元のプロトコールおよび現地ガイドライン^17を参照してください。ウイルス力価はバッチごとに異なります。
   1. アリコートを調製する前に、メーカーのプロトコール（ 例えば 、CytoTune 2.0）に従って、5×10 ⁴細胞に必要なベクターの量を計算する。ウイルス力価は、一般に8×10 ⁷ ~1.5×10 ⁸まで変動する。 5：5：3（KOS MOI = 5、hc-myc MOI = 5およびhKlf4 = MOI 3）ベクターを解凍して結合する。オートクレーブした1.5mLチューブに5×10 ⁴細胞を再プログラミングするために計算された量を加えます。再プログラムのために線維芽細胞培地でウイルスアリコートを250μLの最終容量に希釈する。
      注：各バイアルは、5×10 ⁴線維芽細胞を有する24ウェル組織培養プレートの1つのウェルの再プログラミングに有効である。ウイルスアリコートを-80℃で保存する。
2. SeVベクター形質導入
   1. 細胞を吸引する1LのDPBSで洗浄する。 DPBSを吸引し、1mLのトリプシン-EDTA（0.05％）を加える。 37℃で5分間または細胞が剥離するまでインキュベートする。
   2. 2mLの線維芽細胞を加え、細胞を再懸濁し、15mLのチューブに移す。 300xgで3分間遠心分離する。
   3. 上清を吸引し、ペレットを2mLの線維芽細胞培地に再懸濁する。
   4. 血球計算板を用いて線維芽細胞を計数し、24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに5×10 ⁴細胞を播種する。細胞を37℃で一晩インキュベートする。
   5. 細胞培養液を吸引し、SeV溶液250μLを添加し、37℃で一晩インキュベートする。
   6. 新鮮な線維芽細胞培地に毎日培地を交換する。形質導入された細胞をLN-521被覆プレートに継代する前に7日間増殖させる。通行の前日にLN-521プレートを準備する。コーティング手順については、2.3.1を参照してください。
3. 形質導入された線維芽細胞の再置換
   1. LN-521コートディッシュ：DPBS中のLN-521を最終濃度0.63μg/ cm ^2に希釈する。 60 mm組織培養皿あたり2 mlのLN-521溶液をピペットで採取する。パラフィルムを使用して60 mm組織培養皿をシールする。 4℃で一晩インキュベートする。
   2. 取扱いを容易にするために、E8培地48.5mL、E8添加物1mLおよびPEST500μL（ 表1 ）の必須8培地（E8）アリコートを調製する。
   3. 形質導入の7日後に、細胞をLN-521でコーティングした60mm組織培養皿に通す。 250μLのTrypsin-EDTA（0.05％）を添加し、37℃で5分間または細胞が剥離するまでインキュベートする。線維芽細胞2mLを加え、細胞を300xgで3分間遠心分離する。
   4. 上清を吸引する。ペレットを2mLの線維芽細胞培地に再懸濁し、細胞を血球計数器で計数する。プレコートしたプレートからLN-521溶液を吸引し、LN-521プレコート60mmディッシュ内の5mlの線維芽細胞培地に4×10 ⁴個の細胞を播種する。 Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632を加える。（ROCKi）を最終濃度5μMになるように添加した。 37℃で一晩インキュベートする。
   5. 重要なことに、翌日、培地をE8培地に交換する。毎日E8培地を交換する。 hiPS細胞コロニーは2〜3週間以内に出現する。

コロニーのピッキングとhiPS細胞の増殖

注：以下のステップは、ステレオ顕微鏡下でバイオセーフティーキャビネットの外部で行われます。ヘアネットと手技マスクの使用を推奨します。細胞培養を汚染しないように注意して作業してください。

1. 採取する前日に、LN-521被覆組織培養24ウェルプレートを調製する。 LN-521をDPBS0.63μg/ cm ²で希釈する。 250μLのLN-521溶液を24ウェル組織培養プレートの1つのウェルにピペットで入れる。パラフィルムを使用してプレートをシールする。 4℃で一晩インキュベートする。
   注：コロニーは、直径が1mmを超えるサイズに達するとすぐに拾います。コロニーは鋭いエッジを表示し、均一な月に成長する必要があります（ 図2D ）。
2. LN-521溶液を吸引し、E8500μLを24ウェル組織培養プレートの1つのウェルに加える。
3. 実体顕微鏡の下でグリッドのようなパターンでメスでコロニーをより小さな断片に切断する。機械的に細胞シートを皿から掻き取り、200μLのピペットを使用してシートを準備したウェルに移す（ 図2D -2E ）。コロニーを別々のウェルに集める。
4. 48時間培地を交換せずに細胞を付着させる。その後、E8培地を毎日交換する。
5. コロニーが> 5mmの大きさに達したとき、酵素的に細胞を単細胞としてLN-521被覆プレートの新しいウェルに通過させる。
6. 細胞培養培地を細胞から吸引し、250μLのDPBSで洗浄する。
7. DPBSを吸引する。 250μLの解離試薬を添加し、37℃で3分間インキュベートする。
8. 細胞が丸め始めたことを観察してください。デタッチ細胞を解離試薬で数回すすいでプレートから細胞を除去する。
9. E8培地500μLを15 mLチューブに添加する。解離試薬中の細胞をチューブに移し、300xgで3分間遠心分離する。
10. LN - 521プレコートされたウェルからLN - 521溶液を吸引し、500μLの室温E8培地を加える。
11. 上清を吸引し、細胞ペレットを500μLのE8培地に再懸濁する。
12. 血球計数器を用いて細胞を計数し、調製したLN-521プレコートウェル（1.25×10 4〜2.5×10 ⁴細胞/ cm ² ）中に2.5×10 4〜5×10 ⁴細胞を播種する。細胞培養フォーマットは、意図した目的に合わせて容易にアップスケールすることができる。
13. 10μMの最終濃度にROCKiを加える。 37℃で細胞をインキュベートする。
14. 毎日E8培地を交換する。細胞は、通常、4〜6日後に継代する準備ができています。約90％コンフルエントである場合、上記の単一細胞として細胞を酵素的に通過させる。
    注：再プログラムベクターは、hiPS細胞の増殖中に徐々に希釈され、継代12後には検出されない。継代的に再プログラミングされた細胞は、継代6-10周りで増殖を停止するか、またはそれらの特徴的な多能性幹細胞形態を失う（ 図3B ）。
15. hiPS細胞の凍結融解
    1. 細胞を凍結するには、上記のように単一細胞として酵素的に細胞を解離させ、細胞を血球計数器で計数し、1mLのE8培地を含む15mLチューブに2.5×10 ⁵細胞を移す。 300xgで3分間遠心分離する。上清を吸引する。
    2. 250μLの4℃PSCクライオメディウムに細胞ペレットを再懸濁し、クライオバイアルに移す。バイアルを凍結容器に入れ、細胞を-80℃で24時間インキュベートしてから、長期保存のために液体窒素に移す。
    3. 細胞を解凍するために、24ウェル組織培養のプレコートLN-521ウェルを調製するプレートを、LN-521溶液を吸引し、250μLのE8培地を添加することによって洗浄する。クライオバイアルの底部を37℃の水に浸して、小さな氷色が残るようにします。
    4. cryovialに250μLのE8培地を添加し、細胞懸濁液を15mLチューブに移し、1mLのE8培地を加える。細胞を300 xgで3分間回転させる。
    5. 上清を除去し、250μLの室温E8培地で細胞ペレットを再懸濁する。調製したウェルに細胞懸濁液を移し、1％の細胞生存補助剤または10μMのROCKiを加える。 37℃で組織培養プレートをインキュベートする。

結果

生検からhiPS細胞まで

生検から確立されたhiPS細胞までの全過程は、再プログラミングベクターがなく、特性決定の準備ができてから約16週間かかる（ 図1 ）。より詳細なタイムラインが図2Aに示されている 。線維芽細胞の培養を確立して拡張するためには、約4週間が必要である。?...

ディスカッション

このプロトコールの予想される結果は、いくつかのクローン的に誘導されたhiPS細胞株の生成が成功したことである。重要なことに、ここに記載された確立されたhiPS細胞の維持および増殖のための方法は信頼性があり、幹細胞培養の経験がほとんどない状態で実施することができる。 ROCKiとLN-521マトリックスとの酵素的単一細胞継代は、細胞を核型正常、多能性および容易に分化させること?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dispase	Life Technologies	171105-041	Biopsy digestion
Collagenase	Sigma	C0130	Biopsy digestion
Gelatin	Sigma	G1393	Fibroblast matrix
IMDM	Life Technologies	21980002-032	Fibroblast medium
FBS	Invitrogen	10270106	Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063	Antibiotic
Essential 8 media	ThermFisher Scientific	A1517001	iPS cell culture media
LN-521	Biolamina	LN521-03	iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X	ThermoFisher Scientific	12563011	Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632	Millipore	SCM075	Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit	Life Technologies	A1377801	Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish	Sarstedt	83.3900.300	Cell culture
60 mm tissue culture dishes	Sarstedt	83.3901.300	Cell culture
24 well tissue culture plates	Sarstedt	83.3922.300	Cell culture
T25 tissue culture flasks	VWR	734-2311	Cell culture
15 mL tubes	Corning	430791	Centrifuge tubes
1.5 mL tube	Eppendorf	0030123.301	1.5 mL tube
CoolCell cell LX	Biocision	BCS-405	Freezing container
DMSO	Sigma	D2650-100ml	Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL	VWR	479-6847	Cryovials
PSC Cryopreservation Kit	Gibco	A2644601	PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%)	ThermoFisherScientific	25300054	Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12	Life Technologies	31331-028	Digestive enzymes dilutant
DPBS	Life Technologies	14190-094	PBS
HBSS	ThermoFIsher Scientific	14025-050	Biopsy preparation
Haemocytometer	Sigma	BRAND, 718920	Cell counting
Parafilm	VWR	291-1213	Sealing plates for storage