JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת cross-linking כימי בסקלרה ארנב באמצעות הדור השני הרמונית הדמיה ודיפרנציאלי סריקה calorimetry.

Abstract

שיטות לחיזוק הרקמה על ידי החדרת קשרים כימיים (שאינם אנזימטי cross-linking) לחלבונים מבניים (fibrillar collagens) לטיפול כוללות cross-linking פוטו אטמוספרי ורקמות cross-linking שיטות (TXL). שיטות כאלה עבור גרימת שינויים במאפייני רקמה מכנית להיות מועסקים בקרנית הקרנית דליל (נחלש באופן מכני) הפרעות כגון קרטוקונוס, כמו גם את sclera ב קוצר ראייה מתקדמת, בו דליל ואת היחלשות של הצד האחורי בסקלרה מתרחשת ותורם סביר כדי התארכות צירית. החלבונים המטרה העיקרית לחיזוק רקמות כאלה הם collagens fibrillar, המהווים את הרוב הגדול של חלבונים משקל יבש קרנית, sclera. הצלחתנו, fibrillar collagens הן המקור העיקרי של אותות הרמונית הדור השני בחלל חוץ-תאית ברקמות. לכן, השינויים של החלבונים קולגן, כגון אלה המושרה דרך cross-linking טיפולים, יכול באופן פוטנציאלי ועוזרת quantitated באמצעות מיקרוסקופ הרמונית הדור השני (SHGM). ניטור SHGM אותות באמצעות לייזר למערכת מיקרוסקופ בשילוב עם אור אינפרא-אדום עירור סריקת מקור הוא שיטת ההדמיה מודרני מרגש את נהנית השימוש הנרחב במדעים ביו. לפיכך, המחקר הנוכחי נערך על מנת להעריך את השימוש במיקרוסקופ SHGM כמו אמצעי למדידת המושרה cross-linking אפקטים ב- ex-vivo ארנב בסקלרה, בעקבות זריקה של חומר כימי cross-linking הסוכן לחלל תת-לגלף קוצים של (sT), הזרקת הגישה כי הוא מנהג לגרימת הרדמה עינית במהלך הליכי קליניים ophthalmologic. החומר הכימי cross-linking הסוכן, נתרן hydroxymethylglycinate (SMG), נמצא במרחק של מחלקה של קוסמטיים משמרים המכונה פורמלדהיד שחרור סוכנים (פארס). שינויים scleral בעקבות התגובה עם SMG, גרמו העלאות SHG אותות, בקורלציה עם שינויי טמפרטורה דנטורציה תרמי, שיטה סטנדרטית להערכת המושרה רקמות cross-linking אפקטים.

Introduction

. קוצר ראייה מתקדמת היא שמהווה יהיה ניתן לטיפול באמצעות אי-אנזימטי scleral cross-linking (פוטו אטמוספרי ו/או כימית), זה הגיוני בהתחשב בכך חסימת קולגן cross אנזימטי-linking יכול להגדיל טופס ניסיוני קיפוח (FD)-induced קוצר ראייה1. Elsheikh ו פיליפס2 שנדונו לאחרונה את היתכנות ופוטנציאל השימוש הקרנה רגיל אולטרה סגול-A (UVA)-ריבופלבין מתווכת פוטו אטמוספרי cross-linking (הידוע גם בשם דרזדן לפרוטוקול), מקוצר כאן בתור (ריבופלבין CXL) לייצוב scleral האחורי לעצור את התארכות צירית, קוצר ראייה. שיטה זו פוטו אטמוספרי שימש בהצלחה לטיפול הקשורה של המשטח הקדמי גלוב (קרי, הקרנית בולטות) ראיתי קרטוקונוס, פוסט-לאסיק keratectasia. עם זאת, יישום של הפרוטוקול CXL עבור בסקלרה מתעכבת על ידי נושאים הקשורים קשיים בגישה sclera האחורי עם מקור אור אולטרה סגול (UV), כמו גם את הצורך לשינוי הרבה יותר רקמת פני שטח. כי נאמר, הגישה CXL שימש לעצירת התארכות צירית בצורה ויזואלית, שללה ארנבים (על-ידי tarsorrhaphy), למרות מספר מחוזות בסקלרה האחורי נדרש אזורי הקרנה נפרדים מרובים באותו מחקר3. לעומת זאת, הזרקה של ייצוב סוכן כימי (קרי, הסוכן cross-linking) דרך המרחב הקדוש יכול לייצג דרך פשוטה יותר כדי לשנות את sclera האחורי, נמנע הצורך היכרות עם מקור אור UV. טכניקת ההזרקה הזו מוכרת היטב דרך שימושית של גרימת הרדמה עינית במהלך הליכי ophthalmologic כגון קטרקט כירורגיה4,5,6. Wollensak7 תיאר בעבר השימוש זריקה sT באמצעות גליצראלדהיד (cross-linking סוכן כימי דומה ברעיון פורמלדהיד שחרור סוכנים (פארס) המתוארים במחקר זה) להתקשות את sclera ארנב ואת genipin יש הוכח כדי להגביל את אורך צירית ב- FD שרקנים8,9. חוקרים אלה הראו יתרון ברור של שימוש סוכן כימי מסיסים על הטכניקה CXL פוטו אטמוספרי. לפיכך, scleral cross-linking באמצעות סוכן כימי זריקות מסוג כלשהו, כולל את פארס (קרי, TXL)10, יכול לספק שיטת טיפול אפשרי לעצור את ההתקדמות של התארכות scleral ראיתי קוצר ראייה.

ב הפרוטוקולים המובאת כאן, אנו משתמשים פתרון cross-linking כימית של נתרן hydroxymethylglycinate (SMG), באמצעות הזרקת sT לסקלרה של ארנב cadaveric עיניים. יישמנו פרוטוקולים דומה בעבר עבור אקטואלי כימי cross-linking הקרנית. ובמיוחד במחקרים שדווחה בעבר האלה, ריכוז התלויים cross-linking אפקטים היתה אפשרות להשיג באמצעות SMG, עם מגוון אפקט הנמשכים מעל זה השגה עם פוטו אטמוספרי CXL כפי שנקבע על ידי ניתוח דנטורציה התרמי11 .

כאן נתאר פרוטוקולים כדי להעריך את השפעת SMG מועברת באמצעות זריקות sT רקמת scleral, דנטורציה תרמי באמצעות Calorimetry סריקה דיפרנציאלית (DSC), ואת השנייה הרמונית דור מיקרוסקופ (SHGM) cross-linking.

שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה (DSC), הידוע גם בשם אנליזה תרמית, מעבר דנטורציה תרמי נמדד, בשביל לרקמות scleral זה יוכפל לאחר המרתו מודרכת על ידי תכונות collagens fibrillar, מאז הם מהווים את הרוב בצובר של חלבון. שיטה זו מוערך יציבותו של המבנה המולקולרי של קולגן, חוב צולבים לייצב את הסיבים קולגן, מבנה שלישוני מקור החלבון העיקרי. במהלך חימום DSC, טמפרטורה קריטית המעבר מושגת שתוצאתו דנטורציה של מולקולת הקולגן, וכתוצאה מכך שהשתחרר של סליל משולש, תהליך המהווה מה הידוע בכינויו ג'לטין. דנטורציה תרמית זה משבש קשרי מימן לאורך מולקולת הקולגן, יכול להיות מוזז שהטמפרטורות עד המושרה cross-linking שיטות12,13. בשיטה זו נעשה שימוש במשך עשורים רבים, במיוחד בענף biomaterials ועל תהליכים הכוללים הכנת עור. אולם, שיטה זו דורש מיצוי של הרקמה בסקלרה, ולכן יכול להיות רק שימושי כמו טכניקה ex-vivo .

הדור השני-הרמוני מיקרוסקופ (SHGM) מבוססת על מאפיינים אופטיים ליניארי של חומר מסוים, עם סביבות מולקולרית הלא-centrosymmetric. חומרים כאלה, אור אינטנסיבי, לדוגמה אור המיוצר על ידי לייזרים, מחולל אותות SHG, שבו התקרית אור מוכפל בתדר. חומרים ביולוגיים ידועים כדי ליצור SHG אותות הם קולגן, microtubules, שרירים צולבות הקישור חוטים שרירן. לדוגמה, קולגן מתלהבים עם אור אינפרא-אדום של גל nm 860 יפלוט אות SHG בטווח גלוי עם 430 ננומטר אורך הגל. השני הרמונית דור (SHG) אות הדמיה היא שיטה מבטיחה להערכת cross-linking קולגן טיפולית. זה ידוע כבר יותר מ-30 שנה כי הסיבים קולגן ברקמות פולטים אותות SHG14. עם זאת, רק לאחרונה יכול תמונות ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג15 במגוון של רקמות, כולל גיד16, עור, סחוס17, כלי הדם18, ו קולגן ג'לים19.

בהתבסס על הידע הזה, מחקר זה מעריך את השינויים אות SHG המושרה בסקלרה דרך SMG כימית המושרה cross-linking של קולגן. התוצאות מצביעות על כי השינוי SMG בסקלרה מגביר את אותות SHG המופק רקמת קולגן סיבים חבילות (גבוה יותר סדר רבעוני המבנה המורכב קולגן הסיבים), מייצרת גם בשינוי מורפולוגיות מבני הקולגן רשת סיבים, משתקפת סיבים צרור "מיישר."

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בוצעו באמצעות ארנב cadaveric העיניים בתוך ראשי ארנב outbred ללא פגע. הנחיות גופים מוסדיים וכל הלאומי טיפול ושימוש של חיות מעבדה עקבו אחריך

1. הכנת פתרונות

  1. SMG הכנה TXL:
    1. להכין 1 מ"ל של 0.2 מ' ריכוז נתרן ביקרבונט פתרון (NaHCO3) הפתרון באמצעות 0.0165 גר' אבקה NaHCO3 מומס 1 מ"ל של מים מזוקקים.
    2. להמיס 0.1016 מ"ג נתרן אבקת hydroxymethylglycinate (SMG) 1 מ"ל של מים מזוקקים להגיע לריכוז סופי של 800 מ מ SMG. להתאים את הפתרון סודיום ביקרבונט ריכוז סופי של 0.1 M NaHCO3 ו- 400 מ SMG. ריכוזי SMG בהתאם cross-linking לאפקט הרצוי. בפרוטוקול המתוארים כאן השתמשנו 40, 100 ו- 400 מ SMG.

2. subTenon של הזריקה עבור TXL באמצעות SMG

  1. למלא מזרקים אינסולין 1 מ"ל שני (25 גרם מחטים) עם שליטה µL 400 והפתרון SMG, בהתאמה.
  2. מקום הראש של הארנב מטוס פרופיל בעזרת כרית. קלקר או מחסנית הנייר ניתן לתקן את הראש במצב אופטימלי.
  3. תמשוך את העפעפיים עם מפשק רחם רפואת עיניים.
  4. למדוד את ראשוני לחץ תוך-עיני (IOP) באמצעות מכשיר tonometry applanation.
  5. לסמן באתר של הזרקת המיועד על החלק האמצעי העליון של לימבוס עם סמן רקמות.
  6. . משכי לחמית סביב האתר של הזרקת עם מלקחיים conjunctival (או כל מלקחיים עם קצה עגול משונן) והכנס את המחט דרך הלחמית, הזנת הכמוסה של לגלף קוצים רק מעט מעבר האתר מסומן limbal (כלומר, 2-3 מ מ לימבוס). ניתן גם לבצע חתך קטן בלחמית עם מספריים איריס כדי להקל את המעבר של המחט דרך הכמוסה של לגלף קוצים.
  7. פעם אחת בתוך הכמוסה של לגלף קוצים, ודא כי המחט הוא נייד בחופשיות על-ידי הזזתה צד אל צד. במהלך תקופה זו, העולם לא צריכים לזוז זה מאשר השמה נכונה של המחט מעל sclera ב תת-לגלף קוצים של (רח') שטח.
  8. להזריק את הפתרון של המזרק וזורקים את המחט. מייד לאחר ההזרקה, יצטברו הנוזל בחלל sT יצירה של בליטה קדמית ראה דרך הלחמית (קרי, chemosis).
  9. חזור על המדידה IOP כדי לאשר כי היא לא שינתה עקב ניקוב בהיסח הדעת של כדור הארץ.
  10. להסיר את המכסה קצ ת, ולבצע עיסוי דיגיטלי דרך העפעפיים סגורות למשך כ 2-3 דקות.
  11. . תשאיר את הראש עבור תקופת דגירה של 3.5 h (בטמפרטורת החדר = 18 ° C) הנידון להתקדם לשלב הבא.

3. רקמות הכנה

  1. תמשוך את העפעפיים בעזרת קצ ת העפעף כדי למטב גישה אל העולם. בחר בגודל אופטימלי קצ ת בהתאם לגודל העין.
  2. להפריד לחמית המקיפים את לימבוס. אם זה כבר חרות ליד האתר של הזרקת, circumferentially להרחיב את הגבולות אז זה יכיל גודל של inoculum של 1 x 1 ס מ.
  3. חותכים את שרירי העינית במיוחד באתרים שלהם של הכניסה scleral.
  4. לרומם את גלגל העין עם מלקחיים, דחיפתו מהצד האחורי. זה מספק גישה אל העולם האחורי, יקל על חיתוך של עצב הראייה עם אופטלמולוגיות עורק, וריד הממוקמים בעמוד האחורי של כדור הארץ.
  5. לגזור את corneoscleral מורכבים, עם הגבול החיצוני כולל ההזרקה מסומן. הכתם עדיין צריך להיות גלוי על החלק הנותר sclera.
  6. הסר את קורפוס vitreus ואת כל השכבות מחוברת בצד הפנימי של בסקלרה על-ידי החלת המתיחה עם מלקחיים רקמות.
    הערה: צעדים נוספים תלויים ההליכים הבאים המבוצעת: 4. - ניתוח DSC, 5. - מיקרוסקופ SHG.

4. לצורך ניתוח DSC אזוריים

  1. לעין שטופלו: לגזור ארבע סקטורים scleral מגביע scleral הנותרים עם המספריים כך באתר של הזריקה הוא בגזרה העליונה מיושרת מרכזי. לחתוך 3 המגזרים הנותרים של הצדדים לרוחב (קרי, האף ואת זמני), והן התחתון.
    הערה: המספור של המגזרים (1-4) אשר מחולקות ריבועים (1-16) הוא הפגינו איור 1A.
  2. חותכים מהמגזרים scleral (1-4) לריבועים קטנים (1-16) של 4 x 4 מ מ כל אחד. סקטור 1 צריך להיות מחולק 9 ריבועים (להפוך את האתר המדויק של הזרקת משבצת יחידה [ריבוע 2]). לחלק מגזרים 2 ו- 3 2 ריבועים (ריבועים 10-11 ו- 12-13) והמגזר 4 3 ריבועים (ריבועים 14-16).
  3. להקצות מספר כל ריבוע, כפי שמוצג באיור 1 א', כדי להתאים את המרחק של הרקמה שנותחה מהמיקום של האזור מוזרק.
  4. לעין שליטה: לאחר חלוקת הרקמה ארבע סקטורים scleral (בדומה לרקמת שטופלו) לגזור ריבוע חתיכות רקמה מהמיקומים הבאים: 3 ריבועים מהמגזר העליון (סקטור 1), 1 מ בכל צד (מגזרים 2 ו- 3), ו- 1 מ מגזר התחתון (מגזר 4).
  5. לגרד את הרבדים הנותרים רשתית, חיבור, לשטוף פעמיים עם PBS טריים בכל פעם, עוזב את החלקים בתוך פתרון עבור 10 s בכל פעם.

5. עבור הדמיה SHG

  1. חותכים את החלק העליון של sclera באמצעות מספריים כדי ליצור אזור 1 x 1 ס מ עם האתר של הזרקת מיושר מרכזי.
  2. לגרד את הרבדים הנותרים רשתית ו מקלעת דמית העין ולשטוף פעמיים עם PBS טריים בכל פעם עוזב את החלקים בפתרון במשך כ 10 s.
  3. המקום הרקמה 1 מ"ל צינורות מלאים PBS פתרון תחבורה כדי מתקן הדמיה. כל ההליכים, בעקבות זמן הדגירה, החל הקרע של גלגל העין צריכה להתבצע תוך שעה.

6. מיקרוסקופ פרוטוקול

הערה: פרוטוקול זה לאות הדמיה מפוזרים בחזרה SHG של קולגן רקמת בסקלרה המותאם במיוחד עבור הלייזר מיקרוסקופ סורק.

  1. מיקרוסקופ להגדיר
    1. כדי למקסם האות והרזולוציה כאשר ביצוע מיקרוסקופ SHG משתמש של העדשה המטרה מטב לצורך שידור אינפרא-אדום אור ועם מפתח נומרי גבוהה (NA). המטרה שלנו היא Nikon Apo LWD 25 x / NA1.1 מים טבילה.
    2. התאם את הקולר תיקון של העדשה כדי להתאים את עומק הדגימה, במקרה הזה זה העובי של coverslip, 0.17 מילימטרים.
    3. הר העדשה המטרה 25 x ומוסיפים כמות נדיבה של שימון ג'ל על בסיס מים כדי לכסות את המשטח הדמיה לפני הרכבה המדגם. הג'ל על בסיס מים לא יתפוגג במהלך הניסוי, ומכאן ישמרו על איכות התמונה.
    4. מקום הרקמה scleral של צינורית 1 מ"ל עם PBS ללא ייבוש בין שני coverslips עגול 25 מ מ (בצד episcleral למטה) מתן קשר מקסימלי בין episclera את פני השטח coverslip.
      הערה: הרקמה ניתן גם להניח חשפו על coverslip. כמות טובה של PBS צריך לשמור על הרקמה להתייבש במהלך דימות. במקרה זה, הוסף את פיסת רקמה של PBS לאחר הרכבת את cellchamber.
    5. להרכיב את התא תא על-ידי הצבת של 25-ממ עגול coverslip, יחיד או בטכניקה של סנדוויץ ', בחלק התחתון של התא, בורג את החלק העליון למטה על מנת ליצור של אטום עגול קאמרית. . אל תהרוס מטה בחוזקה כאשר coverslip העליון משמש, על מנת להימנע באופן מלאכותי שיטוח, נזק הרקמה.
    6. הר תא תא עם דגימת הרקמות על הבמה מיקרוסקופ.
    7. הגדר המיקרוסקופ לתצוגה העין באור המשודרת.
    8. למקם את הבמה ולהתאים את הגובה של המטרה כך המשטח התחתון של המדגם נמצא בפוקוס, כפי שנקבע על ידי ביקורת בשטח בהיר דרך היצירה העין.
    9. כבו אורות מלבד צג המחשב, לחסום כמה שיותר אור מהצג ככל האפשר עם סדינים רדיד אלומיניום עטוף על הבמה מיקרוסקופ. מזעור כל אור תועה להגיע את גלאי יבטיח הרכישה נמוך-רעש, כמו גלאי חאספ NDD יש רגישות גבוהה.
    10. בחלונית ' Ti Pad של התוכנה, בדוק ההגדרה עדשה שהפרטים נכונים.
    11. בחלונית ' GUI קומפקטי A1, לבחור את לייזר אינפרא-אדום עבור הדמיה, בחרו את גלאי NDD ובחרו את ערוץ דאפי מצוידת במסנן bandpass 400-450 ננומטר.
    12. בחלונית ' A1 MP GUI, להגדיר את אורך הגל של הלייזר האינפרא-אדום 860 ננומטר, פתח התריס.
    13. הגדר סריקת תנאים בחלונית GUI קומפקטי A1 כדלקמן לייזר. בחר: (א) Galvano סורק לסריקת חד-כיוונית (ב), (ג) פיקסל להתעכב זמן 6.2 µs, (ד) מסגרת בגודל 1,024 x 1,024 פיקסלים, (ה) קו ממוצע של 2 x
      הערה: Galvano והסורק סריקה חד-כיוונית מבטיחה יישור מדויק של נקודה אחרי נקודה. גודל של 1,024 x 1,024 עבור שדה הראייה מלא מיתרגם בגודל בפיקסלים של 0.5 μm /pixel. קו בממוצע יקטין את רעש שוט בתמונה.
    14. הגדר הדמיה תנאים בחלונית GUI קומפקטי A1 על-ידי התאמת רווח כוח, גלאי לייזר. פתח בהרכב תראה את הטבלה (LUTs) הצגת היסטוגרמה של ערכי העוצמה פיקסל בתמונה הנוכחית. הדמיה חיה במצב "למצוא" וקביעת להגדיל את טווח ערכי הפיקסלים שזוהו על-ידי התאמת רווח כוח, גלאי לייזר. הימנע רוויה. ערכים אופייניים הם כוח לייזר 2.5%, סך של 2.35 W-860 nm, 100 HV (גלאי רווח).
    15. הערה: עבור התקנה זו, עוצמת הלייזר נמדד עם מד הכוח הפנימי הוא 5.2 mW. בכל פעם ניסוי מבוצע, מחדש להתאים את האחוז לייזר כזה המדידה חשמל פנימית היא קבועה ב- 5.2 mW בין ההפעלות הדמיה. כדאי לשים לב בעת הגדרת עוצמת הלייזר. הלייזר זיקית II הוא לייזר W 3-800 nm, 10% או כוח עליון יכול העלול לגרום נזק לרקמות.
  2. ייבוא תמונות
    1. במצב תצוגה מקדימה, לסרוק אזור הרקמה באמצעות הכלי סקירה XYZ.
    2. הגדר את הדימות ברזולוציה נמוכה יותר (256x256 פיקסלים, אין קו בממוצע) כדי להאיץ את רכישת תמונות במצב זה.
    3. לכידת 5 x 5, 3 x 3 או תצוגה יחידה של שדות כדי לכסות את המשטח כולו של הרקמה. בכל מקום, לפני הלכידה סקירה, להפעיל את מצב "סרוק" חיים ולהביא את הרקמה להתמקד. שימו לב כי אזורים שונים של רקמת יהיה שונה מעט עמדות לכיוון צירית.
    4. למצוא אזור שטוח שבו סיבי הקולגן נראים בתחום התצוגה כולו ולחץ פעמיים את העמדה בכלי סקירה כדי לעבור את השלב למיקום מסוים זה.
    5. הפעלת מצב "סרוק" בשידור חי, להתאים את מיקום Z המטרה כך המטוס התחתון נמצא בפוקוס ולהשתמש, בלוח Ti, הכונן Z להזזת המישור אופטי 10-15 μm מעל שכבה תחתונה זו.
    6. רוכשים תמונה ברזולוציה גבוהה עם 1,024 x 1,024 פיקסלים ו- 2 x קו בממוצע, באמצעות לחצן "ללכוד".
    7. לשמור את המיקום סקירה XYZ באמצעות לחצן "+". פעולה זו מבטיחה כי באותו האזור של רקמה לא הלכידה מחדש.
    8. עבור כל פיסת רקמה ללכוד 10 תמונות של המבט של שדות שאינם חופפים.

7. DSC פרוטוקול

הערה: המשך לשלב הזה ברגע השלמת רקמות הכנה, לניתוח DSC אזורית, או לאחר רקמת הדמיה בעת ביצוע SHGM.

  1. להכין DSC מחבתות, שקל ותויגו.
    הערה: שלב זה צריך להיעשות לפני ניתוח רקמה כדי למזער רקמות לייבוש.
  2. יבש כל ריבוע scleral ברקמות ספיגה ושים אותה על החלק התחתון של הסיר DSC באמצעות מלקחיים במיתולגיות.
  3. שוקל את המחבת עם רקמות בתוך ואת המכסה crimped ורטוב מכוסה כדי להשיג את הרקמה משקל (מסה של הדגימות צריך להיות בטווח של 5 עד 11 מ ג).
    הערה: חותם כל הפאן-שימוש של צובטן לפני שימשיך דגימת הרקמות הבאה. המחבתות הן באופן הרמטי, מניעת אובדן מים לפני ניתוח תרמי.
  4. ברגע המדגם הוא מסולסל, במקום זה על מיקומה המיועד על המגש DSC. צריך להיות 6 דוגמאות עבור הפקד ו-16 לעין שטופלו.
  5. ליצור שיטה באמצעות כלי ניהול תוכנה, המציין את המשקל של הרקמה, ולהפעיל את הניתוח התרמי באמצעות הפרמטרים הבאים: טווח טמפרטורה של 40 עד 80 ° C, קצב חימום: 1 ° C/min, זרימת חום: 17.37 mW, זרימת גז (N2): 19.8 mL/min. גז בלחץ: בר 2.2.
  6. עם סיום, לנתח את הנתונים עבור כל דגימה על-ידי חילוץ הפסגה טמפרטורת המעבר-דנטורציה תרמית אשר מתרחשת באמצעות כלי ניהול התוכנה.

8. ניתוח תמונות

  1. אות SHG
    1. בחר לפחות 5-10 התמונות קנאס מתוך כל טיפול ואת השליטה שלה, כך האזור של התמונה מאוכלס בעיקר סיבי קולגן.
    2. להעלות כל תמונה בתוכנת ImageJ, למדוד את עוצמת הפיקסלים הממוצע על-ידי בחירה נתח > מדד לתמונה הפעילה.
    3. ערכי שחולצו מדווחים כמו עוצמת פיקסל רשע לבין יכול גם תוצג על-ידי ההיסטוגרמה של עוצמות על-ידי בחירה מתוך התפריט נתח > היסטוגרמה.
    4. באמצעות גיליון Excel, ליצור טבלה כדי לתעד את כל הנתונים נמדד בהתאם לזהות הדגימה
    5. לחשב את וסטיית בעוצמה פיקסל עבור כל תנאי הטיפול ושליטה.
    6. באמצעות של התלמיד במבחן t, להשוות הבדלים להשוואות pairwise כל של ריכוזים (כלומר, 40 מ מ SMG לעומת 0 ו- 400 מ מ SMG לעומת 0). [P≤0.05].
  2. Waviness
    1. בחר תמונה המציגה סיבי קולגן. צריך להיות מנותח לפחות 10 תמונות לכל דגימה (כולל דגימת בקרה לריכוז כל - לפחות 40 בסה כ).
    2. פתח ImageJ > תוספים > NeuronJ. NeuronJ דורש התקנה מוקדמת.
    3. להעלות imagesby כל גרירה לתוך חלון שנפתח NeuronJ .
    4. ליצור עקיבה קווים לאורך הסיבים, בעקבות קו המתאר של fibril עם העכבר (עט ציור טבליות יכול לשמש), לחץ על M כדי למדוד את המרחק של אורך סיבים הכולל.
    5. בחר "אפשרות" לצייר קו ישר וצורניים ולחבר את ההתחלה ואת הסוף מתאר סיבים מצוירות בעבר. כעת לחץ על M כדי למדוד את אורך מקצה-לקצה.
    6. חזור על הפעולות אותו על הסיבים לפחות 10 לכל תמונה.
    7. לאסוף את שתי מדידות מכל הסיבים 10, קלט את הנתונים לתוך גיליון אלקטרוני של excel, המבטאת אורך סיבים הכולל (מתאר) ואורך end-to-end (או מתחבר ישר קו) כמו אורך [עיקול] והאורך [ליניאריים], בהתאמה.
    8. חישוב מדד waviness (W) תוך שימוש בנוסחה: W = אורך [עיקול] / אורך [ליניאריים].
    9. לחשב את אחוז waviness השוואת נתוני התמונות של samples(SMG) שטופלו עם תמונות מדגימות שליטה באמצעות הנוסחה: (W [SMG] - 1) / (W [שליטה] - 1)
    10. לבצע מבחן t pairwise עבור אינדקס waviness (W) על מנת לקבוע את ההבדלים סטטיסטית (p-ערכים) מורפולוגיה סיבי הקולגן של בין טיפול שונה תנאים ושליטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טמפרטורה דנטורציה תרמי (Tm) כמו שיטת assay להעריך TXL cross-linking אפקט: סכום כולל של 16 זוגות עיניים ארנב שימשו בניסויים אלה ההליך TXL. כחלק הראשונית של מחקר זה, הוערך הלוקליזציה של אפקט cross-linking, המושרה על ידי זריקה אחת של SMG cross-linking סוכן דרך סנט החלל בראש ארנב cadaveric. זה סוג של ני...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מתנהל ניסויים הראו עדויות לשימוש של מיקרוסקופיית אות SHG כמו שיטה להערכה של קולגן cross-linking אפקטים ב בסקלרה, מעלים את האפשרות העתידית של שימוש בטכניקה זו כלי ניטור עבור cross-linking טיפולים זה יעד קולגן חלבונים. ראוי לציין, כלי נגינה כבר נמצא בשימוש קליני זה יכול שעלולים ללכוד את האות SHG. למרות הכלי ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים תודה Tongalp Tezel, MD, יעוץ לגבי הזרקת הקדוש; תרזה Swayne, PhD, להתייעצות בנוגע מיקרוסקופ SHG; ג'ימי Duong העיצוב ואת המשאבים ביוסטטיסטיקה המתקן ליבה ביוסטטיסטיים של מכון אירווינג-המרכז הרפואי של אוניברסיטת קולומביה.

נתמך בחלקה על ידי מחקר כדי למנוע עיוורון על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים NCRR UL1RR024156, NEI P30 EY019007, NCI P30 CA013696 ו- NEI R01EY020495 (DCP). אוניברסיטת קולומביה בעל הקניין קשורים: ארה ב הוציא פטנט לא: 8,466,203 ולא: 9,125,856. הגשנו בקשה לפטנט בינלאומי: PCT/US2015/020276.

תמונות שנאספו ב Confocal ולהעניק התמחה מיקרוסקופ לשתף משאבים של הרברט אירווינג מקיף במרכז לחקר הסרטן באוניברסיטת קולומביה, נתמך על ידי NIH #P30 CA013696 (המכון הלאומי לסרטן). מיקרוסקופ קונפוקלי נרכש עם NIH להעניק #S10 RR025686.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USADouble distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USACrosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringeBD Eclipse, NJ, USASyringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit headLa Granja poultryOutbredRabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen Reichter Technologies Depew, NYIOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 AutosamplerPerkin-Elmer Waltham, MA, USAThermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software Perkin-Elmer, Waltham, MA, USAVer 11.0 protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAA water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, TX B000URVDQ8Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara,CA, USATi:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamberThermo Fisher Scientific IncA7816Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAprotocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detectorNikon Instruments, Melville, NY, USAEquipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning systemNikon Instruments, Melville, NY, USACompatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements softwareNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJNational Institute of Health protocol step 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlandshttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAVer 14protocol step 9.2.8

References

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89(2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004(2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040(2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131hydroxymethylglycinatecross linkingcalorimetry

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved