JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает методы оценки химической сшивки кролик склеры, используя второй гармоники поколения изображений и дифференциальной сканирующей калориметрии.

Аннотация

Методы укрепления тканей путем введения химических связей (неферментативного cross-linking) в структурных белков (фибриллярного коллагены) для терапии включают фотохимического cross-linking и ткани, сшивки (TXL) методы. Такие методы для стимулирования изменения свойств механических тканей используются для роговицы роговицы истончение (механически ослаблены) расстройств, как кератоконус склеры в прогрессирующей близорукости, где истончение и ослабление кзади Склера возникает и скорее всего способствует осевое растяжение. Основная цель белки для укрепления таких тканей являются фибриллярного коллагены, которые составляют подавляющее большинство белков сухого веса в роговицы и склеры. Случайно фибриллярного коллагены являются главным источником второй гармонических поколения сигналов в пространстве внеклеточной ткани. Таким образом изменения коллагеновых белков, таких как те, индуцированной через cross-linking терапии, потенциально может быть обнаружен и предел использования второй гармоники поколения микроскопии (SHGM). Мониторинг SHGM сигналов с помощью лазерного сканирования системы микроскопии в сочетании с инфракрасного света возбуждения, что источник интересных современных изображений метод, который наслаждается широкое использование в биомедицинских наук. Таким образом, настоящее исследование было проведено для того, чтобы оценить использование SHGM микроскопии, как средство для измерения индуцированной сшивки эффекты в ex vivo кролик склеры, после инъекции химического cross-linking агент в суб Tenon пространство (sT), инъекции подход это стандартная практика для нанесения глазной анестезии при офтальмологических клинических процедур. Химической сшивки агент, натрия hydroxymethylglycinate (SMG), — от класса косметические консерванты, известный как формальдегид, выпуская агентов («фарс»). Склеры изменения после реакции с SMG привела к увеличению SHG сигналов и коррелирует с изменениями в температуре тепловой денатурации, стандартный метод для оценки индуцированной ткани cross-linking эффекты.

Введение

Прогрессирующая близорукость постулируется считаются излечимыми посредством неферментативного склеры сшивки (фотохимического и/или химических веществ), который имеет смысл, учитывая, что блокирование коллаген ферментативные cross-linking может увеличить экспериментальные формы лишения (FD)-индуцированной близорукость1. Инфекционную и Филлипс2 недавно обсуждали возможности и потенциал использования стандартной УФ А излучения (UVA)-рибофлавин опосредованной фотохимического сшивки (также известный как Дрезден протокол), сокращенно здесь как (рибофлавин CXL) для задней склеры стабилизации прекратить осевое растяжение в близорукости. Этот фотохимического метод успешно используется для лечения дестабилизации поверхности передней глобус (то есть, выпуклые роговицы), видели в keratectasia кератоконуса и пост LASIK. Однако применение этой CXL протокола для склеры препятствуют проблемы, связанные с трудностями в получении доступа к задней склеры с источником ультрафиолетового (УФ) света, а также необходимость изменения гораздо больше ткани площадью поверхности. Что сказал, CXL подход был использован чтобы остановить осевое растяжение в визуально форме лишено кроликов (Тарзорафия), хотя несколько областей задняя склеры требуется несколько отдельных облучения зон в этом исследовании3. Напротив инъекции химического стабилизирующим агента (то есть, сшивки агент) через sT пространства может представлять простой способ изменить задняя склеры, избегая необходимости введения источник ультрафиолетового света. Эта техника инъекции хорошо известен как полезный способ заставить глазной анестезии при офтальмологических процедуры, такие как Катаракта хирургии4,5,6. Wollensak7 описал ранее использование sT инъекции с помощью Глицеральдегид (химической сшивки агент схожая по концепции с формальдегидом, выпуская агентов (фарс), описанные в данном исследовании) застывать кролик склеры и genipin имеет был показан для ограничения осевой длина в FD морских свинок8,9. Эти исследователи продемонстрировали явное преимущество использования растворимых химического агента над фотохимического CXL технику. Таким образом, склеры сшивки с помощью инъекции химического агента некоторого типа, в том числе фарс (т.е., TXL)10, может предоставить метод лечения возможно остановить прогрессирование склеры удлинения, видели в близорукости.

В протоколах, представленные здесь мы используем химической сшивки раствор натрия hydroxymethylglycinate (SMG), через sT инъекции склеры глаз трупной кролика. Мы внедрили аналогичные протоколы ранее для актуальных химической сшивки в роговице. Особенно в этих исследованиях сообщалось ранее концентрация зависимых cross-linking эффекты могут быть получены с помощью SMG, с диапазоном эффект, охватывающих значительно выше, достижимые с фотохимическими CXL определяется тепловой денатурации анализа11 .

Здесь мы описываем протоколы для оценки сшивки эффект SMG, доставлено через sT инъекции склеры ткани, тепловой денатурации с помощью сканирования дифференциальной калориметрии (ДСК) и второй гармоники поколения микроскопии (SHGM).

С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), также известный как термический анализ, тепловой денатурации переход измеряется, который для склеры ткани является преимущественно, руководствуясь свойства фибриллярного коллагены, поскольку они составляют большинство массовых белка. Этот метод оценивает стабильность молекулярной структуре коллагена и сшитого облигации, которые стабилизировать фибрилл коллагена, структуры основных высших белков. Во время нагревания в DSC, критического переходного периода температура достигнута, приводит к денатурации коллагена молекулы, что приводит к разматывающее тройной спирали, процесс, который формирует то, что широко известен как желатин. Этот тепловой денатурации разрушает водородные вдоль молекулы коллагена и может быть перенесен в более высоких температурах посредством индуцированного сшивки методы12,13. Этот метод был использован для многих десятилетий, особенно в индустрии биоматериалов и для процессов, которые включают кожа решений. Однако этот метод требует извлечения склера ткани и поэтому может быть только полезным ex vivo технику.

Микроскопия генерации второй гармоники (SHGM) на основе нелинейных оптических свойств конкретных материалов, с не Центросимметричная молекулярных сред. Например в таких материалах, интенсивный свет, свет производства лазеров, генерирует сигналы ГСП, в которых падающего света в два раза частотой. Биологические материалы, которые известны для создания SHG сигналы являются коллаген, микротрубочки и миозина мышц. Например коллаген, возбужденных с инфракрасным излучением 860 нм длины волны будет излучать сигнал ГСП в видимом диапазоне с 430 Нм длины волны. Второй гармоники поколения (SHG) сигнал изображений является перспективным методом для оценки терапевтических коллагена сшивание. Более 30 лет было известно, что фибрилл коллагена в тканях излучают SHG сигналы14. Однако только недавно изображения с высоким разрешением можно15 в различных тканях, включая сухожилия16, кожи, хряща17,18кровеносных сосудов и коллагеновые гели19.

Основываясь на этом знании, данное исследование оценивает изменения сигнала ГСП, индуцированной в склеру через SMG химически индуцированных сшивания коллагена. Результаты показывают, что SMG модификация склеры увеличивает сигналы ГСП, производится из ткани коллагена расслоений (выше порядок Четвертичная структура состоит из фибрилл коллагена), а также производит структурных морфологических изменений в коллагена оптической сети, отражено в волоконно расслоение «выпрямление».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были проведены с использованием трупной кролика глаза в рамках главы нетронутыми беспородных кролика. Были соблюдены все институциональные и национальные руководящие принципы для ухода и использования лабораторных животных.

1. Подготовка решений

  1. SMG подготовкой для TXL:
    1. Готовим 1 мл 0,2 М концентрации раствора бикарбоната натрия раствор (3NaHCO), с использованием 0,0165 г NaHCO3 порошка растворяют в 1 мл дистиллированной воды.
    2. Растворяют в 1 мл дистиллированной воды, чтобы получить окончательный концентрация 800 мм SMG 0.1016 мг порошка натрия hydroxymethylglycinate (SMG). Отрегулируйте раствор бикарбоната натрия до конечной концентрации 0,1 М NaHCO3 и 400 мм SMG. Концентрации SMG в зависимости от желаемого эффекта сшивки. В протоколе, в описанный здесь мы использовали, 40, 100 и 400 мм SMG.

2. subTenon инъекции для TXL, используя SMG

  1. Заполните два инсулиновые шприцы 1 мл (25G иглы) с 400 мкл управления и решения SMG, соответственно.
  2. Место головы кролика в плоскости профиля с помощью подушки. Пенополистирола или стопку бумаги может использоваться для исправить голову в оптимальное положение.
  3. Убрать веки с педиатрического глаза зеркало.
  4. Измерьте первоначальный внутриглазного давления (ВГД) с помощью устройства applanation тонометрия.
  5. Марк месте предполагаемой инъекции в верхней средней части лимба с ткани маркер.
  6. Убрать конъюнктивы, окружающие место инъекции с конъюнктивы щипцы (или любой щипцы с зубчатыми круглым наконечником) и вставьте иглу через конъюнктиву, введя капсулу Tenon чуть-чуть за пределами заметное послабляющие сайта (т.е., 2-3 мм от лимба). Небольшой надрез в конъюнктиве можно также с диафрагмой ножницы для облегчения прохождения иглы через Tenon в капсуле.
  7. Однажды в шип в капсуле, убедитесь, что игла свободно мобильных, перемещая его стороны в сторону. В это время всему миру не должны двигаться. Это подтверждает правильное размещение иглы выше склеры в суб Tenon's (sT) пространства.
  8. Раствор из шприца и Выбросьте иглу. Сразу же после инъекции жидкость накапливается в пространстве sT, создавая передней дуге сквозь конъюнктивы (то есть, хемоз).
  9. Повторите измерения ВГД для того, чтобы подтвердить, что он не был изменен из-за случайного перфорация земного шара.
  10. Удалите крышку зеркало и выполнить цифровой массаж через закрытые веки для около 2-3 мин.
  11. Покинуть голову для инкубационный период 3,5 ч (комнатной температуры = 18 ° C), до перехода к следующему шагу.

3. Подготовка тканей

  1. Убрать веки, используя веко зеркало для того чтобы оптимизировать доступ к миру. Выбор оптимального размера зеркало в зависимости от размера глаза.
  2. Отдельные конъюнктивы, окружающих лимба. Если он уже были врезаны неподалеку от места инъекции, окружности раскройте границы, поэтому он будет содержать посевным материалом размером приблизительно 1 x 1 см.
  3. Вырежьте экстра глазные мышцы, на их сайтах склеры вставки.
  4. Поднимите глазного яблока с щипцами, толкая его от задней стороны. Это обеспечивает доступ к задней глобус и будет способствовать резки зрительного нерва с глазной артерии и Вены, расположенные возле заднего полюса мира.
  5. Вырежьте из Корнеосклеральный комплекс, с внешней границы, включая отмеченные укола. Пятно все еще должна быть видна на остальной частью склеры.
  6. Удалите все слои, прилагается к внутренней стороне склеры, применяя тяги с щипцами ткани и vitreus корпус .
    Примечание: Дальнейшие действия зависят от следующих процедур осуществляется: 4. - анализ DSC, 5. - SHG микроскопии.

4. для регионального анализа ДСК

  1. Для глаз лечение: вырезают четыре склеры секторов из оставшихся склеры Кубка с ножницами так, что сайт инъекции расположен в верхнем секторе и соответствие централизованно. Вырежьте оставшиеся 3 секторов как боковых (т.е., носа и временных), так и снизу.
    Примечание: нумерация секторов (1-4), которые далее подразделяются на квадраты (1-16) показана на рисунке 1A.
  2. Вырежьте склеры секторов (1-4) на меньшие квадраты (1-16) примерно 4 x 4 мм каждая. Сектор 1 следует разделить на 9 квадратов (сделать точное место инъекции отдельные площади [2]). Разделите секторах 2 и 3 на 2 квадратов (квадратов, 10-11 и 12-13) и сектор 4 на 3 квадратов (квадраты 14-16).
  3. Присваивает номер каждый квадрат, как показано на рисунке 1A, чтобы локализовать расстояние проанализированы ткани от местоположения района вводят.
  4. Для управления глаз: после того, как разделить четыре склеры сектора (по аналогии с обработанной ткани) ткани вырезают квадратные куски ткани из следующих местоположений: 3 квадратов от верхней сектор (сектор 1), 1 с каждой стороны (сектора 2 и 3) и 1 из Нижний сектор (сектор 4).
  5. Соскрести оставшихся слоев сетчатки и хориоидеи и мыть дважды с свежими PBS каждый раз, оставляя куски, погруженной в растворе для приблизительно 10 s в то время.

5. для визуализации SHG

  1. Вырежьте в верхней части склеры, используя ножницы для создания области 1 x 1 см с сайтом инъекции, соответствие централизованно.
  2. Соскрести оставшихся слоев сетчатки и сосудистое и дважды промыть свежим PBS каждый раз оставляя куски в растворе для приблизительно 10 s.
  3. Место ткани в 1 мл трубки заполнены раствором PBS для транспортировки для визуализации объекта. Все процедуры, после время инкубации и начиная с вскрытия глазного яблока должно выполняться в течение часа.

6. микроскопия протокол

Примечание: Этот протокол для изображений обратно рассеянном SHG сигнала от коллаген склера ткани специально для лазерный сканирующий микроскоп.

  1. Микроскопия, Настройка
    1. Для максимального сигнала и резолюции при выполнении SHG микроскопии объектива оптимизировать для передачи инфракрасного света и с высокой числовой апертуры (NA). Наша цель – Nikon АПО LWD 25 x / NA1.1 воды погружения.
    2. Отрегулируйте воротник Коррекция объектива соответствует глубине образца, в этом случае, толщина coverslip, 0.17 миллиметров.
    3. Маунт 25 x объектив и добавить большое количество смазки на водной основе геля для покрытия поверхности изображений перед монтажом образца. Гель на водной основе не будет испаряться в ходе эксперимента и следовательно, будет поддерживать качество изображения.
    4. Место склеры ткани от 1 мл с PBS без сушки между двумя 25-мм круглые coverslips (эписклеральные стороной вниз) предоставление максимального контакта между эписклерой и coverslip поверхности.
      Примечание: Ткани могут также быть размещены открытые на coverslip. Хорошее количество PBS следует сохранить ткани, увлажненной во время визуализации. В этом случае добавьте кусок ткани и PBS после монтажа cellchamber.
    5. Соберите зале клеток, поместив 25-мм круглые coverslip, один или в сэндвич технике, в нижней части камеры и привинтить верхнюю часть вниз для того чтобы создать запечатанный вокруг камеры. Не винт вниз плотно когда Топ coverslip используется, чтобы избежать искусственно уплощение и повреждение тканей.
    6. Смонтируйте клетки камеры с образца ткани на микроскопа.
    7. Набор микроскоп для глаз мнение с пропускаемого света на.
    8. Расположите стадии и отрегулируйте высоту цели таким образом, чтобы нижняя поверхность образца находится в фокусе, как определяется светлые области инспекции через глаз кусок.
    9. Выключите все огни, за исключением монитора компьютера и блокировать столько света от монитора как можно с алюминиевой фольги листы драпированные на микроскопа. Сведение к минимуму любых рассеянный свет, достигнув детекторы обеспечит приобретение низким уровнем шума, как детекторы Хаасп NDD имеют высокую чувствительность.
    10. В панели Ti Pad программного обеспечения проверьте правильность определения объектива.
    11. В панели A1 компактный GUI выберите ИК лазер для изображений, выберите NDD детекторы и выбрать DAPI канал, который оснащен 400-450 Нм полосовой фильтр.
    12. В панели А1 MP GUI, задайте волны инфракрасного лазера 860 нм и откройте затвор.
    13. Установки лазерного сканирования условий в панели A1 компактный GUI следующим образом. Выберите: сканер гальвано (), (b) однонаправленного сканирование, (c) пикселей останавливаться время 6.2 МКС, кадра (d) размер 1 024 x 1 024 пикселей, (e) линии в среднем 2 x
      Примечание: Гальвано сканера и однонаправленная сканирования обеспечивает точное выравнивание точка за точкой. Размер 1024 x 1024 для полное поле зрения переводится пикселя размером 0,5 мкм /pixel. Линии в среднем уменьшит Дробовой шум в изображении.
    14. Получить набор изображений условий панели A1 компактный GUI, регулируя мощность лазера и детектора. Откройте панель выглядят таблицы (ТМП), которая отображает гистограмму значений интенсивности пикселей в текущем образе. Включите живых изображений в режиме «Найти» и максимального обнаруженного диапазона значений пикселов, регулируя лазерный детектор и мощность усиления. Избегайте насыщения. Типичные значения — 2,5% мощности лазера, из в общей сложности 2,35 W на 860 нм и 100 HV (детектор прибыль).
    15. Примечание: Для этой установки, мощность лазера, измеренная с внутренней ваттметр является 5.2 МВт. Каждый раз, когда проводится эксперимент, подрегулировать процент лазер, таким образом, что измерения внутренней мощности является постоянным на 5.2 МВт между сессиями изображений. Следует позаботиться при определении мощности лазера. Хамелеон II лазер является 3 Вт лазер на 800 Нм и 10% или более высокой мощности потенциально может вызвать повреждение тканей.
  2. Получение изображения
    1. В режиме предварительного просмотра сканирования области ткани, используя инструмент XYZ обзор.
    2. Набор изображений с низким разрешением (256 x 256 пикселей и не линия усреднения) ускорить приобретение изображения в этом режиме.
    3. Захват 5 x 5, 3 x 3 или единого поля зрения для покрытия всей поверхности ткани. В каждом месте, до захвата обзор включите режим живой «Сканировать» и принести ткани в фокус. Обратите внимание, что различные регионы ткани будет иметь несколько различных позиций в осевом направлении.
    4. Найти плоской области, где видны в поле зрения весь коллагеновые волокна и дважды щелкните эту позицию в средстве обзор переехать на стадии в определенном месте.
    5. Включите режим живой «Сканировать», отрегулировать положение Z цели таким образом, что в нижней плоскости находится в фокусе и, для перемещения плоскости оптической 10-15 мкм выше это нижний слой Ti Pad, используйте диск Z.
    6. Получить изображение с высоким разрешением с 1 024 x 1 024 пикселей и 2 x линии усреднения, используя кнопку «Захват».
    7. Сохраните место в обзоре XYZ, используя кнопку «+». Это гарантирует, что же области ткани не пойман.
    8. За каждый кусок ткани 10 снимков non перекроя поля зрения.

7. DSC протокол

Примечание: Перейти к этому шагу, как только Подготовка тканей является полным, для регионального анализа ДСК, или после ткани изображений при выполнении SHGM.

  1. Подготовьте DSC кастрюли, взвешивают и помечены.
    Примечание: Этот шаг должно быть сделано до рассечение тканей для того, чтобы свести к минимуму усыхание тканей.
  2. Сухой каждый склеры площадь поглощающей тканью и заложить плашмя на нижней части сковороде DSC, используя зубчатый щипцами.
  3. Весят сковороду с ткани внутри и крышкой обжим и покрыты для получения ткани мокрый вес (масса образцов должно быть в диапазоне от 5 до 11 мг).
    Примечание: Печать каждого кастрюлю с помощью разглаживания перед переходом на следующий образец ткани. Посуду герметично, предотвращая потерю воды до термического анализа.
  4. После того, как образец гофрированные, поместите его на указанном месте на панели DSC. Там должно быть 6 образцов для элемента управления и 16 для лечение глаз.
  5. Создайте метод, с помощью инструмента управления программного обеспечения, указав вес ткани, и запустите термический анализ, используя следующие параметры: температура 40-80 ° c, скорость нагрева: 1 ° C/мин, тепловой поток: 17.37 МВт, поток газа (N2): 19,8 мл/мин, Давление газа: 2.2 бар.
  6. После завершения анализа данных для каждой выборки путем извлечения пик температуры перехода на котором тепловой денатурации происходит с помощью инструмента управления программным обеспечением.

8. анализ

  1. SHG сигнал
    1. Выберите по крайней мере 5-10 наиболее представительных изображений из каждого лечения и его управления, таким образом, что часть изображения занята главным образом коллагеновых волокон.
    2. Загрузить каждое изображение в ImageJ программного обеспечения и измерить интенсивность средняя пикселей, выбрав Анализ > мера для активного изображения.
    3. Значения, извлеченные помечаются как интенсивность средняя пикселей и также может быть доказано путем построения гистограмму интенсивности, выбрав в меню Анализ > гистограммы.
    4. С помощью листа Excel, создать таблицу к документу все измеренные данные соответственно образец идентификатора.
    5. Вычислить среднее и стандартное отклонение интенсивности пикселей для каждого лечения и контроля состояния.
    6. С помощью студента t тест, сравнить различия для всех попарных сравнений концентраций (т.е., 40 мм SMG против 0 и 400 мм SMG против 0). [P≤0.05].
  2. Волнистость
    1. Выберите изображение, которое отображается коллагеновых волокон. По крайней мере 10 изображений на сэмпл должны быть проанализированы (включая образец элемента управления для каждой концентрации - по крайней мере 40 в общей сложности).
    2. Открытые ImageJ > Plugins > NeuronJ. NeuronJ требует предварительной установки.
    3. Загрузите все imagesby, перетащить в открытое окно NeuronJ .
    4. Создание трассировки линии вдоль волокон, по контуру фибриллярных мыши (пера Рисование таблетки могут использоваться), нажмите кнопку M для измерения расстояния длины всего волокна.
    5. Выберите «Параметр» рисовать касательной прямой линии и соединяют начала и конца контура ранее волокна. Теперь нажмите кнопку M для измерения длины end-to-end.
    6. Повторите ту же процедуру на по крайней мере 10 фибриллами на изображение.
    7. Сбор этих двух измерений от каждого из 10 фибриллами и ввод данных в электронную таблицу excel, выражая общее волокна (контур) и конец в конец длиной (прямой соединительной линии) в длину [кривая] и [линейный], соответственно.
    8. Рассчитать индекс волнистости (W), с использованием формулы: W = длина [кривая] / [линейный] длина.
    9. Рассчитать % волнистость, сравнивая данные из образов лечение samples(SMG) с изображениями из контрольных образцов, используя формулу: (W [SMG] - 1) / (Вт [контроль] - 1)
    10. Чтобы определить статистические различия (p значения) коллагеновые волокна морфологии условий различных лечения и управления выполните парного t тест для волнистость индекса (W).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Тепловой денатурации температуры (Tm) как метод анализа для оценки TXL cross-linking эффект: В общей сложности 16 пар кролика глаза были использованы в этих экспериментах TXL процедуры. В первой части этого исследования оценивалась локализации сшивки эффект вызванных о?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Проведенные эксперименты показали, подтверждающей использование микроскопии сигнала ГСП в качестве метода для оценки коллагена cross-linking эффекты в склеры, повышение будущие возможности использования этого метода как инструмент контроля для сшивки лечения Это целевых белков коллагена...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Авторы благодарят Tongalp Tezel, MD, для проведения консультаций относительно sT инъекций; Тереза Swayne, PhD, для проведения консультаций относительно SHG микроскопии; и Джимми Duong от дизайна и биостатистики ресурсов и Фондом Biostatistical ядро Ирвинг института в медицинский центр Колумбийского университета.

Поддержаны в части исследования, чтобы предотвратить слепоту и национальных институтов здравоохранения грантов NCRR UL1RR024156, EY019007 Р30 NEI, NCI Р30 CA013696 и NEI R01EY020495 (DCP). Колумбийский университет владеет связанные интеллектуальной собственности: патента США выданы без: 8,466,203 и не: 9,125,856. Международный патент: PCT/US2015/020276.

Изображения были собраны в Confocal и специализированных микроскопии общий ресурс Герберта Ирвинга всеобъемлющем онкологический центр в Колумбийском университете, поддерживаемых NIH Грант #P30 CA013696 (Национальный институт рака). Конфокальный микроскоп был приобретен с низ Грант #S10 RR025686.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MILLI-Q SYNTHESIS A10 120VEMD Millipore, Massachusetts, USADouble distilled, deionized water. - protocol step 1.1.1
Sodium hydroxymethylglycinate Tyger Chemicals Scientific, Inc. Ewing, NJ, USACrosslinking reagent - protocol step 1.1.2
Injection needle with luer-lock syringeBD Eclipse, NJ, USASyringe for sub tenon injection. - protocol step 2.1
Rabbit headLa Granja poultryOutbredRabbit head separated and delivered within 1 hour postmortem. - protocol step 2.2
Tono-pen Reichter Technologies Depew, NYIOP measurements - protocol step 2.4
DSC 6000 AutosamplerPerkin-Elmer Waltham, MA, USAThermal denaturation analyzer - protocol step 7.4
Pyris software Perkin-Elmer, Waltham, MA, USAVer 11.0 protocol step 7.5
CFI75 Apochromat LWD 25X/1.10 W MPNikon Instruments, Melville, NY, USAA water immersionn objective with high IR transmittance with a working distance of 2.0 mm - protocol step 8.1.1.
GenTeal Alcon, Fort Worth, TX B000URVDQ8Water-based gel used as objective immersion medium instead of water to prevent evaporation - 8.1.1
Chameleon Vision II Coherent, Santa Clara,CA, USATi:Sapphire pulsed laser with a 140 fs pulse width at 80 MHz and a tunable range from 680 nm to 1080 nm. - protocol step 8.1.11
AttoFluor cell chamberThermo Fisher Scientific IncA7816Fixation of the cover slip - protocol step 8.1.3
25-mm round coverslips, #1.5Neuvitro Corporation, Vancouver, WA, USAGG-25-1.5protocol step 8.1.3
Eclipse Ti-ENikon Instruments, Melville, NY, USAprotocol step 8.1.4.
Non-descanned (NDD) GaAsP detectorNikon Instruments, Melville, NY, USAEquipped with a 400-450 nm band pass filter - protocol step 8.1.7
A1R-MP laser scanning systemNikon Instruments, Melville, NY, USACompatible with infrared (IR) multi-photon excitation. - protocol step 8.1.8
NIS Elements softwareNikon Instruments, Melville, NY, USAVer 4.3refered to as "software" in the text - protocol step 8.1.9
Fiji/ImageJNational Institute of Health protocol step 9.1.2
NeuronJEric Meijering, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, The Netherlandshttps://imagescience.org/meijering/software/neuronj/, for protocol step 9.2.2
Microsoft Excel Microsoft Corporation, Redmond, WA, USAVer 14protocol step 9.2.8

Ссылки

  1. McBrien, N. A., Norton, T. T. Prevention of collagen crosslinking increases form-deprivation myopia in tree shrew. Exp Eye Res. 59 (4), 475-486 (1994).
  2. Elsheikh, A., Phillips, J. R. Is scleral cross-linking a feasible treatment for myopia control? Ophthalmic Physiol Opt. 33 (3), 385-389 (2013).
  3. Dotan, A., et al. Scleral cross-linking using riboflavin and ultraviolet-a radiation for prevention of progressive myopia in a rabbit model. Exp Eye Res. 127, 190-195 (2014).
  4. Canavan, K. S., Dark, A., Garrioch, M. A. Sub-Tenon's administration of local anaesthetic: a review of the technique. Br J Anaesth. 90 (6), 787-793 (2003).
  5. Guise, P. Sub-Tenon's anesthesia: an update. Local Reg Anesth. 5, 35-46 (2012).
  6. Ahn, J. S., et al. A sub-Tenon's capsule injection of lidocaine induces extraocular muscle akinesia and mydriasis in dogs. Vet J. 196 (1), 103-108 (2013).
  7. Wollensak, G., Redl, B. Gel electrophoretic analysis of corneal collagen after photodynamic cross-linking treatment. Cornea. 27 (3), 353-356 (2008).
  8. Liu, T. X., Wang, Z. Collagen crosslinking of porcine sclera using genipin. Acta Ophthalmol. 91 (4), e253-e257 (2013).
  9. Wang, M., Corpuz, C. C. Effects of scleral cross-linking using genipin on the process of form-deprivation myopia in the guinea pig: a randomized controlled experimental study. BMC Ophthalmol. 15, 89(2015).
  10. Babar, N., et al. Cosmetic preservatives as therapeutic corneal and scleral tissue cross-linking agents. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (2), 1274-1282 (2015).
  11. Kim, S. Y., et al. Evaluating the Toxicity/Fixation Balance for Corneal Cross-Linking With Sodium Hydroxymethylglycinate (SMG) and Riboflavin-UVA (CXL) in an Ex Vivo Rabbit Model Using Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscopy. Cornea. 35 (4), 550-556 (2016).
  12. da Cruz, L. G., Moraes, G. D. A., Nogueira, R. F., Morandim-Giannetti, A. D. A., Bersanetti, P. A. DSC characterization of rabbit corneas treated with Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville extracts. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. , (2017).
  13. Bersanetti, P. A., et al. Characterization of Rabbit Corneas Subjected to Stromal Stiffening by the Acai Extract (Euterpe oleracea). Curr Eye Res. 42 (4), 528-533 (2017).
  14. Freund, I., Deutsch, M. Second-harmonic microscopy of biological tissue. Opt Lett. 11 (2), 94(1986).
  15. Campagnola, P. J., Loew, L. M. Second-harmonic imaging microscopy for visualizing biomolecular arrays in cells, tissues and organisms. Nat Biotechnol. 21 (11), 1356-1360 (2003).
  16. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophys J. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  17. Mansfield, J., et al. The elastin network: its relationship with collagen and cells in articular cartilage as visualized by multiphoton microscopy. J Anat. 215 (6), 682-691 (2009).
  18. Tsamis, A., Krawiec, J. T., Vorp, D. A. Elastin and collagen fibre microstructure of the human aorta in ageing and disease: a review. J R Soc Interface. 10 (83), 20121004(2013).
  19. Raub, C. B., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
  22. Zyablitskaya, M., et al. Evaluation of Therapeutic Tissue Crosslinking (TXL) for Myopia Using Second Harmonic Generation Signal Microscopy in Rabbit Sclera. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (1), 21-29 (2017).
  23. Steven, P., Muller, M., Koop, N., Rose, C., Huttmann, G. Comparison of Cornea Module and DermaInspect for noninvasive imaging of ocular surface pathologies. J Biomed Opt. 14 (6), 064040(2009).
  24. Han, M., Giese, G., Bille, J. F. Second harmonic generation imaging of collagen fibrils in cornea and sclera. Optics Express. 13 (15), 5791-5797 (2005).
  25. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  26. Teng, S. W., et al. Multiphoton autofluorescence and second-harmonic generation imaging of the ex vivo porcine eye. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (3), 1216-1224 (2006).
  27. Rao, R. A., Mehta, M. R., Leithem, S., Toussaint, K. C. Jr Quantitative analysis of forward and backward second-harmonic images of collagen fibers using Fourier transform second-harmonic-generation microscopy. Opt Lett. 34 (24), 3779-3781 (2009).
  28. Morishige, N., Petroll, W. M., Nishida, T., Kenney, M. C., Jester, J. V. Noninvasive corneal stromal collagen imaging using two-photon-generated second-harmonic signals. J Cataract Refract Surg. 32 (11), 1784-1791 (2006).
  29. Aptel, F., et al. Multimodal nonlinear imaging of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (5), 2459-2465 (2010).
  30. Winkler, M., et al. Nonlinear optical macroscopic assessment of 3-D corneal collagen organization and axial biomechanics. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (12), 8818-8827 (2011).
  31. Morishige, N., Takagi, Y., Chikama, T., Takahara, A., Nishida, T. Three-dimensional analysis of collagen lamellae in the anterior stroma of the human cornea visualized by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (2), 911-915 (2011).
  32. Gore, D. M., et al. Two-photon fluorescence microscopy of corneal riboflavin absorption. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (4), 2476-2481 (2014).
  33. Park, C. Y., Lee, J. K., Chuck, R. S. Second Harmonic Generation Imaging Analysis of Collagen Arrangement in Human Cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (9), 5622-5629 (2015).
  34. Quantock, A. J., et al. From nano to macro: studying the hierarchical structure of the corneal extracellular matrix. Exp Eye Res. 133, 81-99 (2015).
  35. Morishige, N., et al. Quantitative analysis of collagen lamellae in the normal and keratoconic human cornea by second harmonic generation imaging microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (12), 8377-8385 (2014).
  36. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  37. Steven, P., Hovakimyan, M., Guthoff, R. F., Huttmann, G., Stachs, O. Imaging corneal crosslinking by autofluorescence 2-photon microscopy, second harmonic generation, and fluorescence lifetime measurements. J Cataract Refract Surg. 36 (12), 2150-2159 (2010).
  38. Bueno, J. M., et al. Multiphoton microscopy of ex vivo corneas after collagen cross-linking. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (8), 5325-5331 (2011).
  39. McQuaid, R., Li, J. J., Cummings, A., Mrochen, M., Vohnsen, B. Second-Harmonic Reflection Imaging of Normal and Accelerated Corneal Crosslinking Using Porcine Corneas and the Role of Intraocular Pressure. Cornea. 33 (2), 125-130 (2014).
  40. Laggner, M., et al. Correlation Between Multimodal Microscopy, Tissue Morphology, and Enzymatic Resistance in Riboflavin-UVA Cross-Linked Human Corneas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (6), 3584-3592 (2015).
  41. Chai, D., et al. Quantitative assessment of UVA-riboflavin corneal cross-linking using nonlinear optical microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4231-4238 (2011).
  42. Scarcelli, G., et al. Brillouin microscopy of collagen crosslinking: noncontact depth-dependent analysis of corneal elastic modulus. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (2), 1418-1425 (2013).
  43. Shao, P., Besner, S., Zhang, J., Scarcelli, G., Yun, S. H. Etalon filters for Brillouin microscopy of highly scattering tissues. Opt Express. 24 (19), 22232-22238 (2016).
  44. Kumar, C. M., McNeela, B. J. Ultrasonic localization of anaesthetic fluid using sub-Tenon's cannulae of three different lengths. Eye (Lond). 17 (9), 1003-1007 (2003).
  45. Winder, S., Walker, S. B., Atta, H. R. Ultrasonic localization of anesthetic fluid in sub-Tenon's, peribulbar, and retrobulbar techniques. J Cataract Refract Surg. 25 (1), 56-59 (1999).
  46. Ripart, J., Eledjam, J. J. [Locoregional anesthesia for ophthalmic surgery: unique episcleral injection (sub-tenon) in the internal canthus]. Ann Fr Anesth Reanim. 17 (4), Fi72-Fi74 (1998).
  47. Meek, K. M., Hayes, S. Corneal cross-linking--a review. Ophthalmic Physiol Opt. 33 (2), 78-93 (2013).
  48. Wollensak, G., Spoerl, E. Collagen crosslinking of human and porcine sclera. J Cataract Refract Surg. 30 (3), 689-695 (2004).
  49. Paik, D. C., Wen, Q., Airiani, S., Braunstein, R. E., Trokel, S. L. Aliphatic beta-nitro alcohols for non-enzymatic collagen cross-linking of scleral tissue. Exp Eye Res. 87 (3), 279-285 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

131hydroxymethylglycinate

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены