סרום ו פלזמה עותק מספר זיהוי באמצעות PCR בזמן אמת

Summary

כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.

Abstract

סרום ותא פלזמה DNA חופשי (cfDNA) הוכח כמקור אינפורמטיבי, לא פולשנית של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של עמידות לטיפול. החל מההיפותזה אנדרוגן קולטן (AR) ג'ין עותק מספר (CN) לזכות הינו אירוע תכופים סירוס גרורתי עמידות סרטן הערמונית (mCRPC), אנו מציעים לנתח אירוע זה ב- cfDNA כמו סמן ניבוי פוטנציאליים.

אנחנו הערכה CN AR ב- cfDNA באמצעות 2 מבחני ה-PCR שונים בזמן אמת ו- 2 גנים התייחסות (RNaseP לפני1). כמות ה-DNA של 60 ng שימש עבור כל שילוב וזמינותו. AR CN רווח אושר באמצעות PCR דיגיטלית כמו שיטה מדויקת יותר. CN וריאציה ניתוח כבר הוכח כדי להיות אינפורמטיבי לחיזוי ההתנגדות טיפול בסביבה של mCRPC, אבל זה יכול להיות שימושי גם למטרות אחרות בהגדרות שונות של המטופל. CN ניתוח על cfDNA יש כמה יתרונות: זה לא פולשנית, מהירה וקלה לביצוע, זה מתחיל מאמצעי אחסון קטן של חומר סרום או פלסמה.

Introduction

במחזור התא DNA חופשי (cfDNA) בדם הוכח להיות מקור אופטימלי של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של טיפול ההתנגדות^1,2. מחקרים רבים הוכיחו קונקורדנציה טוב בין DNA השינויים (מוטציות, העתק מספר וריאציות, שינויים epigenetic ברקמות) ואלה נמצאו המתאימים פלזמה דגימות¹, המאשר כי במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא אינפורמטיבי עבור שינויים רקמת הגידול העיקרי ולא גרורתי³. האפשרות של הלומדים ctDNA ובכך מאפשר את שיקומה של rearrangements גנומית, העתק מספר וריאציות (CNVs) oncogenes ספציפית⁴, זיהוי פוטנציאל גרורתי תאים המשובטים ו- subclonal. CtDNA הוכח כיעיל קלינית. במיוחד עבור סרטן טיפול ניטור כמו זה בנמלים מוטציות ספציפיות, CNVs, הקשורים ספציפית טיפולים ממוקדים^5,6. גם הוא מתגבר על הצורך ביופסיות רקמות ומאפשר את תוצאות ניתן להשיג במועדים שונים במהלך טיפול בסרטן ספציפי בצורה לא פולשנית.

לגבי סרטן הערמונית, מובהק בין מחזורי ללא תא אנדרוגן קולטן (AR) CNVs וטיפול בתגובה abiraterone, enzalutamide הוכח, כמסמן AR ג'ין עותק מספר (CN) ב- cfDNA יכול להיות סמן המבטיחים יכולת חיזוי טיפול ההתנגדות^7,8,9,10,11. CNVs של גנים ספציפיים ב- ctDNA ניתן להעריך באמצעות גישות שונות עם רגישות שונה, עלות במהירות (למשל-PCR בזמן אמת, דיגיטלי, קביעת רצף הדור הבא).

כאן נתאר בגישה פשוטה ומהירה, על סמך מבחני דופלקס בטכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת, להערכת CN AR ב- cfDNA מסרום ופלסמה דגימות^7,8. שקלנו שני מבחני ה-PCR שונה תוכנן על שני אזורים גנומית שונים בתוך אינטרון 5 של AR (Xq12), שני גנים אחרים, כמו גנים התייחסות תקן פנימי ידוע יש מצב מספר עותק נורמלי סרטן הערמונית (RNaseP, ממוקם על 14q11; לפני1, מלון ב 1 p 34). בחרנו גנים התייחסות שני, במקום אחד, כדי להגביר את הדיוק ואת הרגישות של התוצאות. כמות ה-DNA של 60 ng היה מוגבר עבור כל שילוב assay (assay משולב עבור AR-assay_1 + RNaseP , AR-assay_2 + AGO1). שלושה סרום או פלזמה דגימות דנ א גברים בריאים היו איחדו ומשמש כיל. שקלנו המכנסונים של > 1.5 לרווח AR , < 0.5 למחיקה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי הוא גמיש וכי כי גנים אחרים גם ניתן להעריך, שינוי הגנים להפניה פנימית רגילה, על בסיס סוג הגידול ומאפיינים.

Protocol

הפרוטוקול מורכב הבידוד של דנ א מן הדוגמאות סרום או פלזמה לבצע PCR בזמן אמת לצורך ניתוח מספר עותק. הפקת דנ א, בקרת כמות ה-DNA (ספקטרופוטומטרים) ו- PCR בזמן אמת עבור מטרות ספציפיות בוצעו. איור 1, תקציר של נהלים, קו זמן מדווחים.

הפרוטוקול מנחים את ועדת אתיקה במחקר IRST אנושי.

1. סרום איסוף ועיבוד

1. לאסוף כ מ ל דם בצינור סרום ללא קרישה כדי לקבל סרום. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.
2. צנטריפוגה צינורות ב 1,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
3. להעביר בזהירות סרום לתוך צינורות 2 מ"ל.
4. למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

2. פלזמה איסוף ועיבוד

1. לאסוף כ 10 מ ל דם בצינור פלזמה עם EDTA להשיג פלזמה. ממלאים את הצינור לחלוטין, ואז היפוך זה 8 פעמים. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.
2. Centrifuge את הצינור ב g x 1,800 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם אין ההגדרה בלם לצנטריפוגה.
3. להעביר בזהירות את החלק העליון של הפלזמה לתוך צינורות 2 מ"ל. חזור על ההעברה, משאיר לפחות 1 מ"ל של תגובת שיקוע מעל שכבת תאים לבנים.
   הערה: העברת החלק העליון של תגובת שיקוע מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או שאריות תאים.
4. למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.

3. דנ א בידוד סרום או פלזמה

הערה: בידוד של דנ א סרום או פלזמה צריכה להתבצע באמצעות פרוטוקול מסחרי שונה בשלבים הבאים.

1. הפשרת aliquot אחד (המכיל מ- 0.5 עד 2 מ"ל) של סרום או פלזמה בטמפרטורת החדר.
2. מערבולת, לערבב המדגם ולהעביר 0.5 מ"ל של סרום או פלזמה לתוך צינור נקי mL 1.5. להקפיא את שאר חומר ב-80 מעלות צלזיוס.
3. להוסיף 50 µL של proteinase k (20 מ"ג/מ"ל) ישירות הדגימה.
4. להוסיף 0.5 מ של פירוק מאגר המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting.
5. סגור את הצינורות, דגירה דגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות גוש חום.
6. להוסיף הסכום המצוין של 100% אתנול מאגר שטיפת 1 ו- 2, כפי שמציין הוראות היצרן.
7. להחזיר את הדגימות בטמפרטורת החדר, להוסיף 0.5 מ"ל אתנול מוחלטת ולערבב היטב על ידי pipetting.
8. הוסף µL 650 של תערובת שהושג בשלב 3.7 ההפרדה עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.
9. למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ומניחים את העמודה על צינור נקי אוסף חדש. חזור על שלבים 3.8 ו- 3.9 עוד פעם אחת.
10. להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 1, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.
11. למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.
12. להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 2, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות.
13. למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.
14. צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות להסיר את כל מאגר כביסה שיורית.
15. מקם את העמודה לתוך צינור נקי mL 1.5. להוסיף 150 µL • תנאי מאגר והמתן 7 דקות כדי להבטיח שאת המאגר מרטיב את העמודה.
16. צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 1 דקות.
17. Pipette את elute מהשלב 3.16 שוב לתוך באותה עמודה צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) עבור 1 דקות להבטיח מקסימלית התאוששות של ה-DNA.

4. DNA כמת, דילול

1. לבצע כימות של הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. השתמש µL 2 מדגם ספקטרופוטומטרים ספסל-העליון לפי הוראות היצרן.
   הערה: אם הכמות הדנ א אינה מספיקה להמשיך עם ה-PCR בזמן אמת (לפחות 120 ng), לבצע תהליך חדש של בידוד ה-DNA.
2. לדלל DNA סרום או פלזמה כדי 2.5 ng/µL באמצעי הסופי אחסון מספיק עבור PCR הכל בזמן אמת (כ 50 µL).

5. PCR בזמן אמת

1. הפשרה עותק מספר מבחני התייחסות ג'ין assay, דגימות די אן איי מדולל, כיילים איחדו בקרח. Equilibrate בטמפרטורת החדר המיקס ראשי המאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס.
2. להכין תערובת של 1 µL של היעד assay, µL 1 של הפניה ג'ין assay 10 µL של מיקס מאסטר 3 ושכפול של כל כיילים איחדו ולדגום. מכינים את תערובת כולל פקד שלילי (מים) ודוגמאות נוספות 2.
3. ב- 96 טוב בצלחת, aliquot 12 µL של המיקס כל טוב. האם לא צינורות פיפטה או ספין.
4. הוסף 8 µL (ריכוז של 2.5 ng/µL) של כל. דנ א ו כיילים איחדו לבאר כל. האם לא צינורות פיפטה או ספין. לשנות את המידע עבור כל טוב.
   הערה: דגימות די אן איי 30 ניתן לעבד עבור כל הניסוי בזמן אמת באמצעות הלוח 96-ובכן: 30 x 3 דוגמאות + שליטה במאגר + שלילי כיילים 1 x 3 = 94.
5. בקצרה ספין למטה הצלחת ב 1,000 x g.
6. הפעל את הצלחת באמצעות פרוטוקול הבאים: להחזיק הבמה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s, ו- 60 ° C עבור 1 דקות.

6. נתונים ניתוח ופרשנות

1. בסעיף "אפשרות", להלן התוצאות מגרש הגברה, לקבוע סף Ct 0.2 עבור הגן היעד הראשון מנותח. חזור על הסט עבור כל הגנים היעד או הפניה. כדי לייצא את הקובץ ה-PCR בזמן אמת בסיומת. txt, לחץ "לייצא" לתוך הכלים. דגל רק "תוצאות" בחר נתונים לייצא ← בחר כסוג קובץ סיומת. txt ← לחץ "התחל ייצוא" ← קרוב בכלי ייצוא.
2. פתח את תוכנת ניתוח, לייבא את קובץ. txt (סרגל כלים ← ייבוא).
3. בחר את שם הקובץ כדי לנתח ולבחור את הגדרת ניתוח באמצעות סרגל הכלים (סמל משחק).
4. לציין את הדגימה כיל ידוע מספר העותקים של המטרה (למשל, 1 עותק עבור AR ג'ין). לחץ על "החל".
5. עבור כל דגימה, להשמיט באר אחת עם דלתא שונים Ct (ΔCt) בהשוואה םש.
6. לנתח מחדש את הניסוי (הקש הפעל סמל).
7. הערכת התוצאות לפי מספר עותק בר מגרש או הטבלה.
   הערה: טבלת התוצאות מכילה פרמטרים רבים כמו ביטחון, Z-ציון משכפל מנותח זה יכול להיות שימושי עבור תוצאות פרשנות.

תוצאות

CfDNA הכולל ריכוז היה לכימות באמצעות ספקטרופוטומטר עבור כל הדגימות ניתח, מציג החציוני של 6.12 ng/µL (טווח: 2.00-23.71 ng/µL) ועבור הדוגמאות סרום החציוני של 3.21 ng/µL (טווח: 2.31-8.49 ng/µL) עבור דגימות פלסמה. ניתחנו את סך של דגימות 115 על ידי ניסויים PCR בזמן אמת.

מבח?...

Discussion

AR ניתוח CN סרום ופלסמה מדגם מייצג גישה חדשה, לא פולשנית עבור השיכוב סירוס עמיד חולי סרטן הערמונית (CRPC). זה לאחרונה הוכח כי AR CN הוא מסוגל לחזות תוצאות CRPC חולים שטופלו abiraterone, enzalutamide, לפני ואחרי כימותרפיה^7,8,9,10.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Serum Tubes	Becton Dickinson	367814	whole blood tube for serum
BD Vacutainer EDTA Tubes	Becton Dickinson	366643	whole blood tube for plasma
Ethanol absolute	VWR		the user could use also other companies
TaqMan Copy Number assay	Thermo Fisher Scientific	4400291	Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283
TaqMan Copy Number assay (modified)	Thermo Fisher Scientific	4467084	Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn
TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P	Thermo Fisher Scientific	4403326
TaqMan Universal PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4326708	Master mix for Real Time PCR
QIAamp DNA Mini Kit (50)	Qiagen	51304	DNA extraction kit
MicroAmp 96-Well Plates	Thermo Fisher Scientific	N8010560	plates for realt time PCR
NanoDrop 1000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	-	the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA
7500 Fast Real-Time PCR System	Applied Biosystem	-	the user could use also other real time instrument
CopyCaller Software	Applied Biosystem	-	Software for copy number analysis