מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ו 53BP1 לניתוח את היווצרות והתיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA

Summary

כתב יד זה מספק פרוטוקול לניתוח של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

Abstract

מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) הם נגעים DNA רציני. ניתוח היווצרות ותיקון של DSB רלוונטי, בקשת רחבה של תחומי מחקר כולל גנום שלמות, genotoxicity, קרינה ביולוגיה, הזדקנות, סרטן של פיתוח תרופות. בתגובה DSB, היסטון H2AX הוא phosphorylated-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase ויוצרים foci גרעיני דיסקרטית לזיהוי על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. בנוסף, 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא עוד חלבון מגיב DSB חשוב בקידום תיקון של DSB ומצטרף nonhomologous סוף-תוך מניעת רקומבינציה הומולוגית. על פי הפונקציות ספציפית של γH2AX, 53BP1, ניתוח משולב של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות גישה סבירה עבור ניתוח מפורט של DSB. כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורטות בתוספת הערות שיטתי על ביצוע הטכניקה. באופן ספציפי, ההשפעה של מחזור התא על דפוסי מוקדים γH2AX הוא הפגינו fibroblasts נורמלי של הקו תא NHDF. יתר על כן, הערך של מוקדים γH2AX כמו סמן מתואר רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא. לבסוף, אי-יציבות גנטית ייחקר בתאים CD34 + של מטופל עם לוקמיה מיאלואידית חריפה על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX ושל 53BP1.

Introduction

הדנ א פגום באופן רציף על ידי אנדוגני (למשל, השכפול מתחים, מינים חמצן תגובתי, חוסר יציבות פנימי של ה-DNA), אקסוגני (למשל, רדיקלים כימי, הקרנה) מקורות (איור 1)^{1,2 3, ,4}. בין נזק לדנ א, מעברי כפול-גדיל ה-DNA (DSB) נגעים רציני במיוחד, עשוי לגרום מוות של תאים או carcinogenesis. כ-50 DSB שעלולים להתעורר לכל מחזור התא ותא.⁵. בתרבית של תאים, רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות nonhomologous סוף-(NHEJ) פיתח כמו מסלולים עיקריים עבור התיקון של DSB (איור 2). HR מתרחשת בשלב מאוחר S/G2 ומשתמש אחות שלם כרומטידה כתבנית לתיקון פוטנציאלי ללא שגיאות. לשם השוואה, NHEJ הוא פעיל במהלך מחזור התא, פוטנציאל מוטגניות כפי בסיסי זוגות ניתן להוסיף או resected לפני מצדו של הקצוות השבורים. בנוסף, סוף-הצטרפות אלטרנטיבית עשויים להיות עסוקים כמנגנון איטי מוטגניות גיבוי תיקון במקרה של NHEJ מחסור^6,7.

DSB לגרום זירחון של היסטון H2AX-סרין 139 באזור של כמה זוגות megabase סביב כל DSB. מוקדים הגרעין ויוצרים נקראים γH2AX מוקדים, ניתן לזהות על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence⁸. ΓH2AX מקדמת את גיוס נוסף DSB מגיב חלבונים, ומעורב כרומטין שיפוץ, תיקון ה-DNA, ואת האות התמרה חושית⁹. כמו כל פוקוס γH2AX נחשב לייצוג של DSB יחיד, כימות של DSB על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence הוא אפשרי, אשר הוכח שורות תאים סרטן, דגימות מטופלים^{10,11, 12 , 13 , 14}. 53BP1 (איגוד p53 חלבון 1) הוא חלבון מפתח אחר במתווכים DSB תיקון. . מעורב בלשכת הגיוס של DSB מגיב חלבונים, מחסום איתות את synapsis של DSB קצוות¹⁵. בנוסף, 53BP1 ממלאת תפקיד קריטי בבחירת מסלול תיקון DSB. זה מפעיל התיקון של DSB לכיוון NHEJ אמנם HR מנעו¹⁶. בהתחשב בפונקציות מקורית של γH2AX ו- 53BP1 תיקון DSB, ניתוח בו זמנית של γH2AX ו- 53BP1 על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence עשוי להיות שיטה שימושית עבור ניתוח מדויק של היווצרות והתיקון של DSB.

כתב יד זה מספק פרוטוקול צעד אחר צעד לביצוע immunofluorescence מיקרוסקופיה של γH2AX ושל 53BP1 בתוך גרעין התא. באופן ספציפי, השיטה מיושמת fibroblasts נורמלי של קו תא NHDF, רנטגן מוקרן לימפוציטים של אדם בריא, תאי CD34 + של חולה עם לוקמיה מיאלואידית חריפה. הפרטים של השיטה הם הצביע בהקשר של התוצאות שהוצגו.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ה השני ועדת האתיקה של מנהיים בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת היידלברג. נכתב מדעת הושג מאנשים כל.

1. הכנה של חומרים

1. פתרון מניות קרישה: להכין פתרון מניות קרישה של הפארין I.U. 200 לכל מ ב- 0.9% נתרן כלורי. למלא כל אחד הצינורות אוסף (לצייר כרך 9 מ ל) 2 מ של הפתרון מניות קרישה לפני נסיגה של דגימות דם או מח עצם.
2. פתרון פירוק כדוריות אדומות: הכן 10 x פתרון פירוק כדוריות אדומות עם 82.91 g אמוניום כלוריד, 7.91 ג'י אמוניום ביקרבונט, 2 מ ל תמיסה חומצית ethylenediaminetetraacetic 0.5 M ל pH של 8.0 על ידי המסת הסוכנים ב מזוקק פעמיים מים עבור הנפח הכולל של 1 ל'
3. קיבוע פתרון: 8.3 להוסיף µL של 1 מ' אשלגן הידרוקסידי פתרון 360 מ"ג paraformaldehyde (PFA) צינור microtiter. ממלאים את הצינור buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) לסימון 1 מ"ל של הרכבת התחתית, חום הצינורית בתוך גוש חימום ב 95 ° C כדי לקבל 1 מ"ל של פתרון PFA 36%. להעביר את הפתרון מחברים של 36% 1 מ"ל צינור עם קיבולת של 15 מ"ל. הוסף 8 מ"ל PBS הפתרון PFA 36% 1 מ"ל, להשיג 9 מ של פתרון מניות של כדורגלן 4%. 4% PFA פתרון מלאי החנות ב-18 ° C עד ולהשתמש עבור קיבעון של תאי aliquot.
   התראה: 1) אשלגן הידרוקסידי פתרון הוא מאכל. להיות מודע העין והגנה על העור. 2) כדורגלן הוא מסרטנים. להימנע במגע עם העור אינהלציה. להכין את הפתרון קיבוע ברדס.
4. Permeabilization פתרון: להוסיף 50 µL Octoxinol 9-50 מ"ל PBS כדי לקבל פתרון כ- 0.1% Octoxinol 9-
5. חוסם פתרון: להכין 5% 2% חסימת פתרונות על ידי ערבוב הסוכן חסימת חלבון עם PBS, חנות-6 – 8 ° C.

2. הכנת הדגימות

1. Fibroblasts בתרבות תא: מטפחים fibroblasts האנושי של הקו תא NHDF ב 5% humidified האווירה ₂ CO ב 37 מעלות צלזיוס בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% עגל עוברית סרום, 4 מ מ גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
   1. הכנת שקופית מיקרוסקופ עם חסיד fibroblasts
      1. הסר המדיום הבקבוק (אזור הצמיחה של ² 75 ס מ) עם שמתקדמות NHDF fibroblasts. להוסיף 10 מ"ל PBS הבקבוקון. לשטוף את fibroblasts חסיד בעדינות ע י ניעור באופן ידני את הבקבוקון עבור מינימלית 1
      2. להסיר את PBS ולהוסיף טריפסין 1 מ"ל לתוך הבקבוק. לנער את הבקבוק בעדינות כדי לוודא כי כל תאים חסיד מכוסים על ידי טריפסין. הסר את טריפסין הבקבוקון. לשים את הבקבוק לתוך החממה במשך 5 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      3. לקחת את הבקבוק מתוך החממה ולהוסיף 10 מ"ל RPMI 1640 בינוני לתוך הבקבוק. Pipette של המדיום לאורך מספר פעמים כדי לפזר את fibroblasts.
      4. פיפטה 0.3 מיליליטר fibroblasts מפוזרת על גבי כל אחד מהשדות שני של השקופית מיקרוסקופ ולשים את השקופית לתוך החממה במשך 24 שעות ביממה כך fibroblasts לדבוק השקופית. עבור immunostaining של γH2AX ו 53BP1 ב הגרעינים של fibroblasts, נעבור לשלב 3.1.
2. דגימות החולה
   1. ודגימות הדם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה ולהוסיף 7 מ ל דם לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3).
   2. דגימות מח עצם: להשתמש הצינורות אוסף מילוי עם 2 מ"ל של הפתרון מניות קרישה (שלב 1.1) ולהוסיף מח עצם 7 mL לתוך הצינורות. אחסן את הדגימות ללילה בטמפרטורת החדר (קרי, 18-20 ° C). למחרת, לבודד את שלב G0/G1 קייזרכרכט תאי תאי צפיפות הדרגתיות צנטריפוגה (שלב 2.2.3). השתמש CD34 גרגרי וסלולרי ההפרדה עמודות עבור הבידוד של תאי CD34 +.
   3. בידוד תאי תאי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
      הערה: תאי תאים מבודדים דגימות מח עצם ודם על ידי צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות ^{17 , 18 , 19}.
      1. Dilute את דגימת הדם heparinized על יחס של 1:1 עם PBS ולדגום את מח העצם heparinized על יחס של 1:3 עם PBS. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים.
      2. להוסיף נפח של צפיפות בינונית הדרגתיות צינור טריים. בעדינות שכבת דם מדולל או מח עצם על המדיום הדרגתיות צפיפות. הקפידו לא לערבב שתי שכבות.
      3. Centrifuge הצינור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, 400 x ג להרחיק את השכבה העליונה פלזמה עם פיפטה. ואז בזהירות לקצור תאי תאי השכבה שמעל המדיום הדרגתיות צפיפות. העברת תאי תאי לתוך צינור טריים.
      4. להוסיף לפחות שלושה כרכים של PBS תאי תאי בצינור. להשעות את התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים. Centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400
      5. לאחר הספין להסיר את תגובת שיקוע והוסף 10 מ"ל של 4 ° C, 1 x פתרון פירוק כדוריות אדומות. Resuspend התאים בעדינות על ידי ציור אותם פנימה והחוצה פיפטה פעמיים, ולמקם את הצינורית על קרח למשך 5 דקות. ואז להוסיף 30 מ ל PBS ב 4 ° C, centrifuge את הצינור 10 דקות-בטמפרטורת החדר ו- g x 400
   4. הכנת cytospins
      1. להכין שני cytospins עם תאי תאי של הדגימות החולה (קרי, cytospin אחד עבור צביעת immunofluorescence γH2AX, cytospin אחד עבור γH2AX ו- 53BP1 משולב immunofluorescence מכתים) על ידי צנטריפוגה (x 300 גרם, 10 דקות) של 1.0 x 10 ⁵ תאים עבור כל הכנה ( איור 3 ו-4)-

3. γH2AX, צביעת Immunofluorescence 53BP1

1. קיבעון, permeabilization: לתקן את התאים עם 200 µL של 4% PFA למשך 10 דקות. לאחר קיבוע, לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. ואז permeabilize את התאים עם 200 µL של 0.1% Octoxinol 9 עבור 10 דקות לשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של 5% פתרון חסימה למשך 5 דקות כל על המעבדה מטרף. לחסום את התאים 30 מ של טרי 5% חסימת פתרון עבור ה 1
2. הדגירה עם נוגדנים
   1. דגירה בתכשיר אחד של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) והכנות אחרות של התאים עם נוגדן monoclonal anti-γH2AX העכבר (שבערך) ו- a נוגדן anti-53BP1 ארנב polyclonal (שבערך) בן לילה ב-4 מעלות צלזיוס
   2. לאחר דגירה לשטוף את התאים בעדינות 3 פעמים עם 30 מ של 2% חסימה פתרון עבור כל 5 דקות על מטרף המעבדה.
   3. להסיר הפתרון חסימה, דגירה ההכנה הראשונים של התאים עם עז Alexa488 מצומדת אנטי-העכבר המשני נוגדן (שבערך) והכנת השני את התאים עם (נוגדן אנטי עכבר משני עז מצומדת-Alexa488 שבערך) ואת החמור Alexa555 מצומדת ארנב אנטי משני נוגדן (שבערך) לשעה בטמפרטורת החדר.
3. הרכבה בינונית: לשים את השקופית הכוללת התאים בקערה ולשטוף את התאים בעדינות שלוש פעמים עם 30 מ של PBS עבור כל 5 דקות על המעבדה מטרף. הסר את PBS והר התאים הרכבה בינונית המכיל 4, 6-diamidino-2-phenylindole. בזהירות לשים את coverslip על המדיום הרכבה כך אין בועות אוויר משובץ. לחכות לפחות 3 h עבור התקשות של המדיום הרכבה לפני ניתוח בתאים על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ.

4. ניתוח של γH2AX ושל 53BP1 מוקדים

1. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה: לנתח את מוקדים γH2AX ו 53BP1 ב גרעינים תא עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות מצויד מסננים דאפי, 488 אלקסה של Cy3 במהלך דימות-מטרה X 100 ההגדלה. שיא תמונות עם מצלמה ולעבד את התמונות עם תוכנת הדמיה המתאימה.

תוצאות

ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים הוא המדויק ביותר בין שלב G0/G1 לשלב G2 כאשר מוקדים γH2AX מופיעים כנקודות פלורסנט ברורים (איור 5A). לעומת זאת, ניתוח של מוקדים γH2AX בתאים במהלך שלב S הינו מסובך γH2AX פאן-גרעיני התפזרו ספאקלס הנגרמת על ידי תהליך השכפול (איור 5B)...

Discussion

מיקרוסקופ immunofluorescence של γH2AX, 53BP1 היא שיטה שימושית לניתוח היווצרות ותיקון של DSB, בקשת רחבה של תחומי מחקר. פרמטרים קריטיים המשפיעים על התוצאה של הניסויים הם השלב של מחזור התא, הסוכנים המשמש את הקיבעון ואת permeabilization של התאים, הבחירה של הנוגדנים, ורכיבי חומרה ותוכנה של המיקרוסקופ זריחה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium for cell culture
Heparin sodium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%	B. Braun	PZN 1957154	Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M	Merck Millipore	109107	Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software