ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

요약

이 원고는 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DNA 두 배 물가 틈의 분석을 위한 프로토콜을 제공합니다.

초록

DNA 이중 가닥 나누기 (DSB)는 심각한 DNA 병 변. 형성 및 DSB의 수리 분석은 게놈 무결성, genotoxicity, 방사선 생물학, 노화, 암, 및 신약 개발 등 연구 분야의 넓은 스펙트럼에 관련. 응답에서 DSB, 히스톤 H2AX 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 개별 핵 foci 감지를 형성 하는 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에 phosphorylated은. 또한, 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1)은 또 다른 중요 한 DSB 반응 단백질 nonhomologous 끝 동종 재결합 하면서 가입 하 여 DSB의 복구를 추진. ΓH2AX와 53BP1의 특정 기능에 따라 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 결합 된 분석 DSB의 상세한 분석에 대 한 합리적인 접근 있을 수 있습니다. 이 원고는 단계별 프로토콜을 기술을 수행 하기 위한 조직적 노트와 보충을 제공 한다. 특히, γH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 셀 라인 NHDF의 정상적인 fibroblasts에 시연입니다. 또한, biomarker는으로 γH2AX foci의 값은 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포에 그려져 있습니다. 마지막으로, 유전자 불안정성의 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서 조사.

서문

DNA는 지속적으로 내 생에 의해 손상 (예를 들어, 복제 스트레스, 반응성 산소 종, DNA의 본질적인 불안정성) 및 외 인 (예, 화학 기, 방사선) 소스 (그림 1)^{1,2 ,,34}. DNA 손상, 중 DNA 두 배 물가 틈 (DSB) 특히 심각한 병 변 그리고 세포 죽음 또는 발암을 일으킬 수 있습니다. 약 50 DSB는 세포와 세포 주기⁵당 발생할 수 있습니다. 포유류 세포, 동종 재결합 (HR) 및 nonhomologous 끝-결합 (NHEJ) 개발 DSB (그림 2)의 복구에 대 한 주요 경로. 인사 늦게 S/g 2 단계에서 발생 하 고 그대로 동생을 사용 하 여 잠재적으로 오류 없이 복구에 대 한 템플릿으로 chromatid. 비교에서는, NHEJ 기본적인 쌍을 추가 또는 깨진된 끝의 결 찰 하기 전에 절제 수 있습니다 및 잠재적으로 돌연변이 세포 주기입니다. 또한, 대체 최종 합류 NHEJ 결핍^6,7시 느린 돌연변이 백업 복구 메커니즘으로 약혼 수 있습니다.

DSB 각 DSB 주위 여러 megabase 쌍의 영역에 떠들고 139에서 히스톤 H2AX의 인 산화를 유도. 형성 핵 foci γH2AX foci 이름이 되며 면역 형광 검사 현미경 검사 법⁸감지. ΓH2AX 추가 DSB 반응 단백질의 신규 모집을 촉진 하 고 개장 하는 chromatin, DNA 수리, 및 신호 변환⁹에 관여. 각 γH2AX 초점을 나타내는 단일 DSB 간주 됩니다, 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 DSB의 정량화는 가능,이 암 세포 선 및 환자 표본^10,11, 에서 입증 되었습니다. ^{12 , 13 , 14}. 53BP1 (p53 바인딩 단백질 1) DSB 수리 중재에 또 다른 주요 단백질 이다. 그것은 DSB 반응 단백질, 검사점 신호, 그리고 DSB 끝¹⁵synapsis의 채용에 관여. 또한, 53BP1 DSB 복구 경로 선택에서 중요 한 역할을 하고있다. 그것은 시간 동안 방해¹⁶NHEJ 향해 DSB의 수리를 트리거합니다. ΓH2AX 및 DSB 수리에 53BP1의 진정한 기능을 고려 하면 γH2AX 및 53BP1 면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해의 동시 분석 형성 및 DSB의 복구의 정확한 분석을 위한 유용한 방법 있을 수 있습니다.

이 원고는 세포 핵에 γH2AX와 53BP1의 면역 형광 검사 현미경 검사 법을 수행 하기 위한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 특히, 기술은 셀 라인 NHDF, 건강 한 개인의 방사선 x 선 세포와 CD34 + 세포의 급성 골수성 백혈병을 가진 환자에서의 정상적인 fibroblasts에 적용 됩니다. 방법의 세부 정보는 제시 결과의 맥락에서 지적 했다.

프로토콜

여기에서 설명한 모든 방법을 의료 학부 임 하이델베르크 대학 윤리 위원회 II에 의해 승인 되었습니다. 모든 개인에서 동의 얻어 작성.

1. 재료의 준비

1. 응고 제 재고 솔루션: 0.9% 염화 나트륨에에서 mL 당 200 I.U. 덤플링의 항 응 혈 약 재고 솔루션을 준비. 컬렉션 튜브의 각 채우기 (볼륨 그릴 9 mL) 혈액 또는 골 수 샘플의 철수 하기 전에 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와.
2. 적혈구 세포 솔루션: 레드 셀 염화 암모늄 82.91 g, 7.91 g 염화 중 탄산염, 그리고 pH 8.0에서 에이전트를 용 해 하 여 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 성 해결책의 2 mL에 lysis 솔루션 x 10 준비 1의 전체 볼륨에 대 한 이중 증 류 물 L.
3. 고정 솔루션: 추가 8.3 µ L 360 mg paraformaldehyde (PFA) 결정 튜브에서에 1 M 수산화 칼륨 해결책의. 튜브 및 열 36 %PFA 솔루션의 1 mL를 95 ° C에가 열 블록에 튜브의 1 mL 마크를 버퍼링 하는 인산 염 분 (PBS)로 튜브를 채우십시오. 15 mL의 용량을 가진 튜브를 1 mL 36 %PFA 솔루션을 전송 합니다. 8 mL PBS 1 mL 36 %PFA 솔루션 4 %PFA 재고 솔루션의 9 mL를 추가 합니다. 셀의 고정을 위한 4 %PFA 재고 솔루션 및 저장소까지-18 ° C에서 사용 하는 약 수.
   주의: 1) 수산화 칼륨 해결책은 부식성 이다. 눈과 피부 보호를 알고 있어야 합니다. 2) PFA 발암 성 이다입니다. 피부 접촉 및 흡입 하지 마십시오. 준비는 후드 아래 고정 솔루션.
4. Permeabilization 솔루션: 추가 50 µ L Octoxinol 9 ~ 50 mL PBS 약 0.1%의 솔루션을 Octoxinol 9.
5. 차단 솔루션: 5%와 2 %6에서 PBS와 저장소 단백질 블로킹 제를 혼합 하 여 차단 하는 솔루션 준비 – 8 ° c.

2. 샘플의 준비

1. 섬유 아 세포 세포 배양에서: 셀 라인 NHDF 습도 5%에서의 인간의 섬유 아 세포를 배양 10% 태아 종 아리 혈 청, 4mm 보충 RPMI 1640 매체에서 37 ° C에서 CO ₂ 분위기 글루타민, 그리고 1% 페니실린/스입니다.
   1. 준비는 현미경 슬라이드의 점착 섬유 아 세포
      1. 플라스 크 (75 cm ² 성장 지역) 기 하 급수적으로 성장 하는 NHDF 섬유 아 세포에서에서 매체를 제거 합니다. 플라스 크에 10 mL PBS를 추가 합니다. 수동으로 1 분에 대 한 플라스 크를 흔들어 부착 섬유 아 세포를 부드럽게 씻어
      2. 는 PBS를 제거 하 고 플라스 크에 트립 신 1 mL를 추가 합니다. 부드럽게 모든 부착 셀 트립 신에 의해 보호 됩니다 있도록 플라스 크를 흔들어. 플라스 크에서는 트립 신을 제거 합니다. 37 5 분 동안 인큐베이터에 플라스 크를 넣어 ° c.
      3. 는 인큐베이터에서 플라스 크 고 플라스 크에 10 mL RPMI 1640 매체를 추가. 매체는 섬유 아 세포를 분산 여러 번 위아래 플라스틱.
      4. 각 현미경 슬라이드의 두 필드에 분산 된 섬유 아 세포의 0.3 mL를 플라스틱 하 고 슬라이드 하는 섬유 아 세포 준수 24 h에 대 한 인큐베이터에 슬라이드를 넣어. ΓH2AX 및 섬유 아 세포의 핵에서 53BP1의 immunostaining에 대 한 이동 단계 3.1.
2. 환자 샘플
   1. 혈액 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 혈액을 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 분리 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 단 세포 휴식 G0/G1 단계.
   2. 골 수 샘플: 항 응 혈 약 재고 솔루션 (단계 1.1)의 2 mL와 함께 가득 차 있었다 컬렉션 튜브를 사용 하 고 튜브로 7 mL 골 추가. 하룻밤 실 온 (즉, 18-20 ° C)에서 샘플을 저장 합니다. 다음 날, 단 세포 밀도 그라데이션 원심 (2.2.3 단계)에 의해 휴식 G0/G1 단계 분리. CD34 microbeads를 사용 하 고 셀 CD34 + 세포의 고립에 대 한 분리 열.
   3. 조밀도 기온 변화도 원심 분리 하 여 단 세포의 고립
      참고: 단 세포 밀도 그라데이션 원심 ^{17 , , 18 19}에 의해 혈액과 골 수 샘플에서 격리 됩니다.
   4. Dilute PBS와 1: 1의 비율로 heparinized 혈액 샘플 및 PBS와 1: 3의 비율로 heparinized 골 수 샘플
      . 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 중단.
      1. 신선한 튜브를 밀도 그라데이션 매체의 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 희석된 혈액 또는 골 수 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어. 두 레이어 혼합에 아닙니다 돌.
      2. 원심 관 실 온에서 30 분 동안 하 고 400 x g. 피펫으로와 위 플라즈마 레이어를 그립니다. 다음 신중 하 게 밀도 그라데이션 매체 위에 레이어 단 셀 수확. 단 세포 신선한 튜브로 전송.
      3. 튜브에 단 세포를 PBS의 적어도 3 개의 볼륨을 추가합니다. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 부드럽게 세포를 일시 중단 합니다. 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심
      4. 스핀 후는 상쾌한을 제거 하 고 4 ° C, 적혈구 세포 솔루션 x 1의 10 mL을 추가. 그려서 그들 피펫으로 밖 두 번 셀을 부드럽게 resuspend 고 5 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 다음 4 ° C에서 30 mL PBS를 추가 하 고 실내 온도 400 x g.에서 10 분 동안 튜브 원심
   5. 준비는 cytospins의
      1. (즉, γH2AX 면역 형광 염색 법에 대 한 하나의 cytospin 및 γH2AX 및 53BP1에 대 한 하나의 cytospin 환자 샘플의 단 세포와 두 cytospins 준비 면역 형광 염색 결합) 원심 분리 (300 x g, 10 분) ( 그림 3 및 4) 각 준비에 대 한 10 ⁵ 셀 x 1.0의 의해.

3. γH2AX 및 53BP1 면역 형광 염색

1. 고정 및 permeabilization: 4%의 200 µ L 셀 해결 PFA 10 분. 고정, 후 30 mL PBS의 각 실험실 통에 5 분을 세 번 셀을 부드럽게 씻어. 다음 세포를 permeabilize 0.1%의 200 µ L을 10 분에 대 한 Octoxinol 9 씻어 셀 부드럽게 각 실험실 통에 5 분 30 mL 5% 차단 솔루션의와 세 번. 1 헤에 대 한 솔루션을 차단 하는 신선한 5%의 30 mL에서 세포를 차단
2. 항 체를 가진 외피
   1. 품 어 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 한 준비와 마우스 안티 γH2AX 단일 클로 널 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 다른 준비를 하 고 4에서 하룻밤 polyclonal 토끼 안티-53BP1 항 체 (1: 500) ° c.
   2. 인큐베이션 세척 세포 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 2% 차단 솔루션의 30 mL로 3 시간 후.
   3. 차단 솔루션을 제거 하 고 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 2 차 항 체 (1: 500)에 포함 된 셀의 첫 번째 준비와 Alexa488 활용 된 염소 반대로 마우스 이차 항 체 (셀의 두 번째 준비 품 어 1: 500)와 Alexa555 활용 된 당나귀 안티 토끼 2 차 항 체 (1: 500) 실 온에서 1 h.
3. 장착 매체: 셀으로 슬라이드를 그릇에 넣고 셀 부드럽게 실험실 셰이 커에 각 5 분 30 mL의 PBS로 3 회 세척. PBS를 제거 하 고 장착 매체 4, 6-diamidino-2-phenylindole를 포함 하는 셀을 탑재. 조심 스럽게 넣어 장착 매체 위에 coverslip 없음 기포는 포함 된. 형광 현미경으로 세포를 분석 하기 전에 장착 매체의 강화에 대 한 적어도 3 h 기다립니다.

4. ΓH2AX 및 53BP1의 분석 Foci

1. 형광 현미경 검사 법: 100 X 목표에 이미징 동안 DAPI, 알 렉 사 488, Cy3 필터를 갖춘 형광 현미경으로 세포 핵에서 γH2AX 및 53BP1 foci 분석 확대입니다. 카메라와 함께 이미지를 기록 하 고 적절 한 이미징 소프트웨어로 이미지 처리.

결과

셀에 γH2AX foci의 분석 G0/G1 단계 그리고 G2 단계 γH2AX foci (그림 5A) 고유한 형광 점으로 표시 하는 때에 가장 정확 하다. 반면, S 단계 세포에 γH2AX foci의 분석 복제 프로세스 (그림 5B)에 의해 발생 하는 분산된 팬 핵 γH2AX 얼룩에 의해 복잡 합니다.

셀의 고정 4% 수행한 PFA (10 분) 및 0.1% pe...

토론

면역 형광 검사 현미경 검사 법의 γH2AX와 53BP1 형성 및 연구 분야의 넓은 스펙트럼에서 DSB의 수리 분석을 위한 유용한 방법입니다. 실험의 결과 좌우 하는 중요 한 매개 변수는 세포 주기, 고정 및 permeabilization 세포, 항 체, 그리고 하드웨어의 선택과 형광 현미경의 소프트웨어 사용 하는 에이전트의 단계.

ΓH2AX foci 패턴에 세포 주기의 영향 정상 섬유 아 세포 세포 라인 NHDF의 기...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI medium	Sigma-Aldrich	R0883	Medium for cell culture
Heparin sodium	ratiopharm	PZN 3029843	Heparin 5,000 I.U. / mL
Sodium chloride solution 0.9%	B. Braun	PZN 1957154	Component of the anticoagulant stock solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare	17-5442-02	Medium for isolation of mononuclear cells
Trypsin solution 10X	Sigma-Aldrich	59427C	Enzyme for dissociation of fibroblasts in cell culture
CD34 MicroBead Kit	Miltenyi Biotec	130-046-702	Isolation of CD34+ myeloid progenitor cells
Diagnostic microscope slides	Thermo Scientific	ER-203B-CE24	Microscope slides
Megafuge 1.0 R	Heraeus	75003060	Tabletop centrifuge
Cytospin device
Lid	Heraeus	76003422	Lid for working without micro-tubes
Cyto container	Heraeus	75003416	Cyto container with 2 conical bores
Clip carrier	Heraeus	75003414	Carrier for holding a cyto container and a slide
Support insert	Heraeus	75003417	Support insert for holding a clip carrier
Triton X-100 (Octoxinol 9)	Thermo Scientific	85112	Detergent for permeabilization of cell membranes
Potassium hydroxide solution 1M	Merck Millipore	109107	Necessary for preparing the paraformaldehyde solution
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Fixation agent
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	D8537	Balanced salt solution
Chemiblocker	Merck Millipore	2170	Blocking agent
Mouse monoclonal anti-γH2AX antibody (JBW301)	Merck Millipore	05-636	Primary antibody for detection of γH2AX
Polyclonal rabbit anti-53BP1 antibody (NB100-304)	Novus Biologicals	NB100-304	Primary antibody for detection of 53BP1
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse antibody	Invitrogen	A-11001	Secondary antibody
Alexa Fluor 555-conjugated donkey anti-rabbit antibody	Invitrogen	A-31572	Secondary antibody
Vectashield mounting medium	Vector Laboratories	H-1200	Contains DAPI for staining of DNA
Axio Scope.A1	Zeiss	490035	Fluorescence microscope
Cool Cube 1 CCD camera	Metasystems	H-0310-010-MS	Camera system for digital recording
Isis software	Metasystems	Not applicable	Microscope software