זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו

Summary

מאמר זה מתאר הליך זיהוי ואפיון של משפחה ג'ין הגפן חלה על משפחתו של תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) E3 אוביקוויטין ligases.

Abstract

סיווג ובמינוח של הגנים במשפחה יכול באופן משמעותי לתרום את התיאור של המגוון של מקודדים חלבונים וכדי נבואתו של פונקציות משפחתי המבוסס על מספר תכונות, כגון הנוכחות של רצף מוטיבים או במיוחד אתרים עבור שינוי post-translational והפרופיל הביטוי של בני המשפחה בתנאים שונים. עבודה זו מתאר פרוטוקול מפורט עבור ג'ין אפיון משפחה. כאן, ההליך חלה על אפיון משפחת ליגאז אוביקוויטין של E3 תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) בהגפן. השיטות כוללות זיהוי ברמת הגנום של בני המשפחה, אפיון גנים לוקליזציה, מבנה, שכפול, הניתוח של חלבון שנשמרת מוטיבים, התחזית של לוקליזציה חלבון אתרי זירחון וכן ג'ין ביטוי פרופיל על פני המשפחה נתונים (datasets) שונות. הליך כזה, אשר יכול להרחיב עליו ניתוחים נוספים בהתאם למטרות ניסיוני, יכול לחול על משפחה ג'ין כל מיני צמחים אשר זמינים גנומית נתונים, והוא מספק מידע חשוב לזהות את המועמדים מעניין ללימודים פונקציונלי, נותן תובנות המנגנונים המולקולריים של הצמח ההסתגלות לסביבה שלהם.

Introduction

במהלך העשור האחרון, מחקרים רבים בהגפן גנומיקה התבצע. הגפן הוא יבול כלכלית הרלוונטיים המוכרים, אשר הפך מודל למחקר על פרי פיתוח ועל התגובות של צמחים וודי מדגיש ביוטיים, והאביוטיים. בהקשר זה, שחרורו של הגנום cv. PN40024 vinifera גפן 2007¹ וגירסה מעודכנת שלה 2011² הוביל הצטברות מהירה של "טכנולוגיות" סרגל נתונים וכדי פרץ של מחקרים תפוקה גבוהה. בהתבסס על הנתונים שפורסמו רצף, ניתוח מקיף של משפחה גן מסוים (בדרך כלל מורכב של חלבונים שיתוף מוטיבים שנשמרת, הדמיון המבני ו/או פונקציונלי ויחסים אבולוציונית), ניתן כעת לבצע כדי לחשוף את פונקציות מולקולרית, אבולוציה, וכן ביטוי גנים פרופילים. ניתוחים אלה יכול לתרום להבנה כיצד משפחות גנים לשלוט תהליכים פיזיולוגיים ברמת הגנום כולו.

היבטים רבים של מחזור החיים של צמחים מוסדרים על ידי בתיווך אוביקוויטין השפלה של חלבונים מפתח, אשר דורשים מחזור מכויל כדי להבטיח תהליכים תאיים רגיל. חשוב על מרכיבי התהליך בתיווך אוביקוויטין השפלה הם ligases אוביקוויטין E3, אשר אחראים על גמישות מערכת, בזכות הגיוס של מטרות מוגדרות³. בהתאם לכך, אנזימים אלה מייצגים משפחה גן ענק, עם בסביבות 1,400 E3 ליגאז קידוד הגנים לחזות את הגנום תודרנית לבנה ⁴, כל ליגאז אוביקוויטין E3 הוא ייצג ubiquitination של חלבונים יעד ספציפיות. למרות החשיבות של המצע ספציפי ubiquitination בתקנה התאית בצמחים, מעט מאוד ידוע על איך מוסדר השביל ubiquitination, חלבונים היעד זוהו רק במקרים מעטים. פיענוח של מנגנונים אלה ירידה לפרטים ורגולציה מסתמך קודם על זיהוי ואפיון של הרכיבים השונים של המערכת, במיוחד את ligases E3. בין ligases אוביקוויטין, תת ATL מאופיין על ידי חברי 91 ב לבנה א הצגת טבעת-H2 האצבע תחום^5,6, חלקם תפקיד ההגנה, הורמון תגובות⁷.

הצעד הראשון מכרעת להגדרת חברי משפחה חדשה ג'ין הוא ההגדרה המדויקת של התכונות משפחה, כגון קונצנזוס במוטיבים, תחומים מרכזיים המאפיינים רצף החלבון. אכן, אמין לאחזור של כל גן בני המשפחה מבוסס על ניתוח הפיצוץ דורש מספר מאפיינים רצף חובה, בתחומים חלבון מסוים, אחראי על חלבון פונקציה/פעילות, הגשה חתימת חלבון. זה ניתן בהנחייתם של אפיון הקודם מאותה משפחה ג'ין מיני צמחים אחרים או מושגת על-ידי ניתוח גנים שונים השייכים putatively מאותה משפחה, מינים שונים כדי לבודד רצפים נפוצות. בני המשפחה ואז ניתן בנפרד בשם בעקבות כללים משותפים מיושב על ידי קונסורציומים בינלאומי עבור זן צמחים נתון. בהגפן, למשל, הליך כזה הוא נתון ההמלצות של ועדת המינוח סופר ענבים ג'ין ביאור (sNCGGa), הקמת הבנייה של עץ פילוגנטי כולל נ' vinifera ו- לבנה א גנים בני המשפחה כדי לאפשר ג'ין ביאור בהתבסס על נוקלאוטיד רצפים⁸.

כרומוזום לוקליזציה של בני המשפחה וסקר שכפול גנטי לאפשר סימון הנוכחות של הגנום כולו או טנדם גנים המשוכפלת. מידע כזה מופיע שימושי לפענח פונקציות בשם ג'ין, מאז עלול להראות יתירות תפקודית או לחשוף למצבים שונים, כלומר, ללא-functionalization, ניאו-functionalization או תת functionalization⁹. שני ניאו - ולא משנה - functionalization הם אירועים חשובים יוצר חידוש גנטי, מתן רכיבים סלולר חדשים עבור הצמח ההסתגלות שינוי סביבות¹⁰. בפרט, כפילויות של אב קדמון גנים וייצור של גנים חדשים היו תכופים מאוד במהלך האבולוציה של הגנום הגפן, שהוקם גנים שמקורם הפרוקסימלית ואת טנדם כפילויות בהגפן היו בסבירות גבוהה יותר לייצר חדש פונקציות¹¹.

פרופיל transcriptomic זה גורם מפתח נוסף לפענח את ג'ין תפקוד המשפחה. הזמינות של מסדי נתונים הציבור נותן גישה כמות עצומה של נתונים transcriptomic אפשר לנצל ולכן כדי להקצות פונקציות בשם ג'ין משפחתם באמצעות בקנה מידה גדול סיליקו ביטוי ניתוחים. ואכן, הביטוי המיוחד של כמה גנים באיברים צמח מסוים או בתגובה לחצים מסוימים יכול לתת כמה רמזים לגבי התפקידים בשם של החלבונים המתאים בתנאים מוגדרים, ולתת תמיכה היפותזות על האפשר functionalization המשנה של גנים המשוכפלת להגיב על אתגרים שונים. למטרה זו, חשוב לקחת בחשבון מספר נתונים (datasets): אלה יכול להיות זמין כבר גנים ביטוי מטריצות, כגון הרי האטלס הגנום כולו transcriptomic של הגפן איברים ושלבים התפתחותיים¹², או יכול להיות בנוי אד הוק על ידי מאחזר datasets transcriptomic עבור המין הצמח המסויים נתון מדגיש מוגדרים. יתר על כן, בגישה פשוטה באמצעות שתי מטריצות, אחד עם נתוני הדמיון pairwise והשני עם המקדמים של pairwise ביטוי משותף ניתן להחיל כדי להעריך את קשרי הגומלין בין תבניות דמיון וביטוי רצף בתוך משפחה ג'ין.

מטרת עבודה זו היא לספק גישה גלובלית, הגדרת מבנה הגן, חלבון שנשמרת מוטיבים, מיקום כרומוזומלית, ג'ין כפילויות ותבניות הביטוי, כמו גם נבואתו של אתרי לוקליזציה, זרחון החלבון, להשיג אפיון ממצה של משפחה גנטי בצמחים. גישה כזו כוללת חל כאן אפיון משפחת ATL E3 ליגאז אוביקוויטין בבית הגפן. על פי תפקידם המתרחב של חברי תת ATL בוויסות תהליכים תאיים מפתח⁷, עבודה זו יכול גם לסייע הזיהוי של מועמדים ללימודים פונקציונלי, ולפצח בסופו של דבר את המנגנונים המולקולריים המסדירים הסתגלות של היבול חשוב על סביבתו.

Protocol

1. זיהוי של ATL בשם ג'ין משפחה חברים

1. גירסת האינטרנט PSI-הפיצוץ
   1. פתח את דף האינטרנט של הפיצוץ¹³ ולחץ על המקטע הפיצוץ חלבון.
   2. בשדה "Enter שאילתה רצף", להזין את רצף חומצות אמיניות של החלבון (VIT_05s0077g01970 כאן) שישמש כמו החללית כדי לזהות את בני המשפחה.
      הערה: חלבון נציג טוב צריך להיות בשימוש (חלבון הצגת כל התכונות החשובות המאפיינות את המשפחה).
   3. בשדה 'בחר חיפוש ערכת', בחר 'חלבון הפניות' במסד הנתונים (refseq_protein) ובין האורגניזם עניין (נ' vinifera - taxid:29760).
   4. בבחירה שדה"תוכנית", בחר באלגוריתם PSI-הפיצוץ ולחץ על לחצן הפיצוץ כדי להפעיל את הניתוח.
      הערה: על ידי לחיצה על הפרמטרים"אלגוריתם" זה ניתן לשנות כמה פרמטרים מתקדמים (מקס היעד רצפים, רישום נקודות מטריקס, סף PSI-הפיצוץ, וכו ').
   5. הפיצוץ הראשון עגול מאחזר את כל רצפי הצגת התאמות הרלוונטיים עם השאילתה (e-ערך מעל הסף הנבחר - כברירת מחדל 0.005; 0.001 בניסוי זה). בטל את בחירת כל הערכים, אשר בבירור לא שייך למשפחת תחת בדיקה על-ידי לחיצה על השניה בעמודה "בחר עבור PSI-הפיצוץ" ולהפעיל האיטראציה PSI-הפיצוץ השני על ידי לחיצה על לחצן הפיצוץ כמו שלב 1.1.4.
   6. רצפים שזוהה מסומנים בצהוב. בטל בחירת הלהיטים שאוחזרו קשוחה, לחשוף עוד חזרות כפי שמתואר בשלב 1.1.5.
   7. המשך איטראציות עד האלגוריתם אינו מוצא כל ערך רלוונטי או שיגיע התכנסות (אין ערכים חדשים נמצאים). להוריד את הרשימה של גן בשם בני משפחתה עוד ניתוחים. מבחינה ויזואלית לבדוק את הלהיטים שאוחזרו בכל עותק חוזר כדי למנוע הנוכחות של תוצאות חיוביות שגויות.
2. הגירסה העצמאית PSI-הפיצוץ
   1. להוריד את הגירסה העצמאית של הפיצוץ על ידי לחיצה על לחצן 'הורד הפיצוץ' ב- דף הבית הפיצוץ¹³.
      הערה: התוכנה הפיצוץ עצמאי היא גירסה שורת הפקודה של ממשק אינטרנט שתואר קודם. היא מאפשרת לבצע את החיפוש PSI-הפיצוץ מול מסד נתונים מותאמים אישית מקומיים או מרוחקים. יתר על כן, היא מאפשרת חיפוש עם מוגדרים מראש מיקום ספציפי הציון מטריקס (PSSM).

2. ידני פיקוח מבני המשפחה PSI-הפיצוץ-מזוהה

1. יישור מרובים
   1. לאסוף את רצפי חומצי אמינו זוהו בעבר קובץ בתבנית FASTA ולהעלות את זה לתוך התוכנה מגה¹⁴ כדי להמשיך ביישור מרובים.
   2. לפתוח את התוכנה מגה, לחץ על לחצן "יישור", לחץ על "יישור עריכה/בנייה", לחץ על "צור זווית חדשה", לחץ על "חלבון".
   3. לחץ על "ערוך" מן התפריט יישור ו "הוספת רצף מתוך קובץ". אתר קובץ FASTA שנוצרו לפני ואשר ההעלאה של כל הרצף הנסקר.
   4. לחץ על "יישור" מן התפריט יישור ו "ליישר על ידי שרירים". השתמש בפרמטרים ברירת המחדל, לחץ על כפתור "חשב" והמתן להשלמת ההיערכות מרובים.
   5. מבחינה ויזואלית לבדוק את היישור מרובים כדי לא לכלול את בני המשפחה באופן שגוי החזוי. קנוניקל CxxC (13 x) PxCxHxxHxxCxxxW (7 x) CxxCW מוטיב, (ובמיוחד הנוכחות של השאריות פרולין לפני ציסטאין השלישי) הוא תכונת המפתח הנדרשים להגדרת בני המשפחה ATL.
2. ניתוח של לוגו מסוים
   1. להגיש רשימה סופית של בני משפחה (רצפים הגפן 96 למלא את דרישות כדי להיחשב ATL) אל Em מרובים עבור מוטיב ההתמחרות (מם)¹⁵ להגדרת מוטיבים שנשמרת על פני המשפחה.
   2. מדף הבית מם, לחץ על לחצן "מם", ולהשלים "הגשת טופס הנתונים" עם מידע מסוים באשר למשפחתו של עניין.
   3. השתמש מם ניתוח כדי לאשר הנוכחות של שני המוטיבים הצפויה בתוך בני המשפחה של ATL הגפן, קרי, את הטבעת-H2, המוטיבים GLD.
3. לחלופין, לבצע שלבים 2.1 ו- 2.2 בו זמנית באמצעות חבילת התוכנות לביואינפורמטיקה (ראה טבלה של חומרים).
   1. העלאת קובץ FASTA (ראה שלב 2.1.1) לסוויטה. בחר 'קובץ' התפריט, ולאחר מכן "יבא" ולחץ על "מתוך קובץ". אתר את הקובץ FASTA ולחץ על 'פתח'.
   2. בחר את כל רצפי מיובאים ברשימה, לחץ על הלחצן "יישור/להרכיב" בסרגל הכלים ולאחר מכן לחץ על "של Pairwise יישור מרובים". בחר "יישור שריר" ולחץ על "אישור" כדי להפעיל את היישור באמצעות פרמטרים ברירת המחדל.
   3. כדי להמחיש את הלוגו של היישור, לחץ על "גרפים" ← "אפשרויות" ובחר "לוגו רצף".

3. ניתוח של פרמטרים פיזיים חלבון ותחומים

1. כמו ההגדרה של פרמטרים פיזיים שונים של בני המשפחה הנסקר חשוב יש תיאור מקיף של המשפחה, להגיש הרשימה של בני משפחה על כלי אינטרנט מסוימים.
   1. נקודה איזואלקטרית (pI), משקל מולקולרי (kDa), להשתמש ProtParam ה-כלי¹⁶ באתר האינטרנט של Expasy עם פרמטרים ברירת המחדל.
   2. בלוקאליזציה subcellular חלבון, להשתמש בכלים השונים כדי להשיג חיזוי אמין יותר כגון ngLOC v 1.0¹⁷ עם הגדרות ברירת המחדל, targetP v 1.1¹⁸ עם הגדרות ברירת מחדל, חלבון גנבים לוקליזציה subcellular גרסה 1.2 של¹⁹ עם ניתוק ההסתברות של 0.5. אתרי זירחון, להשתמש בכלי²⁰ אינטרנט v 1.0 MUsite עם פרמטרים ברירת המחדל.
2. לחקור תחומים נוספים חלבון קרובי משפחה.
   1. פתח את דף האינטרנט מסד הנתונים Pfam²¹, בחר הכלי "חיפוש רצף", שלח רצפי חלבונים בתיבת שאילתה ולאחר לחץ על "לך" כדי להפעיל את הניתוח.
      הערה: כל רצף החלבון הוא ניתח באופן אינדיבידואלי. E-ערך של 1.0 ב הגדרת ברירת המחדל מאפשרת האפליה בין הלהיטים-שממצאים ומשמעותית.
   2. לפתוח שרת TMHMM²² מהמרכז לניתוח רצף ביולוגי לחקור את הנוכחות של אזורים transmembrane בשם.

הדבקת כל חלבון רצפים בו-זמנית בתיבת שאילתה (או לחילופין להעלות קובץ הטקסט כולל כל רצפי חלבונים בתבנית FASTA) ולחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.

לנתח חלבונים חסר החזוי תחומים transmembrane, לפי TMHMM (שלב 3.2.2), בכלי ProtScale כדי לזהות אזורים הידרופובי בשם. פתח את דף האינטרנט ProtScale²³. הדבקת כל רצף החלבון בתיבת שאילתה ובחר "Hphob. / קייט & דוליטל "כמו חומצת אמינו סולם. לחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.

4. כרומוזומלית הפצה, כפילויות, וארגון אקסון-אינטרון

1. מפת בני המשפחה ATL על הכרומוזומים בהתבסס על המידע מאוחזר באתר מרכז ביוטכנולוגיה הגפן הגנום CRIBI²⁴.
   1. אתר את דף הבית באתר האינטרנט PhenoGram²⁵. לכתוב את "קלט הקובץ" בתור קובץ טקסט מופרד באמצעות טאב עם תכונות מסוימות של הגנים למפות על הכרומוזומים, על פי הנחיות ממצה דוגמאות לגבי ההידור של הקובץ שסופק הבאה בנתיב "Phenogram" ← " תיעוד"←"אפשרויות"←"קלט קובץ".
   2. כתוב את "כותרת" של העבודה. בחר את הגנום להיגרר. הגנום לא מיושם בתוכנה, כמו הגנום הגפן, בחר "אחר" בתפריט הנפתח. לכתוב את הקובץ הגנום על פי הנחיות דוגמאות סיפק, בעקבות השביל "Phenogram" ← "תיעוד" ← "אפשרויות" ← "גנום", ולהעלות אותו.
   3. השתמש בפרמטרים ברירת המחדל של "פנוטיפ מרווח", "פנוטיפ צבע", "פורמט התמונה" או חלופות בחירה בתפריטים המתאימים ולחץ על "מגרש" לקבל את הפריט החזותי של הגנים על כרומוזום.
2. הגדרת המדינה שכפול של בני המשפחה באמצעות תוכנת MCScanX²⁶.
   1. הורד, לפתוח עותק של MCscanX במחשב המקומי פועל שורות פקודה 1 (1 קובץ משלים). הזן את התיקייה MCscanX וליצור את קבצי הפעלה נדרשת הפעלת הפקודה קווי 2 (1 קובץ משלים).
      הערה: התקנה של MCscanX ידוע להיכשל על כמה מכונות לינוקס 64 סיביות בעקבות בעיה בנוגע chdir הפונקציה. אם הודעת שגיאה מוחזרת הקשורים פונקציה זו על הפוך, ביצוע הפקודה הפקודה קווי 3 (1 קובץ משלים) צריכה לפעול, הפקודה "להפוך" ואמורים לאחר מכן.
   2. הורד את החלבונים נ' vinifera ואת קובץ ה-ביאור הפעלת הפקודה קווי 4 (1 קובץ משלים).
      הערה: את הגפן ביאור הקובץ צריך להיות רוכסן מכנסיו והחתול כרומוזום יחיד מידע בקובץ ייחודי על-ידי הפעלת הפקודה שורות 5 (1 קובץ משלים).
   3. הפעלה "הכל מול כולם" blastp חיפוש באמצעות הקובץ חלבון vinifera (פ') השאילתה והן את הנושא.
   4. צור מסד נתונים של הפיצוץ לחיפוש באמצעות נ' vinifera חלבון הקובץ מריצים שורות הפקודה 6 (1 קובץ משלים). לבצע את החיפוש blastp באמצעות הקובץ חלבונים נ' vinifera בתור שאילתה במסד הנתונים שיצרת קודם לכן על-ידי הפעלת הפקודה שורות 7 (1 קובץ משלים).
   5. המר את קובץ ביאור בתבנית מתאימה עבור MCScanX. הפעל את הפקודה שורות 8 (1 קובץ משלים) כדי להוריד את parseMSCanXgff.pl קובץ script מותאם אישית perl. בצע הניתוח של הפעלת קווי הפקודה 9 (1 קובץ משלים).
      הערה: vitis.gff קובץ נוצרת המכיל קואורדינטות ג'ין בתבנית הבאה:
      sp # ג'ין החל עמדה התנוחה המסיימת
      ". sp" שבו הוא קוד שתי אותיות עבור המין (Vv על הגפן) ואילו "#" הוא שמו של לגרדום. שימו לב כי הסקריפט perl מותאם אישית שסופק מתאים המרה ביותר, למרות שינוי קוד מסוימים עשויים להידרש בכמה מקרים ספציפיים בשל המגוון של המידע בקובץ ה-ביאור זמינים.
   6. השקת MCScanX מריצים שורות הפקודה 10 (1 קובץ משלים).
      הערה: "גפן" זה הקידומת של הביאור והן בקובץ הפלט הפיצוץ. זה מייצג דרישה חובה לתוכנה לפעול.
   7. לנתח את תוצאות MCScanX. MCScanX מייצרת קובץ טקסט אחד "vitis.collinearity", אשר מכיל בלוקים קוליניאריות. קובץ כזה יכול ניתנים לעיון בכל עורך טקסט (ראה דוגמה לפלט 1 1 קובץ משלים).
      הערה: ספריה "mcscaxOutput.html" נוצר המכילה קבצי html שמציעות היישורים מרובים של בלוקים קוליניאריות נגד כל כרומוזום הפניה. קבצים אלה יכולים להיבדק באמצעות דפדפן אינטרנט.
   8. לסווג את הגנים paralogous מבוססת על המיקום היחסי שלהם כרומוזומים מריצים שורות הפקודה 11 (1 קובץ משלים).
      הערה: ג'ין Paralogous סיווג המתואר משלים טבלה II. קובץ הפלט שנוצר "vitis.gene_type" מכיל את כל המידע מקורו באמצעות תבנית פשוטה מופרד בטאבים.
   9. לבצע ניתוח העשרת להעריך משפחת הגן יש prevalently נוצרה על-ידי מנגנון ספציפי מריצים שורות הפקודה 12 (1 קובץ משלים).
      הערה: "vitis.gene_type" נוצר קובץ זה צעד 4.2.8, ואילו קובץ "gene_family_file" מייצג קובץ טקסט בשורה אחת שבה השם של המשפחה (למשל, ATL_genes) ואחריו את שמות לוקוס על כל הגנים השייכים למשפחה מופרדים באמצעות טאב. המבחן הסטטיסטי שימושית עבור העשרה הוא מבחן המדויק פישר ו p-ערכי של מקורות שונים מאוחסנים בקובץ ה-"outputFile.txt".
3. דמיינו הארגון אקסון-אינטרון של גנים באמצעות עץ החיים אינטראקטיבי (מבצעים)²⁷, כלי ופשוט עבור התצוגה, ביאור, ניהול של עצים פילוגנטי.
   1. להעלות עץ פילוגנטי בסעיף "להעלות" של אתר האינטרנט של מבצעים. העץ נבנה לפי סעיף 5 להלן. עבור כל בן משפחה ג'ין, לאחזר חיזוי מבנה הגן הביאור V1 של הגנום הגפן (אתר CRIBI שפורטו לעיל). לחשב את האורך (ב- bp) בשם exons, אינטרונים ואזורי לא מתורגם (UTRs).
   2. השתמש את ערכת הנתונים "חלבון תחומים" עבור הדמיה גרפית של התבנית אקסון-אינטרון.

לכתוב קובץ טקסט רגיל כולל אורכי מחושב בהתאם למפרטים הניתנים בעקבות נתיב "עזרה" ← "דפי עזרה" ← "סוגי הנתונים (dataset)" ← "חלבון תחומים" האתר מבצעים²⁷. באמצעות ערכת נתונים "חלבון תחומים", את "המלבן (RE)" ואת הצורות "מלבן הפער (GP)" מייצגים את אקסון, את UTRs, בהתאמה.

5. ניתוח פילוגנטי ובמינוח

1. לנתח את קשרי הגומלין בין ATL בני המשפחה באמצעות הבנייה של עץ פילוגנטי באיכות גבוהה, ההגדרה של נומנקלטורה המשפחה.
   1. עבור משפחה ג'ין הגפן, בצע את הכללים שנקבעו על ידי ועדת המינוח הגפן סופר⁸.
   2. אחזר רצפים לבנה א ATL, נדרש התייחסות במינוח גנים הגפן⁸, ה מסד הנתונים UniProt²⁸ .
   3. לכתוב קובץ FASTA כולל כל רצפי הגפן, בני משפחה של ג'ין לבנה א לכלול ניתוח פילוגנטי. רצפי לאפשר המרבי של השתנות בין בני משפחה (לעומת רצפי חלבונים).
2. עץ פילוגנטי
   הערה: השימוש של הצינור ²⁹ Phylogeny.fr הוא מומלץ להביא עץ פילוגנטי באיכות גבוהה, אבל לא חובה.
   1. אתר הבית Phylogeny.fr²⁹ובחר את הצינור "ניתוח טקסונומי".
      הערה: "לחץ אחד" מתאימה ברוב המקרים, אך אם יש צורך זה אפשרי לבחור הגדרות מתקדמות ספציפי ("מתקדם") או אפילו ניתוח מותאמים אישית באופן מלא ("א-לה קארט"; ראה שלב 5.2.5).
   2. כתיבה "שמו של הניתוח," להעלות את FASTA הקובץ שיצרת קודם לכן (שלב 5.2.1 ולחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.
   3. לחלופין, אם ההליך המתואר לעיל (שלבים 5.2.1, 5.2.2) תוצאות בהודעת שגיאה, להשלים כל שלב של הצינור סוויטת האמיניות בנפרד, כדלקמן.
      1. שריר תוכנה דף הבית³⁰, בחר להעלות הקובץ FASTA ב "שלב 1", "פירסון/FASTA" "פורמט פלט" ב "שלב 2" ולחצו על "שלח" "בשלב 3" יישור רצפים של השאילתה.
      2. לחץ על 'הורד קובץ יישור' ולשמור כקובץ FASTA עבור עוד צעדים.
      3. תהליך הקובץ FASTA יישור לחסל לקוי ליישר עמדות באמצעות כלי שרת Gblocks³¹. להעלות את הקובץ FASTA יישור, בחר "DNA" "סוג של רצף" ובחרת את הפיכת האפשרות של לכתחילה המתאימה ביותר עם הניתוח (למשל, עבור הגפן ATL ג'ין המשפחה בחר כל שלושת האפשרויות המוצע לבחירה"פחות מחמירים" כי של רצף גבוהה גאוס). לחץ על "Get רחובות" כדי להפעיל את הניתוח.
      4. לחץ על "יישור Resulting" בתחתית הדף פלט, לשמור את התוצאות כקובץ FASTA חדש.
      5. מן הבית ' Phylogeny.fr '²⁹, בחר "A la Carte" צינור "האמיניות ניתוח". לאחר מכן, בטלו את הבחירה "יישור מרובים" ואוצרות "יישור". לחץ על "צור זרימת עבודה", להעלות את הקובץ FASTA מספר פעמים Gblocks (שלב 5.2.5.4), בחר "Bootstrapping נוהל" עם פרמטרים של ברירת המחדל ב- "הגדרות" ולאחר לחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.
   4. התמוטטות גרוע נתמך סניפים (קרי, ערכי האתחול < 70%) על ידי לחיצה על "לכווץ סניפים" במדור "בחירה ופעולה" ולהוריד את התוצאות הסופיות בתבנית Newick כדי ניתוחים נוספים.
3. להקצות שם הגן על טקסונומי בסיס.
   1. סקור את עץ פילוגנטי כדי להעריך את המהימנות של מבנה עץ העלאתו לסוויטה מבצעים שפורטו לעיל (סעיף 4.3).
   2. להקצות באופן ידני שם הגן כל בן משפחה. במקרה של orthologues ליחיד, להקצות את תודרנית-כמו שם (למשל, AtATL3 ← VviATL3). להבדיל גנים הגפן (שניים או יותר) הנובע homolog תודרנית יחיד עם מרחק פילוגנטי אותו באמצעות מספרים או אותיות, אם הגן תודרנית מסתיים עם מספר (למשל, AtATL23 ← VviATL23a, VviATL23b).
   3. במקרה של אחד-לרבים או רבים orthologues, להקצות שם גן חדש המורכב תודרנית-כמו שם (כאן, "ATL") יחד עם מספר גבוה יותר מאשר המספר הגבוה ביותר כבר בשימוש עבור נ' vinifera והן תודרנית (למשל., VviATL83).
   4. להשלים את המינוח של המשפחה החדשה שהוגדרה היורד מן החלק העליון לחלק התחתון של עץ פילוגנטי.

6. הגפן עוגב ו הבמה ביטוי פרופיל

1. ליצור עבודה נתונים מטריצה המכילה ביטוי הנתונים עבור בני המשפחה.
   1. הורד את נ' vinifera cv. דג קורבינה ג'ין ביטוי אטלס datamatrix מהקישור מופץ על פלטפורמה ResearchGate³². קובץ זה מכיל את הערכים בביטוי RMA מנורמל כדי לשמש בעקבות צעדים.
   2. לחלץ את הערכים ביטוי עבור כל משפחה ג'ין datamatrix אטלס ולכתוב "datamatrix עבודה" המכיל באותה שורה עליונה עם datamatrix אטלס. שמור את "datamatrix עבודה" בתור קובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים.
2. לבצע הניתוח מקובצים באשכולות bi היררכי באמצעות תוכנה מציג ניסוי רב (תהליך).
   1. להוריד ולהתקין תוכנה תהליך³³.
   2. להעלות את "datamatrix עבודה" (שלב 6.1.2) בעקבות השביל "קובץ" ← "נתוני עומס" ← "עיון", לבחור את קובץ הטקסט. בחר "מערך חד-צבעי" ולהסיר את תקתוק "טען ביאור" בעת ביאור אוטומטי לא מסופק. בחר את ערך הביטוי העליון והשמאלי ביותר לביטוי טבלה בתצוגה המקדימה של ולחץ על כפתור "טען".
   3. להתאים את הנתונים החלת השינוי Log2 ("להתאים את נתוני" ← "יומן המרות" ← "Log2 להמיר") ונורמליזציה הגן/שורה ("להתאים את נתוני" ← "הגן/שורה התאמות" ← "חציון במרכז הגן/שורה"). להגדיר את מגבלת מידה נאותה ("הצג" ← "להגדיר צבע סולם גבולות").
   4. לחשב התקבצות ההיררכית הבאה בנתיב "ניתוח" ← "התקבצות" ← "HCL".

בחר "לייעל את ג'ין עלה סדר" ואת "לייעל את המדגם עלה סדר" בשדה"אופטימיזציה ההזמנות", "מתאם פירסון" השטח "בחירת מטריקס מרחק", "ממוצע הצמדה קיבוץ באשכולות" בשטח "בחירת שיטת הצמדה". לאחר מכן, לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הניתוח.

להציג את התוצאות בתפריט "HCL" ← 'תוצאות ניתוח' בלוח השמאלי של החלון. לייצא את המפה חום על ידי לחיצה על 'שמור תמונה' בתפריט 'קובץ'.

7. ביטוי פרופיל בתגובה מדגיש ביוטיים, והאביוטיים

1. חזור על שלב 6.1 עם מזהה ההצטרפות בריוני המגרש המתקבל בהתאמה פרסומים ומחקרים חוקרים ללחץ ביוטיים, והאביוטיים על הגפן. לדוגמה, יכול להיות עיינת ניסויים מתן לפרופיל transcriptome של הגפן גרגרים נגועים עם המחלה פטרייתי Botrytis cinerea באמצעות microarray NimbleGen ענבים כל הגנום של בריוני המגרש המזהה GSE52586. חזור על שלבים 6.1.1 ו 6.1.2.
2. חפש בארכיון קורא רצף NCBI³⁴ עם ההזמנות/BioProject מזהה (למשל, SRP055458 או PRJNA275778 לניסויים "הצללה פרח הגפן") ולהוריד את כל קריאות רצף raw. RNA-seq datasets ממחקרים שונים רבים מעובדים באמצעות צינור בודד עבור עקביות.
   1. בקצרה, לקצץ רצף raw FASTQ קריאות (יחיד - ו זוג-end), לסנן איכות עם Trimmomatic³⁵. שימוש, AVGQUAL ו MINLEN סינון של 20 ו- 40, בהתאמה, הכל פרמטרים ברירת המחדל.
   2. אינדקס 12 X הגפן הפניה הגנום¹ באמצעות Bowtie2³⁶. הורד 12 X הגפן הפניה הגנום (למשל, bowtie2-לבנות) לפני הפעלת הפקודה bowtie2 .
   3. להשיג טבלאות מטריקס ספירה עם htseq-לספור³⁷ באמצעות הקובץ ביאור (מנכ ל החברה/GTF) הגפן דגם ג'ין V1.
3. ביצוע דיפרנציאלית של הביטוי (re-) מפענוח R³⁸ עם ספריות³⁹ limma עבור מטריצות מנורמל-RMA וספריות⁴⁰ DESeq2 עבור טבלאות מטריקס ספירת המתקבל שלבים 7.1.1 ו 7.2.1, בהתאמה.
   1. לבצע השוואת "שתי קבוצות" רגיל (כלומר, "טיפול" / "לשלוט"). ודא כי עיצוב המטריקס/הקיבוצים תנאי "שולט" ו- "טיפול" מוגדרים כראוי.
      הערה: טיפוסי עיצוב לניתוח microarray ביטוי דיפרנציאלי (GSE52586) כדי להשוות EL-33 גרגרים נגועים Botrytis cinerea נגד פירות יער (בריא) שליטה בשלב פיתוח זהה עם limma מריצים שורות פקודה 13 מוצג 1 קובץ משלים. עיצוב אופייני לניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq (SRP055458 או PRJNA275778) כדי להשוות בין פרח (ב 7 ימים לאחר קאפ-בסתיו) תחת צל טיפול נגד הפקד עם DESeq2 מריצים שורות הפקודה 14 מוצג 1 קובץ משלים .
   2. לקבל את הרשימות של גנים ביטוי באופן שונה (מעלות) בניגוד לכל, עבור limma, השתמש את פונקציות lmFit(), ואחריו eBayes(), ולאחר מכן על-ידי פונקציות () topTable, בעוד שלגבי DESeq2, השתמש DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq(), פונקציות results() . להלן, רצף עבודה אופייני להיות אחריו.
      1. ראו microarray ביטוי דיפרנציאלי לניתוח, שורות פקודה 15 (1 קובץ משלים). ניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq ראה שורות פקודה 16 (1 קובץ משלים). חזור על השלבים שלעיל עבור כל שאר ניגודים סכימה עיצוב המתאים שונה (ראה דוגמאות בשלב 7.3.1)
4. מתוך הרשימות של DEGs שנוצר, לחלץ את כל השורות לא מתאימות את הצטרפותן ATL V1, לשמר עמודות המכילות log2 מקפלים השינוי (טיפול/פקד) > | 0.5 | מותאמות p-ערכים (פד) < 0.05, מיזוג אותם בהתאם לטבלה מטריקס, אם מחקר נופל לתוך "והאביוטיים" או "ביוטי/פתוגן אינטראקציה" compendia.
5. לבנות את heatmaps באשכולות היררכי (compendia והאביוטיים וביוטי) ב- R באמצעות ספריות של gplots.
   הערה: קורא את הפונקציה heatmap.2 בונה את heatmap יחד עם שורה dendrograms מהטבלאות מטריצה בהתאמה. טיעונים נוספים באמצעות cellnote לתפקד מסייעת להבחין באופן שונה ביטוי (log2FC > רוזוולט 0.5, < 0.05) ATL גנים כל השוואה על פני מגוון גדול של תנאי הניסוי על-ידי * סמל. החלת זרימת העבודה אופייני ב- R מריצים שורות הפקודה 17 (1 קובץ משלים) או לחלופין, חזור על שלבים 6.2.2 כדי 6.2.5 לבנות את heatmaps באמצעות תהליך תוכנה.

8. ניתוח היחסים בין התבדרות Paralogous רצף גנים שיתוף

1. לבנות מטריקס המכיל pairwise דמיון. האלמנטים של המטריקס. הדמיון הם הערכים של דמיון רצף שמחושבים על היישורים pairwise חלבון.
   1. השתמש בשרת⁴¹ אינטרנט המחט הבלטה עם הגדרות ברירת מחדל כדי ליצור רצף pairwise היישורים ולשמור כקובץ טקסט. פתח את קובץ הטקסט פלט ולהסיר את כל השורות ההערה, יחד עם שמות עמודות ושורות כדי להפיק קובץ בשם "similarityTable.txt".
      הערה: טבלה כזו כולל שורה עבור כל ג'ין ATL דיווח הערכים דמיון מחושב בכל אחד היישור pairwise. סדר לוקוסים בשורות ובעמודות הוא זהה כך מטריצה סימטרית נוצרת עם כל הכבוד של הערכים האלכסוניים.
2. לבנות את המטריקס. עם ביטוי שיתוף נתונים על-ידי חישוב מקדם המתאם של פירסון. ההליך הבא דורש R ומודול perl PDL.
   1. הורד את הערכים בביטוי עבור הגנים ATL 96 הפעלת הפקודה שורות 18 (1 קובץ משלים) בתוך מסוף. ביצוע ניתוח ביטוי שיתוף באמצעות קובץ script מותאם אישית perl הניתנים להורדה על-ידי הפעלת הפקודה שורות 19 (1 קובץ משלים). Script כזה יחשב את מקדם המתאם של פירסון בין זוגות של לוקוסים ATL דיווח כאמור.
   2. השקת ה-script פועל שורות פקודה 20 (1 קובץ משלים) ובצע את ההוראות פלט.

קובץ ה-script תיצור קובץ הפלט (כלומר "coexpressionTable.txt") המכיל מטריצה ביטוי משותף ובו שמות לוקוס באותו הסדר של מטריקס שהושג בשלב 8.1 (מצווה זו היא חיונית כדי להפעיל את המבחן האח, ראה להלן).

לבצע מבחן מדף בין מטריצות נתונים שהתקבלו בשלבים 8.1 ו- 8.2. לאחר הזנת הסביבה R (להפעיל פקודה "R" מתוך מסוף), לטעון את ספריית ade4 באמצעות הפקודה הבאה: library(ade4)

1. הפעל את בדיקת האח על-ידי טעינת הנתונים שתי מטריצות וביצוע הסטטיסטיקה מריצים שורות הפקודה 21 (1 קובץ משלים), עם "nrep", המייצג את מספר התמורות. הבדיקה כוללת חישוב המתאם בין האלמנטים של מטריצות אלה, permuting מטריצות, ואז לחשב את סטטיסטיקת המבחן אותו שוב.
   הערה: כל הערכים שהושג של המבחן הסטטיסטי משמשים לבניית בהתפלגות הפניה של המבחן הסטטיסטי, אשר ישמש לחישוב p-הערך לבדיקה מובהקות. מספר התמורות מגדיר את מידת הדיוק שבה p-ניתן לקבל ערך.

תוצאות

הגן VIT_05s0077g01970, זיהתה. הכי דומה לבנה א ATL2 (At3g16720) דרך חיפוש BLASTp, שימש בדיקה סקר בני המשפחה ATL הגנום הגפן (cvנ' vinifera פינו נואר PN40024). הניתוח PSI-הפיצוץ נפגשות לאחר כמה מחזורים חשיפת רשימת הגנים בשם משפחה ג'ין ATL של הגפן (איור 1 א'). הנוכחות של התחום טבעת-H2 הקנו?...

Discussion

בעידן הגנומי, משפחות גנים רבים כבר שאפיינו עמוקות של מספר מיני צמחים. מידע זה הינו preliminary to מחקרים פונקציונלי ומספק מסגרת להמשיך לחקור. את התפקיד של חברים שונות במשפחה. בהקשר זה, יש גם צורך ומאפשר מערכת נומנקלטורה כדי לזהות באופן ייחודי לכל חבר במשפחה, הימנעות יתירות בבלבולים שעלולות להתעו?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Personal computer
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)			http://www.megasoftware.net/
Motif-based sequence analysis tools (MEME)			http://meme-suite.org/
Geneious	Biomatters Limited		http://www.geneious.com/
ProtParam Tool			http://web.expasy.org/protparam/
ngLOC			http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
TargetP v1.1 Server			http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
Protein Prowler			http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
MUsite			http://musite.sourceforge.net/
Pfam			http://pfam.xfam.org/
TMHMM Server v. 2.0			http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
ProtScale			http://web.expasy.org/protscale/
Grape Genome Database (CRIBI)			http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
PhenoGram			http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
MCScanX			http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
Interactive Tree Of Life (iTOL)			http://itol.embl.de/
UniProt			http://www.uniprot.org/
Phylogeny.fr			http://www.phylogeny.fr/index.cgi
MUSCLE			http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Gblocks Server			http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix			https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
Multi Experiment Viewer (MeV)			http://mev.tm4.org/#/welcome
Sequence Read Archive (SRA)			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
R			https://www.r-project.org/
EMBOSS Needle (EMBL-EBI)			http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/