Genom kapsamındaki bir tanımlama ve ifade Meta-Analizi ATL E3 Ubikuitin ligaz gen ailesinin asma için kapsamlı iş akışı

Özet

Bu makalede tanımlama ve asma Arabidopsis Tóxicos Levadura içinde (ATL) E3 Ubikuitin ligazlar aile için uygulanan bir gen aile karakterizasyonu için yordam açıklanır.

Özet

Sınıflandırma ve genlerin bir aile adlandırma önemli ölçüde kodlanmış protein çeşitliliği açıklaması ve aile işlevleri sıra motifler veya belirli gibi çeşitli özelliklerini temel alan tahmin katkıda bulunabilir translasyon modifikasyon ve farklı koşullarda aile üyelerinin ifade profil için siteler. Bu eser gen aile karakterizasyonu için detaylı bir protokolünü açıklar. Burada, yordamı Arabidopsis Tóxicos Levadura içinde (ATL) E3 Ubikuitin ligaz aile asma karakterizasyonu uygulanır. Aile üyeleri, gen yerelleştirme, yapısı ve çoğaltma karakterizasyonu, korunmuş protein motifleri analiz, protein fosforilasyon ve yerelleştirme siteleri tahmin genom çapında tanımlaması yöntemleri içerir yanı sıra gen ifadesi farklı DataSet'lerdeki aile arasında profil oluşturma. Deneysel amaçlar bağlı olarak daha fazla analiz için uzun olabilir, gibi işlem herhangi bir gen aile içinde kendileri için genomik veri kullanılabilen herhangi bir bitki türü için uygulanabilir ve ilginç adayları tanımlamak için değerli bilgiler sağlar fonksiyonel çalışmalar için bitki adaptasyon çevreleri için moleküler mekanizmaları anlayışlar veren.

Giriş

Son on yılda, asma genomik çok araştırma yapılmıştır. Grapevine araştırma meyve geliştirme ve odunsu bitkilerin yanıt-e doğru biyotik ve abiyotik stres için bir model haline gelmiştir tanınan bir ekonomik olarak uygun ürün var. Bu bağlamda, Vitis vinifera cv. PN40024 genom 2007¹ ve onun güncelleştirmek yorum 2011² serbest bırakılması için "Omics" ölçekli veri hızlı bir birikimi ve yüksek üretilen iş çalışmaların bir patlama yol açtı. Yayımlanmış sıra verilere dayanarak, kapsamlı bir analiz (genellikle korunmuş motifleri, yapısal ve/veya fonksiyonel benzerlikler ve evrimsel ilişkilerini paylaşımı proteinlerin oluşan) bir verilen gen ailesinin şimdi yapılabilir ortaya çıkarmak için onun Moleküler işlevler, evrim ve gen ifade profilleri. Bu analizler nasıl gen aileler bir genom geneli düzeyinde fizyolojik süreçleri kontrol anlamak için katkıda bulunabilir.

Bitki yaşam döngüsü birçok açıdan Ubikuitin-aracılı bozulması normal hücresel süreçler sağlamak için ince ayarlı bir ciro gerektirir anahtar proteinlerin tarafından düzenlenmektedir. Önemli bileşenleridir Ubikuitin-aracılı bozulma sürecinin E3 Ubikuitin ligazlar, hangi sistem esneklik, belirli hedefleri³alımı sayesinde sorumludur. Buna göre bu enzimlerin büyük gen ailesi, Arabidopsis thaliana genom⁴, belirli hedef proteinler ubiquitination için oyunculuk her E3 Ubikuitin ligaz öngörülen yaklaşık 1.400 E3 ligaz kodlama genler ile temsil eder. Substrat özgü ubiquitination tesislerinde hücresel yönetmelikte önemi rağmen nasıl ubiquitination yolu düzenlenir hakkında az şey bilinmektedir ve hedef proteinler sadece birkaç durumda tespit edilmiştir. Böyle özgüllük ve düzenleme mekanizmaları deşifre ilk kimlik ve özellikle sistemin farklı bileşenlerinin karakterizasyonu E3 ligazlar kullanır. Ubikuitin ligazlar arasında ATL alt familya 91 üye bir yüzük-H2 parmak etki alanı^5,6, bazıları savunma ve hormon yanıt-e doğru⁷' rol görünen A. thaliana tanımlanan karakterizedir.

Yeni bir gen aile üyelerini tanımlamak için ilk önemli adım fikir birliği motifleri, anahtar etki alanları ve protein dizi özellikleri gibi aile özellikleri kesin tanımıdır. Nitekim, patlama analize dayalı tüm gen aile üyeleri güvenilir alınmasını etki alanlarındaki belirli protein protein işlevi/etkinlik, protein imza olarak hizmet veren sorumlu bazı zorunlu serisi özellikleri gerektirir. Bu önceki diğer bitki türleri aynı gen ailesinde karakterizasyonu tarafından kolaylaştırdı veya farklı genler putatively ortak sıraları ayırmak için farklı bitki türü içinde aynı aileye ait analiz ederek elde. Aile üyeleri daha sonra tek tek uluslararası konsorsiyum tarafından verilen bitki türleri için yerleşmiş ortak kurallarına adlandırılabilir. Grapevine içinde Örneğin, süper adlandırma V. vinifera ve A. thaliana dahil olmak üzere bir filogenetik ağaç inşaatı kurulması Komitesi üzüm Gene ek açıklama (sNCGGa), için öneriler gibi işlem tabi tutulur gen ek açıklama izin vermek için gen aile üyeleri üzerinde nükleotit dizileri⁸dayalı.

Kromozom yerelleştirme aile üyeleri ve gen çoğaltma anket izin bütün-genom veya tandem yinelenen genler varlığı vurgulayarak. Bu tür bilgiler bir işlevsel artıklık göstermek veya farklı durumlarda, Yani, Sigara functionalization, neo-functionalization veya alt functionalization⁹ortaya beri sözde gen fonksiyonları, çözülmeye yararlı görünür. Genetik yenilik, değişen ortamlar¹⁰bitki adaptasyon için yeni hücresel bileşenleri sağlama oluşturmak önemli olaylar her iki neo - ve alt - functionalization vardır. Özellikle, mükerrer atalarının genlerinin ve üretim yeni genlerin asma genom evrimi sırasında çok sık ve proksimal ve tandem mükerrer asma kaynaklanan yeni kurulan genler daha yeni üretmek olasılığı işlevleri¹¹.

Gen aile işlevi deşifre başka bir önemli faktör transcriptomic profilidir. Transcriptomic veri çok büyük miktarda erişimlerini ortak veritabanları kullanılabilirliğini böylece sözde işlevleri büyük ölçekli silico ifade analizleri kullanarak gen aile üyelerine atamak için yararlanılabilir. Nitekim, bazı genler belirli bitki organlarında veya yanıt olarak bazı gerilmeler tuhaf ifade tanımlanmış koşullarında ilgili proteinlerin sözde rolleri ile ilgili bazı ipuçları vermek ve mümkün hakkında hipotezler destek vermek alt functionalization yinelenen genlerin farklı sorunlara yanıt vermek için. Bu amaçla, çeşitli veri kümeleri dikkate almak önemlidir: Bu zaten mevcut gen ifade matrisleri, genom-wide transcriptomic atlas asma organlar ve gelişim aşamalarında¹², gibi olabilir ya da özel tarafından inşa edilebilir transcriptomic veri kümeleri için tanımlanmış stresleri tabi belirli bitki türleri için alınıyor. Ayrıca, iki matrisi kullanarak basit bir yaklaşım, bir ikili benzerlik verilerle ve ikili işbirliği ifade katsayıları ile diğer bir sıra benzerlik ve ifade desenleri bir gen ailesi içinde arasındaki ilişkileri değerlendirmek için uygulanabilir.

Bu çalışmanın amacı, gen yapısı, korunmuş protein motifleri, kromozom konumu, gen Mükerrer ve ifade desenleri, de protein fosforilasyon ve yerelleştirme siteleri ulaşmak için tahmini tanımlayan genel bir yaklaşım sağlamaktır bir bitkilerde gen aile ayrıntılı karakterizasyonu. Geniş kapsamlı bir yaklaşım burada ATL E3 Ubikuitin ligaz aile asma karakterizasyonu uygulanır. Göre ortaya çıkan rolü önemli hücresel işlemleri⁷düzenlenmesinde ATL alt familya üyelerinin bu eser de fonksiyonel çalışmalar için güçlü adaylar belirlenmesine yardımcı ve sonunda yöneten moleküler mekanizmaları unravel Bu önemli ürün kendi ortamına adaptasyonu.

Protokol

1. sözde ATL gen aile üye (ler) tanımlaması

1. PSI-BLAST web sürümü
   1. PATLAMA web sayfa¹³ açın ve protein patlama bölümü tıklatın.
   2. Sonda ailenin diğer üyeleri tanımlamak için kullanılan protein (burada VIT_05s0077g01970) amino asit dizisi "Enter sorgu sırası" alanına girin.
      Not: İyi bir temsilcisi protein olmalıdır (aile karakterize tüm önemli özelliklerini görüntüleme bir protein) kullanılır.
   3. "Seç Arama set" alanında "protein" başvuru"veritabanı (refseq_protein) ve faiz (V. vinifera - taxid:29760) organizmanın seçin.
   4. Seçimdeki alan"Program", PSI-BLAST algoritma seçin ve analizler için patlama düğmesini tıklatın.
      Not: "algoritma parametreleri" tıklayarak bu (Max hedef sıraları, puanlama matris, PSI-BLAST eşik, vb) bazı gelişmiş parametrelerini ayarlamak mümkündür.
   5. İlk patlama yuvarlak sorgu ile alakalı eşleşmeleri görüntüleme tüm dizileri alır (e-değer seçili eşiğin - varsayılan olarak 0.005; bu deneyde 0.001). Açıkça "PSI-BLAST için Seç" sütunundaki onay tıklayarak inceleme altında ailesine ait ve ikinci PSI-BLAST yineleme adım 1.1.4 olduğu gibi patlama düğmesi tıklatılarak çalıştırılır tüm kayıtlar, seçimini kaldırır.
   6. Yeni tanımlanan dizileri Sarı renkle vurgulanır. Açıkça yanlış alınan sayısı seçimini kaldırın ve daha fazla 1.1.5 adımda anlatıldığı gibi yinelemeler ortaya çıkarmak.
   7. Yinelemeler ile algoritma değil bulmak ilgili herhangi bir giriş veya (yeni girdi bulunur) yakınsama ulaşır kadar devam. Daha fazla analizleri için sözde gen aile üyeleri listesini indirmek. Yanlış mutlak varlığı önlemek için her yineleme tarihinde erişilmiştir sayısı kontrol edin.
2. PSI-BLAST standalone yorum
   1. PATLAMA tek başına sürümünü patlama ana sayfa¹³"Patlama download" butonuna basarak indirin.
      Not: Tek başına patlama yazılım daha önce açıklanan web arayüzü bir komut satırı sürümüdür. Özel bir yerel veya uzak veritabanı karşı PSİŞİK-BLAST arama yürütme hizmeti sağlar. Ayrıca, bu bir önceden tanımlanmış pozisyon belirli Puan matris (PSSM ile) arama sağlar.

2. el ile muayene PSI BLAST tespit aile üyelerinin

1. Birden çok hizalama
   1. Daha önce tanımlanmış bir FASTA biçimli dosyada amino asitli dizileri toplamak ve içine MEGA yazılım¹⁴ çoklu hizalaması ile devam etmek için adatum.com'un.
   2. MEGA bilgisayar yazılımı açık, "Hizala" düğmesini tıklatın, tıklayın "Düzenle/Yapı Hizalama", "yeni bir hizalama oluştur" u tıklayın, "Protein"'ı tıklatın.
   3. "Düzenle" hizalama menüsü ve "Sıra dosya üzerinden Ekle" seçeneğini tıklatın. Kaş için daha önce oluşturulmuş FASTA eğe ve upload anketin sıralarının onaylayın.
   4. "Hizalama" hizalama menüsü ve "Hizalamak tarafından kas" tıklayın. Varsayılan parametrelerini kullanın, "Hesaplar" düğmesini tıklatın ve birden çok hizalama tamamlaması için beklemeye.
   5. Yanlış tahmin edilen aile üyeleri tutmak için birden fazla hizalama bakarak kontrol edin. Kurallı CxxC (13 x) PxCxHxxHxxCxxxW (7 x) CxxCW motifi, (özellikle üçüncü sistein önce prolin kalıntı varlığı), ATL aile üyeleri tanımlamak için gerekli önemli özelliktir.
2. Özel LOGO analizi
   1. Aile üyeleri (96 asma dizileri ATL dikkate alınması gereken gereksinimlerini karşılayacak) kesin listesi birden çok korunmuş motifleri aile arasında tanımlamak için Em Motif yaşla (MEME)¹⁵ için gönderin.
   2. MEME giriş sayfasından "MEME" düğmesini tıklatın ve "Veri teslim formu" belirli bilgileri ile ilgili olarak aile ilgi tamamlamak.
   3. MEME analiz iki beklenen motifleri asma ATL aile üyeleri, Yani, yüzük-H2 ve GLD motifleri içinde varlığını doğrulamak için kullanın.
3. Alternatif olarak, 2,1 ve 2,2 aynı anda Biyoinformatik yazılım paketi kullanarak adımları uygulayın (bkz. Tablo malzeme).
   1. FASTA dosya upload (bkz. Adım 2.1.1) içine belgili tanımlık maiyet. "Dosya" menüsünü, sonra "Al" ve tıklayın "dosya" seçin. FASTA dosyasını bulun ve "Aç"'ı tıklatın.
   2. İçe aktarılan tüm dizileri listesinde seçin ve araç çubuğundaki "Align/montajı" düğmesini tıklayın ardından "İkili birden çok hizalama". "Kas hizalama" seçin ve "OK" varsayılan parametrelerini kullanarak hizalama başlatmak için tıklatın.
   3. LOGO diziliş görselleştirmek için "Grafik" → "tıkırtı üstünde seçme hakkı" ve "Sıra logosu" seçin.

3. Protein fiziksel parametrelerini ve etki analizi

1. Anketin aile üyelerinin farklı fiziksel parametrelerini tanımını aile kapsamlı bir açıklaması olması çok önemli olduğu için belirli web araçları için aile üyeleri listesini gönderin.
   1. İsoelectric noktası (PI) ve molekül ağırlığı (kDa) için varsayılan parametreleri ile Expasy Web ProtParam aracı¹⁶ kullanın.
   2. Protein hücre altı yerelleştirme için ngLOC v1.0¹⁷ gibi varsayılan ayarları ve protein Avcı gemi hücre altı yerelleştirme v1.2^{19 ile daha güvenilir bir tahmin varsayılan ayarları, targetP v1.118 ile elde etmek için farklı araçlar kullanabilir} 0,5 olasılık cut-off ile. Fosforilasyon siteler için varsayılan parametreleri ile MUsite v1.0 web aracı²⁰ kullanın.
2. Ek protein etki alanlarında aile üyeleri araştırmak.
   1. Pfam veritabanı Web sayfası²¹açın, "Sıra arama" aracını seçin, protein sequences sorgu kutusuna göndermek ve analizler için "git" seçeneğini tıklatın.
      Not: Tek tek her protein dizi analiz edilir. Varsayılan ayar olarak 1,0 e değerini önemli ve önemli sigara sayısı arasında ayrım sağlar.
   2. TMHMM Server²² sözde Transmembran bölge varlığını araştırmak biyolojik dizi analizi için Merkezi'ni açın.

Tüm protein dizileri aynı anda sorgu kutusuna yapıştırın (veya alternatif olarak FASTA biçiminde tüm protein dizileri dahil olmak üzere bir metin dosyasına yüklemek) ve analizi çalıştırmak için "Gönder"'i tıklatın.

Tahmin edilen transmembran etki alanları, eksik proteinlerin sözde hidrofobik bölgeler tanımlamak için TMHMM göre (3.2.2. adım) ProtScale aracı ile analiz. ProtScale Web sayfası²³açın. Her protein sıra sorgu kutusuna yapıştırın ve seçin "Hphob. / Kyte & Doolittle "amino asit ölçek olarak. Analizler için "Gönder"'i tıklatın.

4. kromozom dağıtım, Mükerrer ve Exon-intron organizasyon

1. Grapevine genom CRIBI biyoteknoloji Merkezi Web sitesi²⁴alınan bilgileri temel alan kromozomlar ATL aile üyelerinde eşleyin.
   1. PhenoGram Web sitesi ana sayfasını²⁵göz atın. "Giriş üzerinde ayrıntılı yönergeler ve örnekler sağlanan dosya yolunu takiben derlenmesi ile ilgili göre kromozomlar eşleşmesi için dosyayı" sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak genler belirli özellikleri ile "Phenogram" yazmak → " Belgeleri"→"Seçenekler"→"girdi dosyası".
   2. Çalışma "başlık" yazın. Çizilecek genom seçin. Grapevine genom gibi yazılım uygulanmamış genleri için "diğer" damla-aşağı yemek listesi seçin. Yönergeler ve örnekler verilmiştir, yolunu takiben göre genom dosya "Phenogram" yazmak → "Dokümantasyon" → "→"Genom"Seçenekler" ve yükleyin.
   3. Varsayılan parametreler "Fenotip aralığı", "Fenotip renk", "Görüntü biçimi" veya select alternatifler ilgili menülerde kullanın ve "Genler kromozomlar üzerinde görselleştirme elde etmek çıkart"'ı tıklatın.
2. MCScanX yazılım²⁶kullanarak aile üyeleri çoğaltma durumunu tanımlamak.
   1. İndirme ve MCscanX bir kopyasını komut satırları 1 (ek dosya 1) çalıştıran bir yerel makinede halletmek. MCscanX klasörüne girin ve komut satırları 2 (ek dosya 1) çalışan gerekli yürütülebilir dosyaları oluşturun.
      Not: MCscanX yüklenmesini bazı Linux 64 bitlik makinelerdeki işlevi chdir ile ilgili bir sorun nedeniyle başarısız olduğu bilinmektedir. Hata iletisi bu işlev yapmak üzerine ilgili IF verir komut yürütme, komut satırları 3 (ek dosya 1) çalıştırmak gerekir ve komut "yapmak" daha sonra denenmesi gerektiğini.
   2. V. vinifera proteinler ve komut satırları 4 (ek dosya 1) çalıştıran ek açıklama dosyasını indirin.
      Not: fermuarını açıp olmak asma ek açıklama dosyası ihtiyaçları ve komut satırları 5 (ek dosya 1) çalıştırarak benzersiz bir dosya içinde tek kromozom bilgi kedi.
   3. Bir "tüm tüm karşı" blastp arama sorgu ve konu V. vinifera protein dosyasını kullanarak Çalıştır.
   4. Komut satırları 6 (ek dosya 1) çalışan V. vinifera protein dosyası kullanarak bir aranabilir patlama veritabanı oluşturun. Blastp arama sorgu olarak V. vinifera proteinler dosyasını kullanarak komut satırları 7 (ek dosya 1) çalıştırarak önceden oluşturulmuş veritabanı karşı.
   5. Ek açıklama dosyasını uygun bir biçimde MCScanX için dönüştürün. Komut satırlarını 8 (özel perl komut dosyası parseMSCanXgff.pl indirmek için,ek dosya 1) çalıştırabilir. Komut satırları 9 (ek dosya 1) çalışan çözümlemesi gerçekleştirin.
      Not: Bir dosya vitis.gff gen koordinatları aşağıdaki biçimde tutan oluşturulur:
      başlama pozisyonu Bitiş pozisyonu sp # gen
      "#" iskele adı ise "sp" türler (Vv grapevine için) için iki harfli kod nerede. Not Bazı kod değişikliği kullanılabilir ek açıklama dosyasında sağlanan bilgi çeşitliliği nedeniyle belirli bazı durumlarda gerekli, ancak sağlanan özel perl komut dosyası çoğu dönüştürme için uygundur.
   6. Komut satırları 10 (ek dosya 1) çalışan MCScanX başlatın.
      Not: "vitis" ek açıklama ve patlama çıktı dosyası önektir. Bu yazılımın çalışmasına için zorunlu bir gereklilik temsil eder.
   7. MCScanX sonuçlarını analiz. MCScanX bir metin dosyasını "vitis.collinearity" collinear taşlarını içeren, üretir. Böyle bir dosya herhangi bir metin düzenleyicisi tarafından kontrol (bkz. örnek çıktı 1 ek dosya 1).
      Not: Birden fazla hizalamaları her başvuru kromozom karşı collinear blokların featuring html dosyalarını içeren bir "mcscaxOutput.html" dizini oluşturulur. Bu dosyaları bir web tarayıcısı üzerinden kontrol.
   8. Paralogous Genler kromozomlar komut satırları 11 (ek dosya 1) çalışan göreli konumlarını göre sınıflandırmak.
      Not: Paralogous gen sınıflandırma Ek tablo IIiçinde açıklanmıştır. Oluşturulan çıktı dosyası "vitis.gene_type" basit sekmeyle ayrılmış biçiminin tüm kaynak bilgilerini içerir.
   9. Gen aile yüksekokul komut satırları 12 (ek dosya 1) çalıştıran belirli bir mekanizma tarafından kökenli olup olmadığını değerlendirmek için zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin.
      Not: dosya "gene_family_file" içinde ailesine ait tüm genler için odağı adları (örneğin, ATL_genes) aile adını izliyor bir satır metin dosyası ise dosya "vitis.gene_type" 4.2.8, bir adımda oluşturulur sekme ile ayrılmış. Fisher kesin test ve pzenginleştirme için uygulamalı istatistik test olduğunu-değerleri farklı kökenli "outputFile.txt" dosyasında depolanır.
3. Görüntü, ek açıklama ve yönetim filogenetik ağaç için etkileşimli hayat ağacı (iTOL)²⁷, çevrimiçi bir aracı kullanarak genler exon-intron organizasyonu görselleştirin.
   1. İTOL Web sitesi "Upload" bölümünde bir filogenetik ağaç yükleyin. Ağaç aşağıdaki bölüm 5 göre inşa edilmiştir. Her aile üyesi gen için V1 ek açıklama asma genomunun (yukarıda bahsedilen CRIBI Web sitesi) gen yapı tahmini almak. Uzunluğunu (bp) sözde ekzonlar, intron ve Çevrilmeyen bölgeler (UTRs) hesaplar.
   2. "Protein etki alanları" veri kümesi exon-intron desen grafik görselleştirme için kullanın.

Yolu "Yardım" → "yardım sayfaları" → "Veri türleri" → "Protein etki alanları" iTOL Web sitesi²⁷' deki takip sağlanan belirtimlerine göre hesaplanan uzunlukları kapsayan bir düz metin dosyası yazmak. "Protein etki alanları" veri kümesi kullanarak, "dikdörtgen (RE)" ve "dikdörtgen Aralık (GP)" şekiller exon ve UTRs sırasıyla temsil eder.

5. Filogenetik analizi ve adlandırma

1. Yüksek kaliteli filogenetik ağaç inşaat ve bir aile adlandırma tanımını ATL aile üyeleri arasındaki ilişkileri analiz.
   1. Bir asma gen ailesi için asma Super adlandırma Komitesi⁸tarafından kurulan kurallara uyun.
   2. UniProt veritabanı²⁸ içinden asma gen adlandırma⁸için başvuru olarak gereken A. thaliana ATL serilerini almak.
   3. Asma ve A. thaliana gen aile üyeleri içinde Filogenetik analizi dahil edilecek tüm nükleotit dizileri de dahil olmak üzere bir FASTA dosya yazın. Nükleotit dizileri aile üyeleri (protein dizileri karşılaştırıldığında) arasında değişkenlik en izin.
2. Filogenetik ağaç
   Not: Phylogeny.fr ²⁹ boru hattı yüksek kaliteli filogenetik ağaç almak için önerilen ancak değil zorunlu kullanmaktır.
   1. Phylogeny.fr ana sayfa²⁹gidin ve "Phylogeny analizi" boru hattı seçin.
      Not: "Bir tıkırtı" Olguların çoğunda uygundur, ancak bu gerekirse belirli gelişmiş ayarlar ("Gelişmiş") veya bile tamamen özelleştirilmiş bir çözümleme seçmek mümkündür (bkz "A la Carte";. Adım 5.2.5).
   2. Yazma "İsim analizi", upload, önceden oluşturduğunuz FASTA dosyasının (Adım 5.2.1 ve analizler için "Gönder"'i tıklatın.
   3. Alternatif olarak, yordam (yukarıdaki adımları 5.2.1, 5.2.2) tarif varsa hata iletisi sonuçlarında tamamlamak Phylogeny Süiti boru hattının her adımı ayrı ayrı, aşağıdaki gibi.
      1. KAS yazılım ana sayfa³⁰, yükleme "Adım 1", FASTA dosyasında "Pearson/FASTA" "Çıktı biçimi" "Adım 2" ve tıkırtı "Boyun eğmek" olarak "sorgu serilerini hizalamak için adım 3" seçin.
      2. "Hizalama dosyayı yükle" ve daha fazla adımlar için FASTA dosyası olarak kaydedin.
      3. İşlem kötü ortadan kaldırmak için hizalama FASTA dosya konumları kullanarak Gblocks Server aracı³¹hizalı. Hizalama FASTA dosya yüklemek, "DNA" sıra "türü" olarak seçin ve (örneğin, asma ATL gen aile select üç seçenek önerilen "daha az sıkı seçimi için" çünkü için tam analizi ile en iyi uyan sıkılık seçenekleri açmadı yüksek sıralı sapma ile). "Blok için analizler al"'ı tıklatın.
      4. "Resulting hizalama" çıktı sayfa altında tıklatın ve sonuçları yeni FASTA dosyası olarak kaydedin.
      5. Phylogeny.fr ana sayfa²⁹, "Phylogeny analizi" potansiyel "A la Carte" seçin. Sonra "Birden fazla hizalama" seçimini kaldırın ve "Hizalama küratörlüğü". "İş akışı oluştur" u tıklayın, FASTA Gblocks küratörlüğünü dosya (Adım 5.2.5.4) yüklemek, varsayılan parametreleri "Ayarlar" ile "Bootstrapping yordamı" seçin ve analizi çalıştırmak için "Gönder"'i tıklatın.
   4. Desteklenen Daralt kötü dalları (Yani, önyükleme değerleri < % 70) tıklayarak "Seçin ve eylem" bölümünde "daraltmak dalları" ve kesin sonuçları Newick biçiminde daha fazla analiz için download.
3. Phylogeny üzerinde dayalı bir gen adı atayın.
   1. Filogenetik ağaç (Bölüm 4.3) bahsedilen iTOL oda içine yükleyerek ağaç yapısı güvenilirliğini değerlendirmek için gözden geçirin.
   2. Her bir aile üyesi için el ile bir gen adı atayın. Bire bir orthologues söz konusu olduğunda, Arabidopsisatamak-adı gibi (örneğin, AtATL3 → VviATL3). (İki veya daha fazla) kaynaklanan filogenetik mesafe kullanarak aynı ile tek bir Arabidopsis homolog üzerinden numaraları veya Arabidopsis gen bir sayıyla bitiyorsa mektupları asma genler ayırt etmek (örneğin, AtATL23 → VviATL23a, VviATL23b).
   3. Bir-çok veya çok-çok orthologues söz konusu olduğunda Arabidopsisoluşan yeni gen ad atama-adı gibi (burada, "ATL") zaten V. vinifera ve Arabidopsis için kullanılan en yüksek sayı daha yüksek bir sayı ile eşleştirilmiş (örn., VviATL83).
   4. En baştan filogenetik ağaç altına inen yeni tanımlanan aile adlandırma tamamlayın.

6. asma Organ ve sahne ifade profil oluşturma

1. Çalışma veri matrisi ifade verileri içeren aile üyeleri için oluşturur.
   1. V. vinifera cv. Corvina gen ifadesi Atlas datamatrix download--dan ResearchGate platform³²üzerinde Dağıtılmış bağlantı. Bu dosya tabi merdiven kullanılmak üzere normalleştirilmiş RMA ifade değerleri içerir.
   2. Atlas datamatrix her aile gen ifade değerleri ayıklamak ve "aynı üstbilgi satırı olarak Atlas datamatrix içeren bir çalışma datamatrix" yazmak. "Çalışma datamatrix" bir sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak kaydedin.
2. Çok deneme Viewer (MeV) yazılımını kullanarak hiyerarşik BI kümelenmiş çözümlemesi gerçekleştirin.
   1. Download ve install MeV yazılım³³.
   2. "Çalışma datamatrix" upload (adım 6.1.2) yolunu takiben "Dosya" → "Load Data" → "Gözat" ve metin dosyasını seçin. "Tek renkli dizi" seçin ve otomatik bir ek açıklama değil sağlandığında "Yük açıklama" kene çıkarmak. İfade tablo önizleme üst en soldaki ifade değerini seçin ve "Yükle" düğmesini tıklatın.
   3. Log2 dönüştürme ("Ayarlamak veri" → "Günlük dönüşümler" → "Log2 dönüşümü") ve gen/satır normalleştirme ("Ayarlamak veri" → "Gen/satır ayarlamalar" → "medyan Merkezi gen/satır") uygulama verilerini ayarlamak. Uygun ölçek sınırı ("Göster" → "ayarla renk ölçeği sınırları") ayarlayın.
   4. Hiyerarşik kümeleme "Analiz" yolunu izleyerek hesaplamak "→"HCL"kümeleme" →.

"En iyi duruma getirme Gene yaprak siparişi" ve "En iyi duruma örnek yaprak siparişi" alanında"sipariş en iyi duruma getirme", "Kümeleme ortalama bağlantı" ve "Mesafe matris seçimi" alanına "Pearson korelasyon" "Bağlantı yöntemi seçimi" alanında seçin. Sonra analizler için "Tamam"'ı tıklatın.

Pencerenin sol panelde "Çözümleme sonuçlarını" → "HCL" menüde sonuçları görüntüleyin. Isı haritası "Dosya" menüsünden "Resim Kaydet"'i tıklatarak dışa aktarın.

7. ifade biyotik ve abiyotik stres yanıt olarak profil oluşturma

1. İlgili yayınlar ve asma biyotik ve abiyotik stres araştıran çalışmalar elde edilen 6.1 GSE katılım kimliği olan adımları yineleyin. Örneğin, mantar patojen NimbleGen üzüm bütün-genom Mikroarray kullanarak Botrytis cinerea ile enfekte asma çilek transcriptome profil sağlayarak deneyler ile GSE Kımlığı GSE52586 göz olabilir. 6.1.1 ve 6.1.2 adımları yineleyin.
2. NCBI sıra okur Arşiv³⁴ SRA/BioProject kimlikli (örneğin, SRP055458 veya PRJNA275778 "grapevine çiçek gölgelendirme" deneyler için) ve ilişkili tüm ham sıra Okuma download. Birçok farklı çalışma Services'ten RNA-seq tutarlılık için tek bir ardışık düzeni kullanılarak işlenir.
   1. Kısaca, ham sıra FASTQ okuma (tek ve çift-uçlu) düzeltme ve kalite Trimmomatic³⁵filtre. Bir AVGQUAL ve MINLEN 20 ve 40, sırasıyla filtre kullanımı ve tüm parametreleri varsayılan.
   2. 12 X asma başvuru genom¹ Bowtie2³⁶kullanarak dizin. 12 X asma başvuru genom (örneğin, bowtie2-yapı) bowtie2 komutu çalıştırmadan önce indirin.
   3. Sayısı matris tablo asma V1 gen modeli ek açıklama (GFF/GTF) dosyası kullanarak htseq-sayısı³⁷ ile elde edilir.
3. R³⁸ limma³⁹ kitaplıklar için RMA normalleştirilmiş Matrisler ve DESeq2⁴⁰ kitaplıkları adım 7.1.1 ve 7.2.1, sırasıyla elde sayısı matris tablolar için ile fark gen ifade (re-) çözümlemesi gerçekleştirin.
   1. Standart bir "iki-grup" karşılaştırma gerçekleştirir (örneğin, "tedavi" / "kontrol"). Tasarım matrisi/gruplandırmalar "kontrol" ve "tedavi" koşulların doğru belirtildiğinden emin olun.
      Not: EL-33 çilek Botrytis cinerea ile denetim (sağlıklı) çilek karşı aynı geliştirme aşamasında komut satırları çalışan limma ile enfekte karşılaştırmak için tipik için bir tasarım Mikroarray fark ifade analizi (GSE52586) 13 ek dosya 1' de gösterilen. RNA-seq fark ifade analizi (SRP055458 veya PRJNA275778) çiçeklere (7 gün sonra kap-Güz) denetimin karşı gölge tedavi altında komut satırları 14 çalışan DESeq2 ile karşılaştırmak için için tipik bir tasarım ek dosya 1 gösterilir .
   2. Listeleri her aksine, limmaiçin differentially ifade genlerin (DEG) elde etmek, eBayes()tarafından takip işlevleri lmFit(), kullanın ve sonra topTable() işlevleri tarafından DESeq2iken için kullanın DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq()ve results() işlevleri. Takip edilmesi gereken normal bir iş akışı aşağıda.
      1. Mikroarray fark ifade analizi için bkz: komut satırları 15 (ek dosya 1). RNA-seq fark ifade analizi için bkz: komut satırları 16 (ek dosya 1). Farklı uygun tasarım şeması (bkz: örnekler adım 7.3.1) diğer tüm kontrastlı için yukarıdaki adımları tekrarlayın
4. Ayıklamak oluşturulan ağrıkesici listelerinden, ATL V1 katılım karşılık, log2 kat Değiştir (tedavi/denetim) içeren sütunlar korumak değil tüm satırları > | 0,5 | ve p-değerleri (FDR) < 0,05 ve birleştirme onları buna göre bir matrisi tabloya olup bir çalışma düşüyor "abiyotik" veya "biyotik/patojen etkileşim" compendia içine.
5. Hiyerarşik kümelenmiş heatmaps (abiyotik ve biyotik compendia) R gplotskütüphaneleri kullanarak oluşturun.
   Not: heatmap.2 işlevini çağırarak heatmap ilgili matris tablodan satır dendrograms birlikte oluşturur. Cellnote kullanarak ek bağımsız değişkenler işlev differentially ifade ayırmak için yardımcı olur (log2FC > 0.5, FDR < 0,05) deneysel koşullar tarafından büyük bir dizi genelinde her karşılaştırma ATL genlerinde bir * sembolü. R komut satırları 17 (ek dosya 1) çalışan tipik iş akışında uygular veya alternatif olarak, heatmaps MeV yazılımını kullanarak oluşturmak için 6.2.2 6.2.5 adımları yineleyin.

8. Paralogous sıra sapma ve ortak gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri analizi

1. İkili benzerlik içeren matris oluşturmak. Benzerlik matrisi değerleri sıra benzerlik ikili protein hizalamaları hesaplanan unsurlardır.
   1. KABARTMA iğne web sunucusu⁴¹ varsayılan ayarlarla ikili sıra hizalamaları yapmak ve metin dosyası olarak kaydetmek için kullanın. Çıkış metin dosyası açın ve "similarityTable.txt" adlı bir dosya oluşturmak için sütun ve satır adları ile birlikte tüm yorum satırları kaldırın.
      Not: Böyle bir tablo her ikili hizalama hesaplanan benzerlik değerler rapor her ATL gen için bir satır bulunur. Böylece bir simetrik matris diyagonal değerlerin saygı ile oluşturulan satırlar ve sütunlar loci sırasını aynıdır.
2. Ortak ifade veri matrisiyle Pearson korelasyon katsayısı hesaplanarak inşa. Aşağıdaki yordam R ve perl modülü PDL gerektirir.
   1. İfade değerleri komut satırları 18 (ek dosya 1) bir terminal içinde çalışan 96 ATL genler için indirin. Komut satırları 19 (ek dosya 1) çalıştırarak indirilebilir bir özel perl komut dosyası kullanarak bir ortak ifade çözümlemesi gerçekleştirin. Böyle script daha önce bildirilen ATL loci çiftleri arasındaki Pearson korelasyon katsayısını hesaplar.
   2. Komut satırları 20 (ek dosya 1) çalışan komut dosyası başlatın ve çıkış yönergeleri izleyin.

Komut dosyası (Bu sıralama şömine test çalıştırmak için aşağıya bakın esastır) adım 8.1 elde matris aynı locus adları sırasını içeren bir ortak ifade matris içeren bir çıktı dosyası (yani "coexpressionTable.txt") üretecek.

Bir şömine test adımları 8.1 ve 8.2 elde edilen veri matrisler arasında gerçekleştirin. ("R" dan bir terminal içinde koşmak buyurmak) R çevre girdikten sonra aşağıdaki komutu kullanarak ade4 kütüphane yük: library(ade4)

1. İki veri matrisler yükleme ve komut satırları 21 (ek dosya 1), çalışan istatistik "ile nrep permütasyonların sayısını temsil eden" şömine testi çalıştırın. Test bu matrisler unsurları arasında korelasyon hesaplama, matrisler permuting ve sonra da aynı test istatistikleri yeniden hesaplamak oluşur.
   Not: Elde edilen değerlerin istatistik testinin bir phesaplamakta kullanılan istatistik testinin bir başvuru dağıtım oluşturmak için kullanılan-önemi için test etmek için değer. Hangi hassasiyetle permütasyon sayısını tanımlayan p-değeri elde edilebilir.

Sonuçlar

En çok benzeyen A. thaliana ATL2 (At3g16720) BLASTp arama aracılığıyla kullanıldı olarak sonda asma genom ATL aile uyeleri anket için tanımlanan VIT_05s0077g01970 gen (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). Birkaç döngüleri sonra sözde genlerin asma ATL gen ailesine (şekil 1A) ait bir liste açığa PSI-BLAST analiz yakınsadı. Kurallı yüzük-H2 etki alanı her aday için varlığı kas diziliş analizi (ş...

Tartışmalar

Genomik dönemde, birçok gen aile derinden birkaç bitki türü karakterize. Bu bilgiler için ön fonksiyonel çalışmalar ve daha fazla bir ailenin farklı üyesi rolünü araştırmak için bir çerçeve sağlar. Bu bağlamda, bir adlandırma sistemi izin kaçınarak artıklık ve adları bağımsız olarak farklı genler için farklı araştırma gruplarınca atandığında ortaya çıkabilecek karışıklıklara bir aile, her üye benzersiz olarak tanıtmak için bir ihtiyaç da vardır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Personal computer
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)			https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA)			http://www.megasoftware.net/
Motif-based sequence analysis tools (MEME)			http://meme-suite.org/
Geneious	Biomatters Limited		http://www.geneious.com/
ProtParam Tool			http://web.expasy.org/protparam/
ngLOC			http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
TargetP v1.1 Server			http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
Protein Prowler			http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
MUsite			http://musite.sourceforge.net/
Pfam			http://pfam.xfam.org/
TMHMM Server v. 2.0			http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
ProtScale			http://web.expasy.org/protscale/
Grape Genome Database (CRIBI)			http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
PhenoGram			http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
MCScanX			http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
Interactive Tree Of Life (iTOL)			http://itol.embl.de/
UniProt			http://www.uniprot.org/
Phylogeny.fr			http://www.phylogeny.fr/index.cgi
MUSCLE			http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
Gblocks Server			http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix			https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_ datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
Multi Experiment Viewer (MeV)			http://mev.tm4.org/#/welcome
Sequence Read Archive (SRA)			https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
R			https://www.r-project.org/
EMBOSS Needle (EMBL-EBI)			http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/