JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר בפרוטוקולים ניסיוניים ללמוד שמחוץ התכווצויות של האדם myometrium ויישומם גילוי סמים. טכניקה זו משמשת כדי לשפר את ההבנה של פיזיולוגיה myometrial, פתופיזיולוגיה גם באשר לאמת נתונים תרופתי של הגששים מחקר חדשניים או סמים הפניות.

Abstract

גילוי ואפיון של תרכובות פרמצבטיות הרומן או הגששים הביוכימי מסתמכים על מערכות assay רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ועמיד. אנו מתארים שיטות למדידת שמחוץ myometrium contractility. Assay זה יכול לשמש כדי לחקור את הגורמים, מולקולות מעורב אפנון ההתכווצות myometrial וכדי לקבוע את מעשיהם סינאפסות או מעכבות, ומכאן שלהם פוטנציאל טיפולי בתוך vivo. ביופסיות מתקבלים מן הנשים שעברו קיסרי משלוח עם הסכמה מדעת. רצועות בסדר myometrium גזור, מקוטע, מחובר מתמר כוח בתוך אמבטיות איברים 1 מ"ל superfused עם תמיסת מלח פיזיולוגית פתרון ב 37 º C. רצועות לפתח צירים ספונטניים בתוך 2-3 h תחת מתח קבוע, נותרים יציבים במשך שעות רבות (> 6-אייץ '). גם יכול להיות מגורה רצועות חוזה כגון על ידי ההורמונים אנדוגני, אוקסיטוצין, וזופרסין, ואשר לגרום אפנון תלויי-ריכוז של התכווצות תדר, בכוח משך זמן, יותר דומים צירים צירים. לפיכך, השפעת סמים מוכרים ולא רומן מוביל יכול להיבדק על צירים ספונטניים, אגוניסט-induced.

פרוטוקול זה במיוחד פרטים איך assay זה יכול לשמש כדי לקבוע את העוצמה של סוכנים הרומן וידוע על ידי מדידת והשפעותיהם על פרמטרים שונים של התכווצות myometrial האנושית. אנו משתמשים אוקסיטוצין - ו V היריבים קולטן1a , atosiban ו- SR49059 כמו דוגמאות של תרכובות ידועות אשר לעכב אוקסיטוצין - ו וזופרסין-induced התכווצויות, להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשלים ולאמת תרופתי נתונים המתקבלים מבוססת תא מבחני לסייע פיתוח תרופות. ניתן גם לאפיין את ההשפעות של הרומן אגוניסטים לעומת אוקסיטוצין, וזופרסין. בעוד אנו את הדוגמה של אוקסיטוצין / מערכת וזופרסין, בשיטה זו ניתן גם המשמשות ללימוד אחרים הקולטנים, תעלות יונים זה לשחק תפקיד הרפיה כדי לקדם את ההבנה של האדם הפיזיולוגיה של הרחם, פתופיזיולוגיה להתכווצות הרחם.

Introduction

המטרה של גילוי תרופות היא לייצר הרומן, חזק, ואת ליגנדים סלקטיבי מאוד המניבות תגובה טיפולית על-ידי הפעלה או מעכבים הסלולר איתות המסלולים. פעולה זו דורשת מערכת assay המתאים בו לבדוק עופרת תרכובות עם תוצאות אמינים, חזקים, רלוונטי1. טכניקות תרופתי כגון איגוד קולטן ליגנד, מבחני פונקציונלי מעסיקים לעתים קרובות heterologous מערכות מבוססות תא, מהונדסים לקולטנים overexpress אשר אחרת לא יהיה נוכח2. בעוד שיטות אלה לספק תובנות בעלות ערך עבור הקולטן פרמקולוגיה ומנהל פיתוח תרופות מוקדם, הנתונים שהושגו שלא לשקף תרחיש אמיתי ויוו . לכן חשוב כי נתונים תרופתי מבחני מבוססת תא אומתו גם פיזיולוגית הרלוונטיים במודלים.

הרחם שריר חלק (myometrium) מהווה את שכבת שרירי הרחם האחראית על התכווצויות במהלך העבודה רושם ואת הרחם להתרחב ולספק את העובר3. התכווצות של myometrium היא ספונטנית; . זה לא דורש קלט הורמונלי או עצבני חוזה4. הצירים הם הביא על ידי דפולריזציה ספונטנית של קרום התא myometrial, מה שמוביל הפתיחה של המופעלים באמצעות מתח Ca2 +-ערוצי (ערוצים מסוג L), זרם של Ca2 + לתוך תא5. מתחמי סידן עם קלמודולין ומפעילה צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת אור קינאז, אשר בתורו phosphorylates צולבות הקישור חוטים שרירן ומאפשרת לחצות גשר למבנה מחזור עם אקטין והתכווצות. הרפיה לרוב מתווך על ידי דה-זירחון של צולבות הקישור חוטים שרירן מאת צולבות הקישור חוטים שרירן פוספטאז וירידה בריכוז Ca2 + דרך שלה שחול התא ו/או sequestering לתוך רשת sarcoplasmic (SR)5,6 ,7.

פותחו מספר שיטות ללמוד myometrial ותפקוד לקוי, אין ויוו פנימיים וחיצוניים tocography, קטטרים לחץ תוך רחמי, לדור של תאים טרנספורמציה או מונצחים ממוצא myometrial8 ,9,10,11,12. בעוד מערכות התרבות התא יכול לזהות אם חומר יכול לפעול ברמה התאית, רצועות של רקמות בתוך איבר אמבטיות יכול לשמש כלי למדידת תגובות פונקציונלי של כל הרקמות ריאגנטים תרופתי. האמבטיה איברים המסורתית היא בדרך כלל תא זכוכית מחוממת גדול אשר מסוגל להחזיק בין 5 ל-50 מ של תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS). רצועות בתוך התאים האלה גדולים דורשים בדרך כלל לערבב עם חמצן, כמויות גדולות של PSS. רצועות של רקמות גזור, מושעים בתוך תא הרחצה, מחובר מתמר כוח אשר מודד שינוי המתח, כמו למשל בזמן התכווצות. רצועות myometrium בני אדם והן בעלי חיים כולל, שפן13, העכבר14, עכברוש15, ארנב16ועוד17,18, שנוצלו על ידי מספר קבוצות מחקר לבחון שאלות רבות הנוגעות myometrial פיזיולוגיה, פתולוגיה, כולל לידות לידה מוקדמת ולא מתפקד. לדוגמה, רצועות myometrial שימשו כדי לזהות גורמים אשר לווסת, לשנות פעילות myogenic19,20,21, לקבוע אברון בפונקציה כגון ה SR22, וכן חוקרים מאפננים של יון ערוצי23,24,25,26, משאבות, מחליפי27 כדי לקבוע את תפקידם בפיזיולוגיה myometrial.

טכניקה זו שמחוץ מאפשר את ההערכה של ביצועים התכווצות של רקמות ההשפעה הישירה של סוכנים שונים על הפרמטרים של התכווצות כדי למדוד כולל התכווצות כוח (כוח), תדירות, משך זמן, כמו גם שילוב של ערכים אלה, כדי ליצור אינדקס של העבודה הכוללת לעשות (כלומר כוח אינטגרלי או אזור תחת העקומה, חאן אל). כפי ההכנה רצועת רקמה מבודדת מהווה מודל מסוג תא אחד או יותר, ניתן למדוד את התגובה הפיזיולוגית של כל רקמה. אמבט איברים ורצועת רקמות מבודד ולכן הם כלי שימושי במתן לגשר בין תא תרבות העבודה כל החיה /ויוו עבודה. לפיכך, בתחום גילוי תרופות, ההשפעות של סוכנים הרומן במונחים של סינאפסות שלהם (כלומר, מגרה) או מעכבות (קרי, הרפיה) פוטנציאליים ויוו יכול להיות הדוק יותר מוערך. טכניקה זו שימש בהצלחה בפיתוח של אוקסיטוצין - ו V1a-קולטן (OTR ו- V1aR) atosiban אנטגוניסט כסוכן טוקוליטיקה לעכב את צירי לידה מוקדמת, לעכב לידה לידה מוקדמת. במבחנה בדיקה של atosiban על רצועות myometrial מצא את היריב יכול להפחית באופן משמעותי את אוקסיטוצין (OT)-induced התכווצויות28,29,30. חשוב לציין מחקרים אלה עזר כדי לאמת את הערך translational של atosiban, שנוצר הנתונים הוכחה הרעיון צריך לקחת זה העברה של ניסויים קליניים31,32,33,34 . Atosiban הוא כעת בשימוש נרחב התרופה המקובלת לעכב את העבודה באירופה. דומה הוכחה הרעיון מחקרים בוצעו עבור carbetocin אנלוגי אוקסיטוצין להראות את הפוטנציאל הטיפולי במניעת לכתיבה דימום35,36,37. תרכובות אחרות עופרת בשלבי פיתוח עם זה וזמינותו כוללים retosiban (GSK221149A)38 , nolasiban (נתונים שלא פורסמו). שיטות אלה היו בשימוש גם בהצלחה כדי להשוות בין קבוצות המטופל39,40,41,42,43,44, 4546,,47 לבחון הבדלים אינטרה-מינים.

כאן נתאר את השימוש מבודד שמחוץ רצועות רקמות מן בהריון myometrium אנושי בתוך אמבטיות מחוייט איברים קטנים (1 מ"ל) כדי להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להשלים ולאמת נתונים תרופתי המתקבל מבחני מבוססת-תא . ביופסיות התקבלו בעיקר בנשים שעברו משלוח קיסרי (CS) בחירה מראש העבודה כפי הם הניתוח המתוכנן ויש ולכן הן קל יותר לתזמן אוסף ביופסיה, גישה נוחה myometrium, רקמות לא נחשפו לכל uterotonic ממריצים או מרפה לפני הניתוח. עם זאת, ניתן להשיג ביופסיות גם מנשים שעברו לא מתוכנן (חירום) CS משלוח בצירים מתן שיש מספיק זמן את מלא הסכמת המטופל. ביופסיות רוב מתקבלים במהלך הניתוח של המקטע הרחם התחתון באתר של הניתוח החתך, אולם זה גם אפשרי להשיג דגימות של48,קטע עליון49. בכמה מקרים שלאחר משלוח הנרתיק, אגרוף ביופסיות מן המיטה היפרדות גם הושגו50. עם זאת, זו לא הדרך המקובלת ביותר, כמות רקמת myometrial לאחזר הוא קטן. Non-בהריון myometrium ניתן להשיג מראש או בגיל הבלות נשים שעברו כריתת רחם תנאים הגינקולוגית שפיר. ביופסיה עובי מלאה היא הבדיקה הפתולוגית שלאחר שנדגמו, מתוך הקורפוס נמוך יותר מן הרחם, ומועבר myometrium מאמצע הקיר הרחם הימנעות משטחים serosal של רירית הרחם.

Protocol

אישור לוח ובטיחות סקירה מוסדיים, אתי המתאים עבור ניסויים ברקמות אנושיות חייב להיות במקום לפני עבודה עם כל ברקמות אנושיות. כל העבודה המתוארים במסמך זה התקבל אישור ועדת האתיקה מחקר מקומיים (איסט ליברפול, REC Ref 10/H1002/49) ולוחות מוסדיים סקירה של מחקר של מחלקת הפיתוח, ליברפול לנשים חולים אוניברסיטת ליברפול.

הערה: כל ביופסיות שמתואר פרוטוקול זה שהושג על נשים שעברו העבודה טרום משלוח CS בחירה בבית החולים של ליברפול נשים כל אישה נתן כתב הסכמה מדעת להשתתף.

1. פתרונות

  1. להכין קרבס ששונה תמיסת מלח פיזיולוגית פתרון (PSS) עם ההרכב הבא: 154 מ מ NaCl, 5.6 מ מ אשלגן כלורי, 1.2 מ מ MgSO4, גלוקוז 7.8 מ מ, 10.9 mM HEPES ו 2.0 מ מ CaCl2.
    הערה: אמצעי האחסון צריכה להיעשות נקבעת על פי מספר רקמות אמבטיות במבצע, קצב הזרימה של המערכת (1 מ"ל לדקה), ומהו אורך הניסוי כולל זמן equilibration, שטיפה.
  2. להתאים את ה-pH ל 7.4 באמצעות 4 M NaOH.

2. רקמת אמבט להגדיר

  1. מחממים המאגר מערכת אמבט רקמות ~ 45 מעלות תוך שימוש באמבט מים recirculating שוכן בגובה 55-60 ° C.
    הערה: מאגר המים בבסיס המנגנון הוא מחומם ל ~ 45 ° C, אשר לאחר מתן אפשרות להחלפת חום עם PSS ב לאורך צינור סחרור רצות, מבטיח PSS באמבטיה רקמות היא 37 מעלות צלזיוס. התאמה מסוימת לקביעת טמפרטורות עשוי להיות נחוץ כדי להבטיח הטמפרטורה של PSS באמבטיה רקמות מגיע ל- 37 מעלות צלזיוס. זה משתנה בהתאם המנגנון המשמש ולהגדיר זרימה המחירים.
  2. להחליף באופן ידני על כל הציוד הנדרש אחרים כולל מגבר, חדרי קירור והקפאה, מערכת הקלטה, פצעי לחץ.
  3. מקם כל שפופרת מזין ממברנות (שפופרת אחת לכל אמבטיה) סביב הגלילים של הראש משאבת סחרור. מאובטח עם התחנות שהגנו ועל -ידי הידוק מצלמות דחיסה ואת נעילת מקשי סביב הצינורות. מקום הפנויות של הצינורות ממברנות מזין לתוך מיכל 1 ליטר של PSS ולהתחיל את המשאבה כדי לאפשר את PSS perfuse ללא הרף אל המרחצאות רקמות.
  4. ודא שמשאבות שאיבה פועלים כהלכה כי הרמה של פתרון באמבטיה הוא קבוע כזה קצב הזרימה לתוך האמבט שווה שער של הסרת. יכול להיות מותאם לרמת PSS באמבטיה רקמות על-ידי מניפולציה העומק של הצינור היניקה באמבטיה באמצעות חימר של המעצב.
  5. לכייל מתמרים בכוח על-ידי הצבת משקל ידוע (שווה ערך ל 1 millinewton (mN, יחידת כוח)) על הקרס מתמר והקלטה של סטיה זוהה על ידי רכישת התוכנה.
    הערה: ערכי יכול להיות מותאם לתוכנה כך הערכים הקליט מומרות אוטומטית mN שלילת הצורך לבצע כל המרות נוספות במהלך ניתוח. כיול של כוח מתמרים חייב להתבצע לפני הרכבה רקמות.

3. רקמות והכנה ניתוח של רצועות

  1. לאסוף ביופסיות של myometrium האנושי בהריון (1 – 2 ס מ3) בפקולטה למדעי המחשב לאחר הלידה של התינוק ואת השליה. להשיג ביופסיות (אופייני) עובי מלא שבהם perimetrium (serosa החיצוני שכבה של הרחם) והן רותמי (השכבה הפנימית ביותר של הרחם) נוכחים. השתמש רק ברקמות myometrial (שריר מרכזי שכבה). ראה איור 1A-B.
    1. הסר רותמי (חיוני) ואת כל חסיד העוברי ריריות (אם קיים) כמו רקמות אלו ידועים כדי לייצר חומרים אשר יכולים לשנות myometrial contractility.
      הערה: בניתוח, דגימות ימוקם הנקס מאוזנת מלח פתרון (HBSS) או PSS טריים הינם המאוחסנים ב 4 º C. אידיאלי רקמות אמור לשמש בתוך 12-16 שעות של ניתוח, אולם מחקרים הראו לא לרעת כדי contractility לאחר 18 h של אוסף עם אחסון 4 ° C51. הפקדים המתאימים חייב להתבצע כדי לאשר את הכדאיות הרקמות ותפקוד לאחר אחסון ממושך ב 4 º C. הדגימות כאן לקוחים את הקצה העליון של הרחם קטע החתך התחתון ולא על קטע עליון. הקטעים העליון והתחתון של הרחם הוכחו חוזה באופן דומה48, ומכאן ביופסיות המקטע התחתון נחשבים להיות השתקפות טובה של קטע עליון myometrial פעילות.
  2. להכין את אזור הקרע ומכשירים הנדרשים כולל: ניתוח גדול מספריים, מספריים ויבתר Vannas קטנות, מלקחיים ויבתר שני, ניתוח סיכות ו קטעי רקמה אלומיניום, סביב הקרע מיקרוסקופ עם נייחים בעלת זום ההגדלה.
  3. המקום דגימת ביופסיה בצלחת לנתיחה ברור מבוסס על silastic (ראה טבלה של חומרים) מלא עם PSS ובזהירות להתמצא הביופסיה כך serosa ולקצה רותמי מזוהים איור 1B.
  4. השתמש סיכות כדי לאבטח את הביופסיה לבסיס של המנה. ודא שרקמת נשאר רטוב עם PSS לאורך כל התהליך לנתיחה.
  5. באופן ידני לעבור על מקור האור מיקרוסקופ ולבדוק את הרקמה תחת המיקרוסקופ בהגדלה x 10 כדי לזהות אזורים myometrium חינם של רקמת צלקת, serosa, רותמי כל חסיד העוברי ריריות אם קיים.
  6. לבצע עמום באמצעות ניתוח גדול מספריים כדי להפריד בין שתי שכבות הרקמות הסמוכות, חושף שני מטוסים או גליונות של שריר.
    הערה: לעיתים קרובות יותר קל למצוא כיס קטן בין שכבות רקמה כדי להתחיל את תהליך הפרידה, אך יש לנקוט כדי להימנע כלי שיט קטנים בקצה ביופסיה כפי שהם יכולים לטעות 'כיסים'.
  7. המקום לנתח סיכות על כל פינה של הרקמה לאבטח אותו. בדוק את הסדינים של שריר מחפש אזורים של שריר עם סיבי הפעלה במקביל.
    הערה: זיהוי האזור יכול להיות שנעזר בעקבות הכיוון של נימים קטנים פרפוזיה דרך הרקמות. עדין מושך בקצה רקמות גם יכול לעזור לזהות את הכיוון שבו נוסעים הסיבים.
  8. לחתוך רצועות של רקמות ~ 2 מ מ רחב x 8 מ מ ארוך x 1 מ"מ עובי צירים אופקיים מיושרים עם הכיוון של סיבי השריר באמצעות ניתוח קטן מספריים.
    הערה: חייבים להקפיד להחזיק רק את הרקמה שפת לחתוך הראשונית כדי למנוע נזק.
  9. חזור על התהליך לנתח את המספר. של רצועות הדרושים לניסוי.
  10. להצמיד לכל רצועת בשני הקצוות כדי ליישר ולאבטח למנה, מקפיד לא נגמר מתיחה הרקמה.
  11. לצרף קטעי רקמה אלומיניום בסוף כל כך הרקמה ביניהם היא ~ 5 מ מ, בזהירות לחתוך כל רקמות עודף (איור 1C).
  12. העברת מנה נקי מלא מוכן להרכבת PSS.

4. הרכבה של רקמות המרחצאות

  1. להעביר את הרצועות המרחצאות רקמות ניסיוני. לטעון את הרצועות אופקית ולא אנכית (כמו מרחצאות איברים מסורתי) (איור 2B).
  2. לצרף קצה אחד של כל רצועת קומיקס מאת הקליפ מתמר כוח, אשר מודד את ההתכווצות של רקמות, לעשוק השני כדי קבוע שניהם בתוך תא רקמות.
    הערה: הקיבולת של האמבטיה הרקמה הוא ~ 1 mL אשר גדול מספיק כדי להבטיח שהרצועות לחלוטין טובע באמבטיה.
  3. ודא הרצועות בבסיס של כל וו באמבטיה.
  4. פתח את תוכנת הקלטה על ידי לחיצה כפולה על סמל התוכנה.
  5. להתאים את ההקלטה לכל ערוץ כך זה בתצוגה בחלון של הערוץ.
  6. להתאים את סרגל ציר Y כדי לקרוא בין 0-10 V (שווה ערך ל- 0-10 mN פוסט כיול) על ידי לחיצה ימנית על ציר Y, בחירת 'קנה מידה', ואת הזנת ערכי מקסימום ומינימום של 0 ו-10, בהתאמה. בחר 'אישור'. חזור על כל ערוץ ההקלטה.
  7. הקש 'שיא' על התוכנה להתחיל ההקלטה בשידור חי.
    הערה: אם רצועות לא מאובטחים לבסיס של כל וו, הם יכול להחליק בזמן התכווצות אשר יופיע בתור 'חריץ' על ההקלטה. המתח קבוע ישתנה, לכן גלישה שלאחר התכווצויות עשויים להיות שונים.
  8. למתוח את הרקמה באמבטיה כל על-ידי הפעלת באופן ידני את micromanipulators מחובר כל מתמר. בצע את התנועה כלפי מעלה רקמות מקו על המסך, להמשיך להפנות את micromanipulators עד המתח בסיסית מגיע 0.2 גרם (mN ~ 2).
    הערה: הרקמה יתחיל מיד להרגע (שציין ירידת המתח בסיסית), בדרך כלל להגיע מתח קבוע של בין 0.5-1 mN. המתח הזה מוגדר מוטבה בשביל לרקמות רצועות בגודל זה בתנאי הניסוי שלנו. אם לרקמות אחרות בגודל כדי לשמש, זה חיוני כי מתח באורך המתאים היחסים חקירות מבוצעים כדי למטב את הכוח מנוחה כדי להחיל.
  9. לאפשר את הרקמות equilibrate עבור ~ 2 h עד צירים ספונטניים מתעוררות.
    הערה: העלאת קטן המתח בסיסית בדרך כלל נצפית והוא סימן טוב של רקמות הכדאיות, שזה יהיה כויץ.

5. מאתגר את הרקמה עם 40 מ מ אשלגן (K גבוה+)

  1. אם אין צירים ספונטניים התרחשה בעקבות h 2 של הרכבה, לאתגר את הרצועות עם פתרון מלח אשלגן גבוה שבו אשלגן הוא גבוה עד 40 מ"מ על ידי החלפת isosmotic של NaCl עבור אשלגן כלורי. עבור K גבוה+, להוסיף את הקוד הבא (במ מ): 119.6 NaCl, 40 אשלגן כלורי, 1.2 MgSO4, גלוקוז 7.8, 10.9 HEPES ו- 2.0 CaCl2.
    הערה: ב שריר חלק כגון myometrium, יישום של K גבוה+ גורם להתכווצות על-ידי בעקיפין פתיחת ערוצי סידן מתח המופעל המוביל זרם מקסימלי של Ca2 + לתוך רקמות התאים. K גבוה+ ולכן ניתן כאמצעי לבחון את מדד כללי של רקמות תקינות, כמו גם להשגת מידה של תגובת רקמות מקסימלי.
    1. למקם את צינור מזין האמבט רצועת שמפקפקים לתוך בקבוק מעבדה זכוכית המכילה K גבוה+ 1-2 דקות.
    2. להחזיר את צינור מזין המכיל של PSS.
    3. איפה תגובה גבוהה K+ מושגת, המשך ניטור רצועת לשעה נוספת. אם אין תגובה כויץ ל K גבוה+ או ללא פעילות ספונטנית elicited פוסט תגובה K+ גבוהה, למחוק את הרצועה.
      הערה: הנסיין גם צריך להיות מודע שטח מת (זמן לקח לפתרון להגיע לאמבטיה רקמות) ב לאורך צינור מזין לפני הערכת התגובה גבוהה K+. זה עשוי להימשך 2-3 דקות, תלוי קצב הזרימה.
    4. כדי להבטיח שטיפה מלאה של K גבוה+ מן הצינורות טורקי, מזין, אשר יכול להשפיע על תמרונים עוקבות, המתן עד צירים ספונטניים לחזור טרום משרעת K+ גבוהה לפני שתמשיך עוד יותר עם הניסוי.

6. בחינת השפעת תרכובות הרומן וידוע על ציר Myometrial

הערה: ניתן לבצע ניסויים כדי לבחון את ההשפעה של תרופות חדישות, ריאגנטים על תפקוד myometrial ספונטנית (איור 3A) או התכווצויות מגורה-אגוניסט (איור 3B-C). עבור אגוניסט מגורה צירים, וזופרסין בתנ ך או ארגינין (סמנכ ל) מתווסף של PSS לתת ריכוז של 0.5 ננומטר משמש לאורך כל הניסוי (איור 3B-C). הריכוז של OT מוטבה עבור assay זו כפי שהיא מספקת צירים אשר הם phasic של טבע40,52. ריכוזים של אגוניסטים גדול יותר מאשר זה יכול להוביל להתכווצויות (טוניק) לאורך זמן, מתמשכת (ראה שופט41,,44 , לדוגמאות) תחת ההשפעה של סוכנים שונים שקשה להעריך, את מסגרת הזמן ניסיוני צריך להתרחב במידה רבה גם להכיל משך מוגברת של צירים בודדים וצמצום שכיחות. בניסוי זה דוגמה, בתנ ך או סמנכ ל נוסף כדי לעורר צירים אז את האיבה OTR ידוע, היריבים1aR V, atosiban, SR49059, או על ידי תרכובת הרומן שלנו [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]), יכול להיות מוערך.

  1. להכין ריכוזי compound(s) הבדיקה ב PSS (עם או בלי 0.5 ננומטר OT/סמנכ ל) מדולל-מינימום של 1/1000 דילול, הבטחת מגוון רחב של ריכוזים כלולים כגון אלה לא מביאות לתגובה ריכוזי החורגות את מרבית תגובה.
  2. להכין ערכה המקבילה של דילולים הקשורות נפחים שווים של הרכב (למשל, דימתיל סולפוקסיד, acetonitrile או מים מזוקקים).
    הערה: לעתים קרובות הקלה ביותר להכין את הריכוז הגבוה ביותר, קרי, 10-6 מ' (מתוך מלאי של 10-3 מ') ולאחר מכן לבצע דילולים טורי לאורך לוגריתמי (למשל, 10-6–10-10 מ'). אמצעי האחסון להיות מוכן תלוי עבר זמנם של יישום, קצב הזרימה של המנגנון, מספר רצועות להיבדק, למשל, של יישום 25 דקות של ריאגנט קצב זרימה של 1 מ"ל/min, מינימום של 25 מ של כל הריכוז לכל רקמות אמבט הוא הנדרש הכדור לנסוע ליפול . אד.
  3. חלות הריכוז הראשון של תרכובת הרקמה על ידי הצבת לאורך צינור מזין על האמבטיה רקמה לתוך בקבוק מעבדה זכוכית המכיל הכימית-הריכוז הרצויה.
    הערה: זה צריך להיעשות לאחר בסיס יציב של צירים ספונטניים או OT/סמנכ לגירוי מושגת.
  4. החלת הפתרון בקרת רכב המתאים באותה דרך כדי אמבטיה השני.
  5. רשום את הזמן של היישום (כלומר, כאשר לאורך צינור מזין השתנה).
  6. חזור על התהליך עבור כל ריכוז על ידי הצבת ברצף לאורך צינור מזין לתוך הבקבוק מעבדה זכוכית המכילה ריכוז הבא בסדרה וחזור עד ריכוז כל הוחלו.
    היישום של ריכוז כל אחד יכול להיות בין 15 ל 30 דקות אבל צריך להיות עקבי בכל ריכוז חלה ובין ניסויים. אלה מעורבים בתנ ך או התכווצויות מגורה-סמנכ ל נוטים לדרוש את היישום תקופות ארוכות יותר (למשל, 25 דקות) על חשבון להפחתת תדירות התכווצות שנצפו תחת גירוי. ניסויים ראשוני כדי לקבוע את הזמן האופטימלי היישום יש לבצע מראש עם כל מגיב חדש הנבדקת.
  7. להחזיר את צינור מזין PSS (עם או בלי OT/סמנכ ל) כדי שטיפה.
  8. לחץ על 'עצור' כדי לסיים את ההקלטה בשידור חי. מיד לשמור את הנתונים לתיקייה מתאימה ולייצא גירסה בתור קובץ '.mat'.

7. ניתוח נתונים

הערה: לכידת נתונים, ניתוח יכול להתבצע על ידי מספר כלשהו של נתונים זמינים מסחרית רכישת חבילות תוכנה. לפרטים של התוכנה בשימוש פרוטוקול זה, ראה טבלה של חומרים . עבור הערכה מדויקת של חוסר פעילות, לכלול הפרמטרים של הצירים כדי למדוד: i) משרעת של התכווצות, ii) תדירות של התכווצות, iii) משך התכווצות, ואת כוח מרושע iv) אינטגרל (איור 4). כלומר כוח אינטגרלי הוא המקבילה לאזור תחת עקומת התכווצות ולכן אינדקס של העבודה הכוללת נעשה על ידי רצועת רקמה בזמן נתון. ניתן לנתח חלק או את כל הפרמטרים. מינימום, מומלץ כי כוח אינטגרלי מרושע, משרעת של התכווצות הם שנותחה53. בניסויים המתוארים כאן אנחנו נמדדים לשינויים משרעת של השטח מתחת לעקומה להתכווצות.

  1. יבא קובץ the.mat לתוך התוכנה ניתוח.
  2. התאם את העמודה המקביל לציר X כדי לשקף את הזמן ניסיוני, לוקח בחשבון את תדירות מרווח הדגימה. ניסויים נרשמות בדרך כלל ב-10 הרץ המתאים דגימות 10/s או דגימות 600/min.
  3. להתוות את הנתונים באמצעות גרף X-Y ויימר "מגרש | פונקצית ".
  4. הבסיס של התכווצות שימוש בפונקציה 'תרגם אנכי' על תוכנת אפס.
  5. בחר תקופה הפקד המתאים.
    הערה: זה פרק הזמן מיד לפני היישום של הריכוז הראשון של ריג'נט, אבל שווה המשך היישום של ריאגנט (איור 4A). למשל, אם היישום של תרופה X במשך 25 דקות, השתמש 25 דקות מקדים את היישום הראשון של תרופה X של הפקד.
  6. . קרא את ציר Y, להקליט את משרעת (כוח) של התכווצות בשיא מקסימום של כל ציר המתרחשים פרק זמן נבחר, לחשב ערך רשע.
  7. למדוד את משך הזמן של התכווצות ב-50% של העמודה המרבי הזאת על ידי קריאה את ציר ה-X-ההתחלה והסוף של כל ציר והקלטה של הערך הממוצע.
  8. לספור את מספר צירים המתרחשים מסגרת הזמן כדי ליצור ערך עבור התדירות.
  9. השתמש בפונקציה 'שילוב' כדי לחשב חאן (ביחידות שרירותי, א"א) עבור תקופת הזמן שנבחר.
    הערה: כדי להקליט חאן אל מדויק, זה חיוני כי הבסיס של הצירים מוגדרת לאפס על ציר Y.
  10. ברצף לעבור כל אחד הריכוזים ולהקליט את הפרמטרים השונים של התכווצות.
  11. להגדיר את הנתונים בפקד כ- 100%, אקספרס הערכים שהתקבלו תחת כל ריכוז של ריאגנט כאחוז זה לשלוט קרי, ערכי לגירוי להיות > 100% בזמן מנוחה אמור להיות < 100%.
    הערה: נירמול הנתונים בכיוון הזה צריך לאפשר למשתמש משווים תוצאות בין רצועות, טיפולי תרופתי.
  12. חזור עבור ניסוי, להעביר את המידע חבילה גרפי.

תוצאות

באמצעות מודל זה, התגובה שונים אגוניסטים של היריבים ההתכווצות וכן סוכני הרומן של פונקציה ידוע או לא ידוע ניתן לבדקם ולטפל לכמת. יכול להיות מחושב סטנדרטי תרופתי פרמטרים כגון EC50 וערכי50 IC ריאגנטים נמצאים בשימוש מגוון רחב של ריכוזים, למשל, 10-5–10-9 מ', נוספות להגדיל את ריכוז לאורך סרגל לוגריתמי.

אוקסיטוצין קולטן אנטגוניסט ניסויים ריכוז-תגובה
בניסוי זה, רצועות לזווג myometrium האנושי היו כמפורט לעיל, המוצגת באיור 1, רכוב על המרחצאות רקמות, כפי שהיא מתוארת באיור 2, גזורה רשאית equilibrate להפקת התכווצויות יציב של משרעת שווה, תדירות. רצועות נחשפו ואז אגוניסט OTR אנדוגני, בתנ ך (0.5 ננומטר) כדי לעורר צירים. לאחר תקופה של פעילות יציבים תחת OT (בדרך כלל 45 דקות), atosiban היה מוחל על רצועה אחת להגדיל את ריכוז לאורך לוגריתמי (10-9–10-6 מ'). רצועת השני נותר הכבושים לבדו כמו שליטה בזמן. ניתן לראות דוגמה של התגובה atosiban איור 5A. לוקחים את התכווצויות מיד לפני הריכוז הראשון של atosiban כפקד (100%), משרעת של חאן אל ריכוז כל חלה מחושב כפי שמוצג באיור4. לניסויים שליטה בזמן, נמדדה המקבילה-הזמן של תמרונים ניסיוני. הנתונים ואז שורטטו ולהכניסם עקומות באמצעות הפונקציה רגרסיה ליניארי בחבילת תוכנה גרפית (איור 5B-C). מבחינת חישוב ההשפעה המעכבת את, העוצמה היחסית של atosiban היה מחושב על ידי מדידת ה IC50 אשר הוא ריכוז גרימת חצי מקסימלי (50%) מעכבות התגובה. הדבר יכול להיעשות אגוניסטים או תכשירים של התכווצות. במקרה זה העוצמה של המתחם מחושבת על פי ה EC50 (ריכוז גורם חצי תגובה מופחתים מקסימלי).

חוקרים את התגובה של תרכובות הרומן ובדיקה שלהם סלקטיביות קולטן
השתמשנו מודל זה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של ex-vivo התכווצויות myometrial האנושי כדי לבחון את ההשפעה אויבת של תרכובת לאחרונה מסונתז, [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]) הצירים מגורה עם גם המבקר יליד1a R אגוניסט, סמנכ ל או אגוניסט OTR מקורית, בתנ ך. השתמשנו assay זו כדי לאמת את מידת הבררנות קולטן של INT [D-Arg8], אשר היה בעבר נקבע על ידי שיטות מבוססת תא תרופתי אנטגוניסט-V1aR אך לא את OTR54.

בניסוי זה, רצועות myometrial האנושי נחשפו סמנכ ל 0.5 ננומטר או OT 0.5 ננומטר עבור בסביבות 1 h כדי לעורר צירים כמוצג באיור 3, לפני הוספת INT [D-Arg8] מתחם הרומן שלנו להגדיל את ריכוז (איור 6A ו איור 6 ג). זה היה אז לעומת את זמינים מסחרית, הידוע V1aR אנטגוניסט, SR49059 (איור 6B). איור 6A מדגים ריכוז ירידות תלויים myometrial האנושי מגורה-סמנכ ל הצירים עם הגדלת ריכוזים של INT. [D-Arg8] הנתונים עבור משרעת של התכווצות, חאן אל ריכוז כל מסוכמות באיור 6Aii-iii. התוצאה דומה לזה המוצג עבור ריכוז הידוע V1aR המעכב, SR49059, המוצגת באיור 6Bi-iii. מידת הבררנות של INT [D-Arg8] לכיוון V1aR אבל לא לכיוון של OTR מומחש את העובדה כי INT [D-Arg8] עושה ירידה לא התכווצויות myometrial האנושי אשר עוררו עם אחרים (איור 6C) וגם משרעת חאן נשארו יציבים (איור 6Cii-iii).

figure-results-3608
איור 1: ניתוח ביופסיה myometrial אנושי. (א) A תרשים של הרחם האנושי מראה את רקמת שלוש שכבות המרכיבות את הרחם. השכבה הפנימית ביותר היא רירית הרחם (רותמי, הריון, האדום חץ), השכבה האמצעית היא myometrium (חץ שכבה שרירית, שחור) אשר מפיק התכווצויות, השכבה החיצונית ביותר היא perimetrium (או serosal ממברנה, חץ כחול) המהווה מעיל מגן סביב הרחם. האזור של הריבית עבור דגימה ביופסיה מתואר כמלבן שחור. ביופסיית דוגמה לאישה בהריון. שצולמו במהלך ניתוח קיסרי מוצג ב (B) עם רותמי, myometrial שכבות המסומן (serosa אינם גלויים). זה חיוני כי הרבדים רקמות שונות מזוהים כך רצועות של myometrium הם גזור כראוי לניסויים. רצועת דוגמה myometrium אשר היה גזור שנחתכו מוצג (C). בדרך כלל, 2-6 רצועות לחתוך, מקוטע כפי שמוצג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4663
איור 2: איברים רב אמבטיה ערכה ניסוי למעלה למדידת התכווצויות של האדם myometrium. (א) רצועות של myometrium ממוקמים בתוך איבר קטן (1 מ"ל) אמבטיה צ'יימברס הממוקמת מעל מאגר מחוממת (i), superfused עם תמיסת מלח פיזיולוגית פתרון (PSS) בדרך משאבת סחרור (ii). המאגר נשמר בטמפרטורה ערכה בדרך של אמבט מים מחזורי (iii). כל רצועת קומיקס מחובר מתמר כוח (iv), אשר רשומות שינויים המתח בזמן התכווצות. זה מוגבר על ידי מגבר transbridge (v), שהוסב שידור דיגיטלי (vi), אשר נרשם במערכת מחשב (vii) מפעיל את התוכנה רכישת המשויך. (B) מוגדל תמונה של חדר אמבטיה איברים עם רצועה של myometrium אנושי בחיי עיר (חץ אדום), טובל PSS בקצהו האחד מחובר מתמר כוח והשני לוו קבוע. (C) סקירה סכמטי של הגדרת. מלון תאי רקמת מלא PSS קיבלו את perfused ללא הרף עם PSS ומחוממת ב 37 ° C אשר היא באמצעות חילוף חום עם מאגר מים מחומם מתחת אל המרחצאות (שמרו ב 45 מעלות צלזיוס), משאבה מים במחזור להגדיר ב- 55 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-5920
איור 3: התכווצויות ספונטנית, מגורה-אגוניסט של האדם myometrium במבחנה. אגוניסט ללא תנאי, צירים ספונטניים נשארים יציבים במשך יותר מ-3 שעות של הקלטה ללא אובדן משמעותי של משרעת או אזור-תחת--עקומה (AUC) (הכל, וואייי), הממחיש את היציבות של מודל זה של חוקרים יישום של סוכנים שונים על ציר ספונטני. לאחר הקמת התכווצויות יציב, ספונטנית, 0.5 ננומטר אוקסיטוצין (B, OT) או וזופרסין (C, סמנכ ל) נוספה הפתרון תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS). התכווצויות תחת גירוי גם נותרים יציבים במשך מספר שעות ללא אובדן משמעותי של התכווצות משרעת (Bii, Cii) או חאן (ביל, Ciii) המאפשר את ההשפעה של סוכני כויץ שונים כדי להיות חקר בנוכחות אגוניסטים myometrial. הנתונים מוצגים רשע ± שגיאת התקן של הממוצע (SEM). הערה, על התכווצויות מגורה-אגוניסט (B, C), תקופת שליטה (100%) נלקחת לאחר את 45 min הראשון של יישום של אגוניסט, ברגע התכווצויות מיוצב. בכל המקרים, רצועות היו superfused עם PSS ב 37 מעלות צלזיוס, pH 7.4 (Reproduced מ. Arrowsmith et al. 40 באישור מדעי הרבייה ואת Di Giglio. et al. 54 באישור דו חות מדעיים תחת רישיון יצירתי משותף גישה פתוחה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7503
איור 4: ניתוח נתונים. (א) תקופה הפקד המתאים מוצגים בצבע אדום נקבע על-ידי בחירת הצירים מיד לפני היישום של המתחם מבחן (תרופה X). תקופה זו שליטה הוא גם שווה בזמן היישום של סמים X (לדוגמה, 40 דקות בדוגמה זו). ברגע נמדדו הערכים עבור תקופת שליטה מוגדרים כ- 100%. כל המדידות עוקבות מבוטא ואז אחוז של שליטה. (B) ישנם 4 פרמטרים שונים של התכווצות שניתן למדידה: (i) משרעת ההתכווצות אשר מודד את עוצמת התכווצות (כוח, mN), (ii) בתדירות של התכווצות אשר מודד את שיעור ההתכווצות, (iii) משך הזמן של ציר אשר נמדד בשיא מקסימלי חצי של התכווצות, ואזור (iv) מתחת העקומה (הידוע גם בשם כוח אינטגרלי, שרירותי יחידות) אשר נותן מדד של העבודה הכוללת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-8496
איור 5: הקלטה ההשפעה אויבת של atosiban על התכווצויות אוקסיטוצין-induced myometrium אנושי. ברגע צירים ספונטניים הוקמו, הצירים היו מגורה עם אגוניסט לקולטן אוקסיטוצין, אוקסיטוצין (OT). התכווצויות הורשו לייצב תחת גירוי נוסף 45 דקות (A) של V1a , אנטגוניסט OT, atosiban הוחל ואז להגדיל את ריכוז לאורך לוגריתמי (10-9-10-5מ'). . הצירים במהלך התקופה שקדמה הריכוז הראשון של atosiban נמדדו ונלקחו כפקד (100%). הפעילות תחת כל הריכוז עוקבות נמדדים, המבוטא באחוזים של שליטה. הדבר בוצע עבור רצועות נחשפים OT לבד תוך שימוש הזמן-שווה ערך של תמרונים ניסיוני. היו להתוות נתונים בתוכנה גרפית: (B, C) להראות עקומות הריכוז-תגובה עבור האפקט אויבת של atosiban (כחול) המתאים דילול של הרכב (אפור, בקרת זמן) על myometrial OT-induced התכווצות משרעת ו השטח מתחת לעקומה (AUC), בהתאמה. הנתונים מוצגים כמו השגיאה הסטנדרטית זאת אומרת ± של האחוז אומר (SEM) של משרעת וחאן אל פעילות הבקרה (לפני היישום של atosiban). IC50 ערכים חושבו ואז לתת הריכוז בו חצי מקסימלי מעכבות (50%) התגובה עבור משרעת של אינטגרל הכוח (AUC) להתכווצות היא מושגת (Reproduced מ. Arrowsmith et al. 40 באישור מדעי הרבייה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-10000
איור 6: בוחן את מידת הבררנות אפקט של קולטן של רומן מורכב על ציר אנושי myometrial. לאחר התכווצויות ספונטנית של האדם myometrium הוקמו, הצירים היו מגורה עם אגוניסט קולטני וזופרסין, וזופרסין (סמנכ ל) (Ai, Bi) או אגוניסט לקולטן אוקסיטוצין, אוקסיטוצין (OT) (Ci). השפעת [D-Arg8]-inotocin (INT [D-Arg8]), אנטגוניסט1aR V זמינים מסחרית, SR49059 הצירים מגורה על ידי סמנכ ל הוערך על-ידי החלת הגדלת ריכוזים של תרכובות. תגובות טיפוסיות מוצגים (Ai, Bi). המשויך ניתחו נתונים עבור משרעת ואזור מתחת העקומה (AUC) מוצגות באיור (ii) ו- (iii), בהתאמה שבו ההשפעה מתבטאת כאחוז של בקרת פעילות (100%). [D-Arg8] INT וגם את אנטגוניסט1aR V הידוע, SR49059 גרמה המינון תלוי ירידה משרעת חאן, לתמוך את התפקיד של INT [D-Arg8] כמו אנטגוניסט1aR V myometrium אנושי. לעומת זאת, INT [D-Arg8] לא השפיע על התכווצויות מגורה על ידי OT (Ci-iii), ומכאן באופן דומה על הממצאים שלנו מהתא המבוסס על מבחני, INT [D-Arg8] גם מראה סלקטיביות לעבר V1aR ב- myometrium אנושי (נתונים לשכפל מ Di Giglio. et al. 54 באישור דו חות מדעיים תחת רישיון יצירתי משותף גישה פתוחה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

בעוד רוב פיתוח תרופות מיועד לטיפול בהפרעות אנושי, מחקר בסיסי ביותר מתבצע בעיקר ברקמות בעלי חיים. כאן, אנו מתארים שיטות לחקור שמחוץ התכווצויות של האנושי myometrium המתקבל ניתוח בו ניתן להשתמש כדי לטפל מספר שאלות חשובות הקשורות הרחם פיזיולוגיה, פתולוגיה, כמו גם כדי לאמת את התגובות פונקציונלי הרומן וידוע סוכנים תרופתי לסיוע פיתוח תרופות. בפרט, אנחנו להדגיש את השימוש הזה assay לחקור את התגובה אויבת של ידוע OTR ו- V1aR אנטגוניסט תחרותי, atosiban הצירים הכבושים-induced myometrial בהריון, וכן לקבוע את התגובה ואת קולטן סלקטיביות של פיתח סלקטיבי V1aR אנטגוניסט, INT. [D-Arg8] נדגים כי יכול להיות מחושב פרמוקוקינטיים פרמטרים חשובים כגון EC50 ו- IC50 , אשר ליישר עם הנתונים מבוססת תא פרמקולוגיה.

באמצעות רצועות מרובות בו זמנית מאפשרת השוואה ישירה של הסוכן אפקטים מרובים, תחרות ניסויים עם היריבים, הזמן המתאים בקרות הרכב. כפי רצועות מוכנות לעיתים קרובות בקבוצות של 2, 4 או 8, טכניקה זו מספק תפוקה בינונית, המאפשרת בדיקה של תרכובות 2 – 4 בריכוזים (מצטבר) 6-8 (לפי ביופסיה). שיטה זו מספקת גם נתוני זמן-אמת כך יכול וצריך להעריך את ההשפעות במהירות ולא ניתן להתאים פרוטוקולים. בנוסף, טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק את כל המתחם של עניין, שימש בהצלחה על ידי מספר קבוצות מחקר ממוקד על הפיזיולוגיה myometrial, גילוי סמים. מלבד ניתוח תרכובות טהור כמתואר במאמר זה, המודל contractility הרחם היה גם, יכול להיות מנוצל בהצלחה על המסך עבור תרכובות הרומן uterotonic תערובות, כגון ההכנות צמחים רפואה מסורתית7 , 55 , 56.

אף על פי מודל זה היא טכנית חזקה ומראה הפארמצבטית טוב, יש כמה מגבלות: ניתוח יכול להיות קשה עבור אלה מכיר הרקמה או באמצעות ניתוח ציוד, ולכן משתמשים חדשים ידרוש קצת זמן כדי למטב את רקמת הכנה ופרוטוקולים. יש גם לציין ש-myometrium האנושי הזה שונה משמעותית של המראה של דגמים אחרים כגון עכבר ועכבר. רוב uteri מכרסם מורכבים שני קרניים הרחם כמו שפופרת, אחד להשלים עם שחלה בקצה אחד, שמחוברים צוואר הרחם. לכל קרן יש מוגדרים בבירור שכבות שריר אורכי, מעגלית, אשר ניתן להפריד בקלות על הקרע בזמן סוגי סיבים שונים ב myometrium האדם לעיתים קרובות שלובים זה בזה ויוצרים 'רשת'. בנוסף, פרופילים התכווצות של myometrium אנושיים שונים מאוד יחסית. בעיקר, התכווצויות בשריר myometrium האנושי הם פחות תכופים אך יותר משך. ניסיוני מסגרות זמן לעבודה עם myometrium האנושית ולכן הם לעיתים קרובות הרבה יותר מאשר הדגמים מכרסמים. הבדלים בביטוי קולטן בין המינים יכול לתרום גם די קיימים הבדלים התגובות אגוניסטים, זה צריך לזכור אם חיוץ תוצאות על פני מינים.

יש גם מספר שלבים צריך שיקול דעת כדי למקסם את פלט ממערכת זו. שלבים קריטיים כוללים שימור רקמות הכדאיות כגון מטפל בעת טיפול רקמות למנוע נזק מיותר במהלך ניתוח או בעת טעינה. בלש מיומן נדרש לנתח רצועות בסדר של שריר הרחם, להבטיח הכיוון של סיבי השריר כיוון האורך, אחרי המטוס של הרקמה, כמו גם הימנעות רקמות צלקת רותמי, כלי שיט קטנים. כדי לסייע למטרות התמצאות, ברגע הדגימה במעבדה, זה אפשרי להוסיף תגית (כגון תפר כירורגי קטן) בזמנו של אוסף לצד אחד של הביופסיה על הקצה serosal מהקצה decidual.

יש לשמור רקמות ב יציב 36 – 37 מעלות צלזיוס במהלך ניסויים כמו תפקוד הרקמות כפוף תנודות הטמפרטורה. זו יכולה להיות מושגת עם יחידת מיזוג אוויר חזקים בתוך המעבדה. זלוף מתמדת של PSS ומחוממת מבטיחה שהטמפרטורה נשמרת כמו הסמקה מתוך הפסולת של התכווצות. הטמפרטורה בתוך המרחצאות איבר יכול להשתנות על ידי שינוי קצב הזרימה או התאמת הטמפרטורה אמבט מים ישירות. גודל חדר אמבטיה קטן בהשוואה המסורתית 5-50 מ"ל אמבטיות מבטיחה מחזור מהירה יחסית של PSS. הכשלון של ריאגנטים. האמבטיה איברים ולמחקר כפי שמתואר כאן, גם מפחית את עוצמת הקול של PSS ריאגנטים של עניין הצורך, ובכך לחסוך עלויות, ממעט היקר, מחדש פיתח כימיקלים. בנוסף, בשל גודל חדר אמבטיה קטן ושימוש מאגר מבוסס-HEPES, מערכת זו אינה דורשת חמצון למשל, על ידי בעבוע של PSS עם carbogen. סטנדרטיזציה של מתח להחיל את הרצועות חשוב גם. עבור רצועות בגודל כזה (5 מ מ x 2 מ"מ x 1 מ"מ), זה צריך להיות בערך 2 mN (שווה ערך ל ~0.2 גרם). שיטות אלטרנטיביות לכלול יישום של פתרון אשלגן גבוהה לזירוז התכווצות מירבית ומתיחה מחצית זו התכווצות מירבית. יש לציין עם זאת, כי המתח חלה ויוו עשויים להשתנות.

האתגרים העיקריים כוללים קבלת רקמות מן הנבדקים אנושי, אבל למרות מפרכת, ברקמות אנושיות המייצגים באופן מובהק ביותר מבחינה פיזיולוגית דגם הרלוונטיים (ומתגמלת) ללמוד התכווצות הרחם גילוי סמים ומחלת אנושי. הרקמה מבודד רצועות עם זאת, לא בהכרח להשוות רקמות ויוו כפי שהם פטורים לדוגמה, של הורמונלי עצבני קלט, אמנם לא חיוני להתכווצות, לווסת את הצירים בתוך vivo. זה וזמינותו עם זאת מספק את ההזדמנות כדי לנתח myometrial צירים בצורה מבוקרת, מופרדים מהשפעות כאלה. זה גם מאפשר ההשפעה של גורמים כגון בקרה הורמונלית של התכווצות (למשל, באמצעות OT, סמנכ ל, פרוסטגלנדינים, וכו ') להיחקר, מתן רמזים ברגולציה של פונקציה myometrial. ככל רקמות מתקבלים מן נשים שונות, יש באופן טבעי גיוון בפרופילי כויץ ספונטני בין דגימות. ומכאן יש לעיתים קרובות צורך לבצע ניסויים על מספר גדול (~ n = 10) דוגמאות כדי למזער את הווריאציה כמה נתונים (datasets)53. הדבר חשוב ביותר בעת השוואת פעילות כויץ בין קבוצות שונות החולה. נרמול התגובה של אגוניסטים היריבים כדי לשלוט פעילות (כלומר, ביטוי כאחוז של פעילות שליטה או גבוהה K+) מפחית חלק וריאציה זו. בנוסף, כדי לצמצם את הווריאציה של inter-סטריפ, יכול מנורמל נתונים להתפשט שטח חתך צלב על ידי מדידת שלהם אורך ומשקל פוסט ניסויים41. פעולה זו שימושית במיוחד בעת השוואת דפוסי התכווצות בין קבוצות שונות החולה.

מגבלות של טכניקה זו כוללים גם גישה אל רקמות טריים אשר דורשת קשרים עסקיים טובים עם צוות בית החולים, צוות תיאטרון במיוחד, אלה המעורבים התהליך הסכמתך. הרשאות האתית של ועדת הבדיקה המקומית, ועדת האתיקה מחקר ו המכון או חולים גם צריכים להיות במקום. אוסף של האדם myometrium סביר לביצוע במהלך הלידה CS, כאשר התורם עובר ניתוח. הביופסיה שנלקחו באותו אתר החתך הרחם עבור מסירת התינוק, ולכן המטופל לא צריך לעבור כל הליכים נוספים בהמשך. צוות תיאטרון, המנתח מבצע הביופסיה צריך להיות מודע לשימוש עוקבות של הרקמות וזה שהם לא ניתן להציב לתוך מקבע פתרונות כאלה לגבי שליחת המחלקה לפתולוגיה. פרק זמן ארוך ניסיוני הוא שיקול נוסף. ניסויים ברקמות אנושיות לארוך מספר שעות (בדרך כלל > 6-אייץ ') (לעומת 2-3 h עבור ניסוי דומה ברחם חולדה או עכבר), בשל תדירות איטית יותר של כווץ את זמן ההשהיה של 2-3 h בין רקמות וביטול הקמת ספונטנית התכווצויות. עם זאת, כפי שהראתי, רקמה אנושית הצירים חזקים, כאשר הוקמה יכולים לפעול במשך שעות רבות ללא עייפות משמעותית40.

מערכת זו מאפשרת גם אתגרים נוספים ויוו עבודה להתגבר כולל היכולת לבחון ריאגנטים התרופות על רקמות בהריון. טכניקה זו יכולה להיות אומדן בקלות למינים אחרים כולל העכבר לפיה אפשר לאמת תוצאות ראשוניות לפני שתמשיך נוסף במחקרים שנעשו בבעלי חיים שלם. מבוקר טמפרטורה, ההרכב של superfusate (PSS), ו- pH ניתן לבצע שינויים בקלות לחקות תרחישים שונים ויוו ולנתח את ההשפעה של שינויים אלה על התנהגות מורכבים. העקרונות הבסיסיים של מדידת מתיחות איזומטריות ברצועות myometrial ניתן גם להרחיב מדידת שינויים שמתבצעים ריכוז הסידן תאיים או pH על ידי השימוש של Ca פלורסנט או אינדיקטורים pH (H.+) וציוד לאתר, שיא פלורסצנטיות57,58,59,60.

בסך הכל, האדם myometrium מייצג מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ועמיד לאפיין ולאימות תרכובות הרומן טיפולית גילוי סמים – תרכובות טהורים ותערובות. יש מספק דוגמאות של השימוש בו גילוי תרופות ביחס למערכת OT/סמנכ ל ואנו התמקדו OTR, V1R היריבים כדי להראות כיצד מודל זה יכול לשמש כדי לקבוע יעילות מתחם ואת עוצמת לעבר מטרות מוגדרות ולאמת ליגנד סלקטיביות. עם זאת, זה כדאי לזכור כי טכניקה זו ניתן ללמוד כל מטרה מעניינים או שביל שמוביל להתכווצות myometrial (או הרפיה), כמו גם לסייע סמים גילוי מטרות חדשות מסלולים, לקדם את ההבנה שלנו של myometrial פיזיולוגיה, פתופיזיולוגיה.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

מחקר זה בתמיכתם את האוסטרי המדע קרן (FWF) דרך פרוייקט I3243, האירופית מחקר המועצה (ERC) תחת המחקר של האיחוד האירופי אופק 2020 ולהעניק והחדשנות (הסכם לא 714366). Cwg ב נתמכו על-ידי מלגת העתיד של מועצת המחקר האוסטרלי (ARC) (FT140100730) ובאמצעות מ"מ של אחוות ARC גילוי מוקדם בקריירה חוקר (DECRA) (DE150100784). SA נתמך על ידי האריס-רווחה לידה מוקדמת לידה מרכז במענק המחקר מנוהל על ידי רווחתם של נשים, בריטניה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Origin softwareOrigin Lab2015 version
Labscribe SoftwareWPIFormally Datatrax
GraphPad Prism graphical softwareGraphPad PrismPRISM 5
LabTrax 4-Channel Data AcquisitionWPILAB-TRAX-4
Transbridge Transducer AmplifierWPISYS-TBM4M
Force-displacement TransducerWPIFORT10g10 g
BNC to BNC CableWPI500184
Magnetic Clamp standWPIM10
MicrometerReconditioned from microscopes
Peristaltic pumpGilsonMINIPULS3R4 Standard pump head
Suction pumpsVariousAP2 air pump
Circulating Water bathGrant InstrumentsTC1205L
Perspex Tissue BathCustom made
Water reservoir containerthe reallyusefulbox7L
Tissue Hooks (fixed)Hand made in house
Peristaltic tubingGilsonF117948PVC 2.79 mm internal diameter
Tygon TubingFisher Scientificvarious diametersR-3603
Aluminium clipsLaser services, USAcustom made
Stereo Zoom binocular microscopeWPIPZMIV
Microscope Fiber-optic Light SourceWPIPHOTONIC PL 2000
Dissecting DishesHandmade with Sylgard
Sylgard Silicone Elastomer kitDow CorningSylgard 170 Kit
Vannas ScissorsWPI500868.5 cm, straight edge
Iris ForcepsWPI1591410 cm, straight edge (serrated)
Dissecting scissorsWPI1439310 cm, straight
Dissecting pinsSIGMAZ192341B-D precision guide syringe needle 30G
HBSSSIGMAH9269
Physiological Salt SolutionSIGMAvariousPSS
Oxytocin acetate saltSIGMAO6379
[Arg8]-vasopressin acetate saltSIGMAV9879

References

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398 (1), 227-238 (2010).
  3. Wray, S. Insights into the uterus. Exp Physiol. 92 (4), 621-631 (2007).
  4. Wray, S., Kupittayanant, S., Shmygol, A., Smith, R. D., Burdyga, T. The physiological basis of uterine contractility: a short review. Exp Physiol. 86 (2), 239-246 (2001).
  5. Matthew, A., Shmygol, A., Wray, S. Ca2+ entry, efflux and release in smooth muscle. Biol Res. 37 (4), 617-624 (2004).
  6. Wray, S., et al. Calcium signaling and uterine contractility. J Soc Gynecol Investig. 10 (5), 252-264 (2003).
  7. Gruber, C. W., O'Brien, M. Uterotonic plants and their bioactive constituents. Planta medica. 77 (3), 207-220 (2011).
  8. Maul, H., Maner, W. L., Olson, G., Saade, G. R., Garfield, R. E. Non-invasive transabdominal uterine electromyography correlates with the strength of intrauterine pressure and is predictive of labor and delivery. J Matern Fetal Neonatal Med. 15 (5), 297-301 (2004).
  9. Newman, R. B. Uterine contraction assessment. Obstet Gynecol Clin North Am. 32 (3), 341-367 (2005).
  10. Haran, G., Elbaz, M., Fejgin, M. D., Biron-Shental, T. A comparison of surface acquired uterine electromyography and intrauterine pressure catheter to assess uterine activity. Am J Obstet Gynecol. 206 (5), 412-e415 (2012).
  11. Condon, J., et al. Telomerase immortalization of human myometrial cells. Biol Reprod. 67 (2), 506-514 (2002).
  12. Soloff, M. S., et al. Immortalization and characterization of human myometrial cells from term-pregnant patients using a telomerase expression vector. Mol Hum Reprod. 10 (9), 685-695 (2004).
  13. Buxton, I. L., Vittori, J. C. Cholesterol depletion enhances both spontaneous and agonist-evoked uterine smooth muscle contractions in a reversible manner. Proc West Pharmacol Soc. 48, 126-128 (2005).
  14. Matthew, A., Kupittayanant, S., Burdyga, T., Wray, S. Characterization of contractile activity and intracellular Ca2+ signalling in mouse myometrium. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 11 (4), 207-212 (2004).
  15. Heaton, R. C., Taggart, M. J., Wray, S. The effects of intracellular and extracellular alkalinization on contractions of the isolated rat uterus. Pflugers Arch. 422 (1), 24-30 (1992).
  16. Hutchings, G., Deprest, J., Nilius, B., Roskams, T., De Ridder, D. The effect of imatinib mesylate on the contractility of isolated rabbit myometrial strips. Gynecol Obstet Invest. 62 (2), 79-83 (2006).
  17. Wilson, R. J., Allen, M. J., Nandi, M., Giles, H., Thornton, S. Spontaneous contractions of myometrium from humans, non-human primate and rodents are sensitive to selective oxytocin receptor antagonism in vitro. BJOG. 108 (9), 960-966 (2001).
  18. Choudhury, S., Garg, S. K., Singh, T. U., Mishra, S. K. Functional and molecular characterization of maxi K+ -channels (BK(Ca)) in buffalo myometrium. Anim Reprod Sci. 126 (3-4), 173-178 (2011).
  19. Smith, R. C., McClure, M. C., Smith, M. A., Abel, P. W., Bradley, M. E. The role of voltage-gated potassium channels in the regulation of mouse uterine contractility. Reprod Biol Endocrinol. 5, 41 (2007).
  20. Jones, K., Shmygol, A., Kupittayanant, S., Wray, S. Electrophysiological characterization and functional importance of calcium-activated chloride channel in rat uterine myocytes. Pflugers Arch. 448 (1), 36-43 (2004).
  21. Popescu, L. M., et al. Imatinib inhibits spontaneous rhythmic contractions of human uterus and intestine. Eur J Pharmacol. 546 (1-3), 177-181 (2006).
  22. Taggart, M. J., Wray, S. Contribution of sarcoplasmic reticular calcium to smooth muscle contractile activation: gestational dependence in isolated rat uterus. J Physiol. 511 (Pt 1), 133-144 (1998).
  23. McCallum, L. A., Pierce, S. L., England, S. K., Greenwood, I. A., Tribe, R. M. The contribution of Kv7 channels to pregnant mouse and human myometrial contractility. J Cell Mol Med. 15 (3), 577-586 (2011).
  24. Bernstein, K., et al. Calcium-activated chloride channels anoctamin 1 and 2 promote murine uterine smooth muscle contractility. Am J Obstet Gynecol. , (2014).
  25. Khan, R. N., Morrison, J. J., Smith, S. K., Ashford, M. L. Activation of large-conductance potassium channels in pregnant human myometrium by pinacidil. Am J Obstet Gynecol. 178 (5), 1027-1034 (1998).
  26. Phillippe, M., Basa, A. Effects of sodium and calcium channel blockade on cytosolic calcium oscillations and phasic contractions of myometrial tissue. J Soc Gynecol Investig. 4 (2), 72-77 (1997).
  27. Ausina, P., et al. Effect of inhibition of the electrogenic Na+/K+ pump on the mechanical activity in the rat uterus. Fundam Clin Pharmacol. 10 (1), 38-46 (1996).
  28. Melin, P., Trojnar, J., Johansson, B., Vilhardt, H., Akerlund, M. Synthetic antagonists of the myometrial response to vasopressin and oxytocin. J Endocrinol. 111 (1), 125-131 (1986).
  29. Hahn, D. W., et al. Evaluation of 1-deamino-[D-Tyr(Oethyl)2, Thr4, Orn8] vasotocin, an oxytocin antagonist, in animal models of uterine contractility and preterm labor: a new tocolytic agent. Am J Obstet Gynecol. 157 (4 Pt 1), 977-982 (1987).
  30. Demarest, K. T., et al. Profile of an oxytocin antagonist, RWJ 22164 for treatment of preterm labor in laboratory models of uterine contractility. American journal of perinatology. 6 (2), 200-204 (1989).
  31. Goodwin, T. M., et al. The pharmacokinetics of the oxytocin antagonist atosiban in pregnant women with preterm uterine contractions. Am J Obstet Gynecol. 173 (3 Pt 1), 913-917 (1995).
  32. Goodwin, T. M., et al. The effect of the oxytocin antagonist atosiban on preterm uterine activity in the human. Am J Obstet Gynecol. 170 (2), 474-478 (1994).
  33. Goodwin, T. M., et al. Treatment of preterm labor with the oxytocin antagonist atosiban. American journal of perinatology. 13 (3), 143-146 (1996).
  34. Romero, R., et al. An oxytocin receptor antagonist (atosiban) in the treatment of preterm labor: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial with tocolytic rescue. Am J Obstet Gynecol. 182 (5), 1173-1183 (2000).
  35. Norstrom, A., Andersson, A., Vilhardt, H. Contractile effect of oxytocin and 1-deamino-1-carba-2-tyrosine (0-methyl)-oxytocin in myometrial tissue from non-pregnant and term pregnant women. Acta Endocrinol (Copenh). 122 (5), 566-568 (1990).
  36. Atke, A., Vilhardt, H. Uterotonic activity and myometrial receptor affinity of 1-deamino-1-carba-2-tyrosine(O-methyl)-oxytocin. Acta Endocrinol (Copenh). 115 (1), 155-160 (1987).
  37. Hunter, D. J., Schulz, P., Wassenaar, W. Effect of carbetocin, a long-acting oxytocin analog on the postpartum uterus. Clin Pharmacol Ther. 52 (1), 60-67 (1992).
  38. Moraitis, A. A., Cordeaux, Y., Charnock-Jones, D. S., Smith, G. C. The Effect of an Oxytocin Receptor Antagonist (Retosiban, GSK221149A) on the Response of Human Myometrial Explants to Prolonged Mechanical Stretch. Endocrinology. 156 (10), 3511-3516 (2015).
  39. Al-Qahtani, S., et al. Diabetes is associated with impairment of uterine contractility and high Caesarean section rate. Diabetologia. 55 (2), 489-498 (2012).
  40. Arrowsmith, S., Neilson, J., Bricker, L., Wray, S. Differing In Vitro Potencies of Tocolytics and Progesterone in Myometrium From Singleton and Twin Pregnancies. Reprod Sci. 23 (1), 98-111 (2016).
  41. Arrowsmith, S., Quenby, S., Weeks, A., Burdyga, T., Wray, S. Poor spontaneous and oxytocin-stimulated contractility in human myometrium from postdates pregnancies. PloS one. 7 (5), e36787 (2012).
  42. Arrowsmith, S., Robinson, H., Noble, K., Wray, S. What do we know about what happens to myometrial function as women age?. J Muscle Res Cell Motil. 33 (3-4), 209-217 (2012).
  43. Quenby, S., Matthew, A., Zhang, J., Dawood, F., Wray, S. In vitro myometrial contractility reflects indication for caesarean section. BJOG. 118 (12), 1499-1506 (2011).
  44. Turton, P., et al. A comparison of the contractile properties of myometrium from singleton and twin pregnancies. PloS one. 8 (5), e63800 (2013).
  45. Zhang, J., Bricker, L., Wray, S., Quenby, S. Poor uterine contractility in obese women. BJOG. 114 (3), 343-348 (2007).
  46. Higgins, C. A., et al. Maternal obesity and its relationship with spontaneous and oxytocin-induced contractility of human myometrium in vitro. Reprod Sci. 17 (2), 177-185 (2010).
  47. Crankshaw, D. J., O'Brien, Y. M., Crosby, D. A., Morrison, J. J. Maternal body mass index and spontaneous contractility of human myometrium in pregnancy. J Perinatol. 37 (5), 492-497 (2017).
  48. Luckas, M. J., Wray, S. A comparison of the contractile properties of human myometrium obtained from the upper and lower uterine segments. BJOG. 107 (10), 1309-1311 (2000).
  49. Chapman, N. R., Kennelly, M. M., Harper, K. A., Europe-Finner, G. N., Robson, S. C. Examining the spatio-temporal expression of mRNA encoding the membrane-bound progesterone receptor-alpha isoform in human cervix and myometrium during pregnancy and labour. Mol Hum Reprod. 12 (1), 19-24 (2006).
  50. Robson, S. C., Simpson, H., Ball, E., Lyall, F., Bulmer, J. N. Punch biopsy of the human placental bed. Am J Obstet Gynecol. 187 (5), 1349-1355 (2002).
  51. Popat, A., Crankshaw, D. J. Variable responses to prostaglandin E(2) in human non-pregnant myometrium. Eur J Pharmacol. 416 (1-2), 145-152 (2001).
  52. Arrowsmith, S., Neilson, J., Wray, S. The combination tocolytic effect of magnesium sulfate and an oxytocin receptor antagonist in myometrium from singleton and twin pregnancies. Am J Obstet Gynecol. 215 (6), 789-e789 (2016).
  53. Crankshaw, D. J., Morrison, J. J. Methodology and pharmacological analysis of effects of uterotonic compounds in human myometrium in vitro. Am J Obstet Gynecol. 205 (2), 155-e156 (2011).
  54. Di Giglio, M. G., et al. Development of a human vasopressin V1a-receptor antagonist from an evolutionary-related insect neuropeptide. Sci Rep. 7, 41002 (2017).
  55. Attah, A. F., et al. Ethnobotanical survey of Rinorea dentata (Violaceae) used in South-Western Nigerian ethnomedicine and detection of cyclotides. J Ethnopharmacol. 179, 83-91 (2016).
  56. Koehbach, J., et al. Oxytocic plant cyclotides as templates for peptide G protein-coupled receptor ligand design. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21183-21188 (2013).
  57. Taggart, M. J., Burdyga, T., Heaton, R., Wray, S. Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracellular calcium and force by altered intracellular pH. Pflugers Arch. 432 (5), 803-811 (1996).
  58. Luckas, M. J., Taggart, M. J., Wray, S. Intracellular calcium stores and agonist-induced contractions in isolated human myometrium. Am J Obstet Gynecol. 181 (2), 468-476 (1999).
  59. Parratt, J. R., Taggart, M. J., Wray, S. Functional effects of intracellular pH alteration in the human uterus: simultaneous measurements of pH and force. J Reprod Fertil. 105 (1), 71-75 (1995).
  60. Taggart, M., Wray, S. Simultaneous measurement of intracellular pH and contraction in uterine smooth muscle. Pflugers Arch. 423 (5-6), 527-529 (1993).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

131myometrium

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved