Method Article
* これらの著者は同等に貢献しました
この説明は前のヴィヴォひと子宮筋の収縮や創.の応用を研究する実験的プロトコル小説研究プローブから薬理学的データを検証するだけでなく新たな子宮筋生理機能の理解を改善するためにこのテクニックを使用または薬剤をリードします。
探索と新規医薬品化合物または生化学的なプローブの特性評価は、堅牢な生理学的に関連するアッセイ系に依存します。我々 は前のヴィヴォ子宮筋収縮力を測定する方法を説明します。このアッセイは、要因を調査する使用ことができに関わる分子群の子宮筋収縮と彼らの興奮あるいは抑制の行動を決定するための変調と、それゆえ彼らの治療の潜在的なin vivo。生検は、インフォームド コンセントと帝王切開で配信を受けている女性から取得されます。細く切った子宮の解剖、クリップ、1 mL オルガン風呂 37 ° C で生理食塩液隔内力変換器に接続されています。ストリップ設定張力の下で 2-3 時間以内の自発収縮を開発し、安定して多くの時間を (> 6 h)。ストリップは、内因性ホルモン濃度依存性収縮頻度の変調を引き起こす、オキシトシンとバソプレシン、強制や期間より近い労働の収縮などを契約にも刺激できます。したがって、自然とアゴニストによる収縮に対する既知および新規の医薬品リードの効果をテストできます。
このプロトコルは具体的にはこの分析を使用してひと子宮筋収縮の様々 なパラメーターに及ぼす影響を測定することによって既知および新規エージェントの効力を決定する方法について説明します。オキシトシンと V1 a受容体拮抗薬、atosiban、オキシトシンとバソプレシン収縮を阻害し、補完し、検証のこのメソッドの使用方法を示す知られている化合物の例として SR49059 を用いてください。薬理学的データの医薬品開発を支援するために細胞に基づく試金から得られます。オキシトシンとバソプレッシンと比較して新規のアゴニストの効果も特徴付けられます。我々 は、オキシトシンの例を使用しながら/バソプレシン システムでは、このメソッドはまた、他の受容体と子宮収縮と弛緩人間の子宮の生理学および病態生理学の理解を進めるために役割を果たすイオン チャネルを研究するために使用します。
創の目標は、小説で、強力なアクティブ化したり、細胞のシグナル伝達経路を阻害することによって治療の反応を生成する選択性の高いリガンドを生成することです。これにより、信頼性の高い、堅牢で、関連性の高い結果1と鉛の化合物をテストするための適切な測定システムが必要です。リガンド-受容体結合および機能アッセイなどの薬理学的手法は、しばしば異種細胞ベース システム、2はないでしょう過剰受容するように設計を採用しています。これらの技法は、受容体の薬理学と創薬初期段階のための貴重な洞察力を提供、しながら得られたデータは真生体内でシナリオを表さない場合があります。したがって、細胞に基づく試金から薬理学的データが生理学的に関連するモデルにも検証されていることが重要です。
子宮の平滑筋 (子宮) は、分娩中に消し去ると、子宮頸部の拡張および胎児3を配信する収縮に責任がある子宮の筋層を構成します。子宮筋の収縮が自然です。4契約にホルモンや神経の入力は必要ありません。収縮は電圧駆動 Ca2 +の開口部につながる子宮筋細胞膜の自発分極によってもたらされる-チャンネル (L 型チャネル) および Ca2 + 5セルに流入。カルモジュリンのカルシウム複合体と順番ミオシン クロス ブリッジのサイクル形成収縮とアクチンの結合を有効にすることを廃止するミオシン軽鎖キナーゼを活性化します。リラクゼーションは通常解消リン酸化ミオシンによるミオシン軽鎖ホスファターゼと Ca2 +の押し出しはセルおよび/または筋小胞体に隔離 (SR)5,6 を介して濃度の減少によって媒介されます。 ,7。
子宮筋の機能と障害、体内の内部および外部の tocography と子宮内圧カテーテルから子宮筋起源8 の変形や不死化細胞の生成に勉強をいくつかの方法が開発されています。 ,9,10、11,12。細胞培養システムは、物質が細胞レベルで動作することができるかどうかを検出できる、しながらオルガン浴場内組織のストリップは、薬理学的試薬に全体の組織の機能の反応を測定するツールとして使用できます。伝統的なオルガンのお風呂は、通常 5 と 50 mL 生理食塩水 (PSS) の間保持することができる大規模な加熱ガラス容器です。これらの大型チャンバー内でストリップ通常酸素および PSS の大量の曝気が必要です。組織のストリップに解剖し入浴室内で中断し、収縮張力の変化を測定する力変換器に接続されています。人間とモルモット13、14マウス、ラット15、ウサギ16などを含む動物から子宮の17,18のストリップを調べる多くの研究グループによって使用されています。子宮筋の生理学と病理学、早産と機能不全の労働者を含むに関する多くの質問。たとえば、子宮ストリップは、規制し修正筋活動19,20,21,22SR などの細胞器官の機能を決定する要因を識別するために使用されているだけでなくイオンの変調器を調査チャンネル23,24,25,26、ポンプおよび交換器27子宮筋生理学におけるそれらの役割を決定するのには。
この前のヴィヴォテクニックにより測定される、組織収縮のパフォーマンスの評価と収縮のパラメーターに異なるエージェントの直接影響のためなど、収縮力 (強さ)、頻度、および期間と同様行う合計作業 (平均不可欠な力または曲線の下の領域) のインデックスを生成するため、これらの値の統合。隔離されたティッシュのストリップの準備は、1 つ以上のセル型のモデルを構成すると、全体の組織の生理的反応が測定できます。オルガン バストイレ分離組織のストリップ、したがって細胞培養作業と全体の動物間のブリッジを提供する便利なツール/生体内で動作します。したがって、創薬、新薬の興奮性の面での影響の分野で (すなわち、刺激的な) または抑制 (すなわちリラクゼーション) 潜在的な生体内でより密接に評価できます。この手法はオキシトシンと V1 aの開発で使用される正常に-早産収縮を阻害し、早産を遅らせるに子宮収縮抑制剤として (OTR と V1 aR) 受容体拮抗薬 atosiban。拮抗薬オキシトシン (OT) を大幅に削減することができるが見つかりましたの in vitroテスト子宮ストリップの atosiban の-収縮28,29,30を誘発します。重要なはこれらの研究 atosiban の直線移動の値を検証する助けし、必要を前方に臨床試験31,32,33,34 概念実証データを生成.Atosiban は、今広くヨーロッパの労働を遅延する選択の薬剤として使用されます。産後出血35,36,37を防ぐために、治療の可能性を表示するオキシトシン アナログ carbetocin の類似概念実証研究を行った。このアッセイで開発中の他の鉛化合物は、retosiban (GSK221149A)38と nolasiban (未発表のデータ) にもあります。これらのメソッドは、患者グループ39,40,41,42,43,44,間で比較して正常に使用されているも45,,4647種内の差異を調べるとします。
ここでこのメソッドを使用して、補完し、細胞に基づく試金から得られる薬理学的データを検証する方法を説明するために小 (1 mL) カスタムメイド オルガン浴場内ひと子宮筋妊娠中から組織ストリップ分離前のヴィヴォの使用を説明します。.生検は、いずれかに組織がさらされていない予定手術、生検のコレクションのスケジュール、子宮筋に簡単にアクセスを容易に、それ故に、事前に労働科目帝王 (CS) 配信を受ける女性から得られた主子宮收縮刺激や手術前に弛緩。しかし、生検は患者を完全に同意する十分な時間が提供する労働の予定外 (緊急事態) CS 配信を受ける女性からも入手できます。しかしそれは上部のセグメント48,49からサンプルを取得することも、ほとんど生検手術外科的切開のサイトで下の子宮セグメントから得られます。経腟分娩を次にいくつかの場合、胎盤のベッドからパンチ生検も取得されている50。しかし、これはほとんどの従来のルートではない、取得子宮筋組織量が少ない。非妊娠子宮筋は、良性婦人科疾患の子宮摘出術を受ける前や閉経後の女性から入手できます。全層生検子宮頸から下のコーパスからのサンプリング後の病理検査で、子宮筋層、漿膜と子宮内膜の表面を回避する子宮壁の中央から撮影します。
生体実験の適切な制度的、倫理的な検討委員会と安全性承認は、任意の人間の組織で作業する前に場所でなければなりません。すべての作業説明本研究倫理委員会から承認を取得 (リバプール東, REC Ref 10/h1002 オリーブスモルト/49) と研究と開発部、リバプールの女性の病院とリバプール大学の倫理委員。
注: このプロトコルで記述されているすべての生検は、参加する前の労働リバプール女性の病院でそれぞれの女性の分娩の CS 方法を与えた同意を受ける女性から得られました。
1. ソリューション
2. 組織バスの設定
3. ティッシュの準備とストリップの解剖
4. お風呂で組織をマウント
5. 40 mM カリウム (高 K+) を持つ組織に挑戦
6. 子宮筋収縮に対する既知および新規化合物の影響をテスト
注: 自発 (図 3 a) またはアゴニスト刺激収縮 (図 3B-C) の子宮筋機能に及ぼす新規治療薬、試薬にもテストを実行できます。アゴニストの刺激収縮、OT またはアルギニン バソプレッシン (VP) が 0.5 の濃度を与える PSS に追加されます nM あり実験 (図 3 b・ C) で使用されています。自然40,52一過性である収縮を提供するので、このアッセイの OT の濃度を最適化されています。濃度アゴニストより下 (Ref41,44例についてを参照してください)、長期的な持続的なの (トニック) 収縮につながる様々 なエージェントの影響は評価することは困難と実験の時間枠周波数で個々 の収縮と削減の期間の増加に合わせて拡張する必要があります。OT または VP がので収縮を刺激するために追加されますこの例実験で知られている OTR と V1 aR 拮抗薬、atosiban、SR49059、または私たちの新規化合物 [D Arg8] によってその対立-inotocin ([D Arg8] INT) を評価できます。
7. データ解析
注: データのキャプチャし、分析を任意の数の市販のデータ集録ソフトウェア パッケージによって実行できます。詳細についてはこのプロトコルで使用されるソフトウェアの材料表を参照してください。収縮能の正確な評価、測定する収縮のパラメーターが含まれます: 収縮の振幅 i)、ii) iii) 収縮、および iv) 平均力積分 (図 4) の持続期間の収縮の頻度。平均力不可欠な収縮曲線下面積と同じです、したがって組織片によって与えられた時間で合計仕事のインデックスです。パラメーターの一部またはすべてを分析することができます。最低限、平均の不可欠な力と収縮の振幅解析53がそれをお勧めします。ここで説明する実験曲線下面積は伸縮の振幅の変化を測定した.
このモデルを使用すると、さまざまなアゴニストと収縮の拮抗薬だけでなく、既知または未知の関数の新薬への応答および定量化します。試薬濃度、例えば、10-5– 10-9 M の広い範囲で使用され、に沿って濃度の増加に追加するとき、EC50 IC50値などの標準的な薬理学的パラメーターを計算できる、対数スケール。
オキシトシン受容体拮抗剤濃度応答実験
この実験では、ひと子宮筋の対ストリップされた上記カット図 1図 2に示されている、組織お風呂でマウントに示すようし、等しい振幅の安定した収縮を生成する平衡と周波数。ストリップは、内因性の OTR アゴニスト、OT にさらされた (0.5 nM) の収縮を刺激します。OT (通常 45 分) の下で安定した活動の期間の後、atosiban は対数目盛 (10-9– 10-6 M) に沿って濃度の増加の 1 つのストリップに適用されました。2 番目のストリップは、コントロール-と時間 OT に単独で残っていた。Atosiban への応答の例は、図 5 aで見ることができます。収縮制御 (100%) として atosiban の最初の濃度の直前を撮影、振幅と適用各濃度の AUC は、図 4に示すようには計算されました。時間制御実験、実験演習の時間相当を測定しました。プロットされたデータと曲線は、グラフィカルなソフトウェア パッケージ (図 5 b・C) で非線型回帰関数の使用を装備しました。抑制効果を計算の面で atosiban の相対的な効力は濃度原因半分最大 (50%) 抑制性の応答である IC50を測定することによって計算されます。同じはアゴニストまたは収縮の刺激を行うことができます。ここでは化合物の効力は、EC50 (半分の最大刺激応答を引き起こす濃度) から計算されます。
新規化合物の反応を調査し、その受容体選択性のテスト
[D Arg8] 新たに合成された化合物の拮抗作用を調べるためひと子宮筋収縮前のヴィヴォのこの生理学的に関連するモデルを使用-inotocin ([D Arg8] INT) いずれかで刺激収縮に対するネイティブ V1aR アゴニスト、VP、またはネイティブ OTR アゴニスト、OT。この試金を使って以前 OTR54ではなく V1 aR で拮抗する薬理学的セル法による決定されていた [D Arg8] INT の受容体選択性の検証です。
この実験は、ひと子宮筋ストリップ 0.5 nM VP または約 1 時間 0.5 nM OT (図 6Aと図の濃度の増加に当社の新規化合物 [D Arg8] INT を追加する前に、図 3に示すように、収縮を刺激するためにさらされました。6 C). これは、市販の知られている V1 aR 拮抗薬、SR49059 と比較した (図 6 b)。図 6A [D Arg8] INT の濃度の増加と VP 刺激ひと子宮筋収縮の濃度依存の減少を示しています。図 6Aii-iiiには収縮の振幅のデータと各濃度の AUC をまとめます。効果は知られている V1 aR 阻害物質、SR49059、図 6Bi-iiiに示す濃度の増加のような。[D Arg8] INT V1 aR の方は OTR ない方の選択は [D Arg8] INT は振幅と AUC として OT (図 6) で刺激されて減少ひと子宮筋収縮しないこと事実によって示されて安定的に推移 (図 6Cii-iii)。
図 1: ひと子宮筋生検解離します。子宮壁を構成する 3 つの組織の層を示す人間の子宮の A (A) 図。最内層は、子宮内膜 (妊娠、赤い矢印で脱落膜)、中間層は生成の収縮、子宮筋 (筋層、黒矢印)、最も外側の層は、子宮外膜 (または漿膜、青い矢印) フォーム、子宮の周りの保護コート。生検のための関心領域は、黒の四角形で描かれています。妊娠中の女性が帝王切開で中から例生検、脱落膜と子宮筋層強調表示された (漿膜で目に見えない) (B) に示します。子宮筋のストリップは正しく実験のため解剖するように異なったティッシュ層が識別されることが不可欠です。(C) 子宮筋解剖されており、クリップの例ストリップが表示されます。通常、2-6 ストリップにカットし、示すようにクリップされます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 多臓器浴室の実験セットをひと子宮筋の収縮を測定するために使用します。(A) 子宮筋層のストリップは小さな (1 mL) オルガンに配置されます (i) 温水貯留層の上に配置された部屋をお風呂、経由して蠕動性ポンプ (ii) 生理食塩液 (PSS) 隔。貯水池は、水循環 (iii) お風呂を経由して設定温度で維持されます。各ストリップは、収縮張力の変化を記録力変換器 (iv) にアタッチされます。(V) transbridge アンプによって増幅され、関連付けられている取得ソフトウェアを実行しているコンピューター システム (vii) に記録されているデジタル信号 (vi) に変換します。(B) 合力トランスデューサーならびに他の固定フックに接続されている拡大器官がバス商工会議所のひと子宮筋の場観察(赤矢印)、ストリップの 1 つの端で PSS を浴びて。(C) 設定の図式的な概観。PSS で満たされた組織室が継続的に、37 ° c (45 ° C で保管) 風呂と 55 ° C で設定、循環水ポンプの下に温水タンクと熱交換を介して温めた PSS 灌流します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ひと子宮筋の自発とアゴニスト刺激収縮体外。振幅またはエリア-下-曲線 (AUC) (Aii、 Aiii) の重要な損失することがなく録音の 3 h 以上の自発収縮が安定アゴニスト無料条件で調査するためこのモデルのロバスト性を示す、自発収縮の様々 なエージェントのアプリケーション。安定した、自発的な収縮を確立した後 0.5 nM オキシトシン (OT、B) または (C, VP) バソプレシンは、生理食塩液 (PSS) に追加されました。収縮刺激下でも安定した数時間収縮の振幅 (Bii、 Cii) または AUC (Biii、 Ciii) の重要な損失なしのままに収縮剤の効果を有効にします。子宮アゴニスト存在下で調べた。データは、平均値 (SEM) の平均 ± 標準誤差を掲載されています。注、収縮を持って安定したらにコントロール期間 (100%) をアゴニストのアプリケーションの最初の 45 分後撮影アゴニスト刺激収縮 (B, C)。すべてのケースでストリップした PSS 37 ° c、pH 7.4 (再現シンクレアルイスらから隔生殖科学と・ ディ ・ ジリオらの許可を得て4054 学術報告から創造的な一般的なオープン アクセス ライセンス許可を受けた)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: データ解析します。(A)赤で示されている適切なコントロール期間だった収縮直前テスト混合物 (薬 X) のアプリケーションを選択することによって決定されます。この制御周期が等しい時間薬 X (例えば、この例では 40 分) のアプリケーションも。値を測定、制御周期は 100% として設定されます。以降のすべての測定値は、コントロールの割合として表されます。(B) 測定することができます収縮の 4 の異なるパラメーターがあります: (i) 収縮強さ (力、mN)、(ii) (iii) の収縮の期間の収縮率を測定する収縮の頻度を測定する収縮の振幅収縮、および全体的な仕事の尺度とする曲線 (力の積分、任意の単位として知られている) 下 (iv) 面積の最大ピーク時の半分で測定されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: ひと子宮筋のオキシトシン収縮に対する atosiban の拮抗作用を記録します。自発収縮が確立されると、収縮オキシトシン受容体のアゴニスト、オキシトシン (OT) と刺激を受けました。収縮はさらに 45 分 (A) V1 aと OT 受容体拮抗薬の刺激の下で安定させるために許可された、atosiban は対数スケール (10-9-10-5M) での濃度の増加に適用されます。Atosiban の最初の濃度を上記期間中に収縮を測定し、制御 (100%) として取られます。各後続の濃度下での活動は測定され、コントロールの割合として表されます。同じは OT による実験演習の時間と同等にさらされるストリップ行った。グラフィカル ソフトウェアにプロット データ: (B、 C) を示す atosiban の拮抗作用の濃度-反応曲線 (青)、OT による子宮収縮の振幅の車両 (灰色、タイム コントロール) の希釈を適切なと(AUC)、曲線下面積それぞれ。データは、(前に atosiban のアプリケーション) の制御アクティビティの AUC と振幅の平均 (SEM) 割合の平均 ± 標準誤差として表されます。IC50値を達成 (再現シンクレアルイスらから収縮と力積分 (AUC) の振幅の半分の最大抑制 (50%) の反応がある濃度を与える、求めた40 生殖科学からの許可と)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 小説人間の子宮筋収縮に対する化合物の効果と受容体の選択性をテストします。ひと子宮筋の自発収縮が確立された後収縮バソプレシン受容体アゴニスト バソプレッシン (VP) (Ai, Bi) やオキシトシン受容体のアゴニスト、オキシトシン (OT) (Ci) と刺激を受けました。[D-Arg8] の効果-inotocin ([D Arg8] INT) と市販 V1 aR 拮抗薬、副社長によって刺激収縮に対する SR49059 化合物の濃度を適用することによって評価されました。典型的な応答は、(Ai, Bi) に表示されます。関連付けられている分析データの振幅および (AUC) 曲線下面積は、(ii) に示すように、それぞれ、効果にコントロールの割合として表現されています (iii) 活動 (100%)。[D Arg8] INT と知られている V1 aR 拮抗薬 SR49059 振幅と AUC、ひと子宮筋の V1 aR 受容体拮抗薬として [D Arg8] INT の役割をサポート用量依存低下の原因。対照的に、[D Arg8] INT によって刺激される OT (Ci iii)、それ故に同様に我々 の調査をセルベースのアッセイから収縮に影響しなかった、[D Arg8] INT も (データを再現・ ディ ・から人間の子宮に V1 aR への選択性を示しますジリオら54 学術報告から創造的な一般的なオープン アクセス ライセンス許可を受けた)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ながら、ほとんどの医薬品開発は人間の疾患の治療を対象に、最も基本的な研究を主に動物組織で行います。ここで、重要な質問子宮に関連する生理学と病理学の数に対処するし、機能的反応を検証するために使用できる手術から得られた人間の子宮の収縮前のヴィヴォの調査方法を説明します。既知および新規医薬品開発を支援するために薬理学的エージェント。特に、我々 は、知られている OTR と V1 aR 競争拮抗薬、OT による妊娠子宮筋収縮の atosiban とその応答と受容体の拮抗の応答を調査するため本法の使用を強調表示します。新しく開発された選択的 V1 aR 拮抗薬、[D Arg8] int 型選択性紹介 EC50など IC50重要な薬物動態学的パラメーターが計算できる細胞に基づく薬理データとよく一致します。
同時に複数のタップを使用して複数のエージェントの効果, 拮抗薬, と適切な時間や車両のコントロール競争実験の直接比較のためことができます。ストリップの 2、4、または 8 のグループで準備が多くの場合、この手法は適度なスループット、6-8 (累積) 濃度 (生検) あたり 2-4 化合物のテストを有効にするを提供します。このメソッドはまた、影響を迅速に評価でき、プロトコルを調整することができますリアルタイム データを提供します。さらに、この手法は関心のすべての化合物をテストする使用ことができ、子宮筋生理学と創薬研究に焦点を当てて研究グループの数によって正常に使用されています。本稿で説明したように、純粋な化合物を分析、ほか子宮収縮モデルもされて、新規子宮收縮化合物の混合物からの画面のように正常に利用することができます伝統的な医学7から漢方薬,55,56。
このモデルは技術的に堅牢、良い再現性を示していますが、それはいくつかの制限を持って: 郭清は組織と不慣れなそれらのために困難にすることができますまたは解剖機器を使用して、したがって新しいユーザーが必要組織を最適化するためにいくつかの時間準備およびプロトコル。また、その人間の子宮は、ラットやマウスなどの他のモデルと外観がかなり違う注意する必要があります。ほとんどの齧歯動物の子宮から成る 2 つのチューブ状の子宮角、それぞれ片側卵巣と完了し、子宮頸部で。各ホーンが明確で縦走筋層は、ひと子宮筋の異なるファイバタイプしばしば密接に関連して 'メッシュ' を形成しながら郭清で簡単に分離することができます。さらに、ひと子宮筋の収縮プロファイルは齧歯動物に非常に異なっています。特に、ひと子宮筋の収縮は、期間が長く、それほど頻繁に。ひと子宮筋を操作するための実験の時間枠が多いためくらい齧歯動物モデルよりも長い。種の受容体の発現の違いもアゴニスト レスポンスにはかなり大きな差に貢献できる、これは種の間での結果を外挿する場合は念頭に置く必要があります。
このシステムからの出力を最大化への配慮が必要な手順の数もあります。重要なステップには、解剖時に不必要な損害を避けるために組織を処理するとき、またはマウントの世話など組織性の保存が含まれます。熟練の目が細く切った子宮筋、筋線維の方向は、縦方向と次の組織の面と同様、瘢痕組織、脱落膜と小血管を避け、確保を解剖する必要です。試料は、実験室、オリエンテーションの目的を支援するため脱落膜の端から漿膜の端の輪郭を描くために生検の片側にコレクションの時に (小さな手術ステッチ) などのタグを追加することが可能です。
組織は、組織の機能は温度変動、実験中に安定した 36 ~ 37 ° C で保つ必要があります。これは、堅牢なエアコン ユニット研究室内で実現できます。温めた PSS の一定の血流が保たれ温度収縮からの廃棄物のフラッシュだけでなく。オルガン浴場内温度は流量を変更するまたは直接お風呂の水の温度を調整することによって変更できます。伝統的な 5-50 mL のお風呂に比べると小さなお風呂サイズには、PSS の比較的急速な売り上げ高と試薬のウォッシュ アウトが保証されます。小型オルガン風呂ここで、説明も短くなります PSS のボリューム興味、必要コストを最小限に抑えると貴重なスペア、新開発の化学物質の試薬。さらに、小さな浴槽サイズと HEPES ベースのバッファーを使用して、このシステムは不要酸素など、カーボゲン ・と PSS をバブリングによってです。ストリップに適用される張力の標準化も重要です。このサイズ (5 mm × 2 × 1 mm) のストリップ、約 2 mN (~0.2 g に相当) をする必要がありますこの。代替方法には、最大収縮とストレッチングをこの最大収縮の半分を誘発する高カリウム溶液のアプリケーションが含まれます。しかし、注意する必要があります、適用される張力は生体内で異なる場合があります。
主な課題は、被験者から組織を得るなどが、課税が人間の組織を明確に表して、最も生理学的人間の疾患および薬剤の発見で子宮収縮を勉強の関連性の高い (とやりがいのある) モデル。ストリップしかし、必ずしもイコールではない体内組織にホルモンの例については、免除するいるし、神経入力、収縮、必須ではありませんが分離された組織が収縮の生体を調節します。この試金は、しかしそのような影響から分離、制御された方法で子宮収縮を分析する機会を提供します。できます収縮 (例えば OT、VP、プロスタグランジン等経由) のホルモン コントロールなどの要因の効果のために調査する子宮機能の調節への糸口を提供します。組織は、別の女性から得られた自然標本間自発収縮特性のいくつかのバリエーションがあります。したがって多数の実験を実行する必要があります (~ n = 10) いくつかのデータセットの53の変動を最小限に抑えるためのサンプルの。これは、患者の異なるグループ間の収縮活性を比較するときに最も重要です。アゴニスト及びアンタゴニスト活性を制御するための応答を正規化 (すなわち、制御アクティビティまたは高 K+の割合として表現する) このバリエーションのいくつかを減らします。さらに、間ストリップの変動を減らすためには、その長さと重量の投稿実験41を測定することにより断面積を除去するデータを正規化することができます。これは、患者の異なるグループ間の収縮パターンを比較するときに特に役立ちます。
この手法の限界はまた病院スタッフ、特に劇場スタッフと良好な協力関係を必要とする新鮮な組織へのアクセスを含めるし、承認プロセスに携わる。ローカルな病院や研究所研究倫理委員会審査委員会から倫理的なアクセス許可はまた場所にする必要があります。ひと子宮筋のコレクションは、ドナー手術を受けているときに CS 配信中に実行される可能性が最も高いです。赤ちゃんを提供するために作ら同じ子宮切開部位から生検を撮影し、従って患者は、さらに追加場合は手術する必要はありません。劇場スタッフと生検を行う外科医後の組織の使用の認識する必要がありますに配置される固定液など病理部門に送信してはなりません。長い実験期間は、別の考慮事項です。生体実験を取る多くの時間 (通常 > 6 h) (ラットまたはマウスの子宮で同様の実験をする 2-3 h) ではなく収縮と組織取付と自発の成立の 2-3 h のラグ タイムの遅い周波数により収縮。しかし、我々 が示されているように人体組織収縮が堅牢で、有意な疲労40せず何時間も契約することができますを確立し。
このシステムでは、妊娠中の組織の医薬品試薬をテストする機能を含む克服すべき体内作業の他の課題もできます。この手法は進む前に最初の結果を確認できるというマウスを含む他の種に容易に推定することができます全体の動物研究でさらに。温度の制御変化の組成 superfusate (PSS) と pH は、体内のさまざまなシナリオを模倣化合物の挙動にこれらの変更の影響を分析して簡単に行うことが。検出する蛍光 Ca または (H+) pH 指示薬と機器を用いて子宮ストリップの等尺性張力の測定の基本原則を細胞内カルシウム濃度や pH の同時変更を測定するに拡張も可能と蛍光57,58,59,60を記録します。
全体的に、人間の子宮を表す堅牢で生理学的に関連するモデルの特徴し、創薬における新規治療化合物を検証する-純粋な化合物との混合物。OT/副社長システムに関する創薬におけるその使用の例を提供し、OTR と V1、R 受容体拮抗薬化合物の有効性と定義されたターゲットでの効力を判断して検証性のこのモデルの使用方法に焦点を当てた。しかし、それは、このテクニックが興味や子宮筋収縮 (または緩和) に至る経路の任意の対象を研究し、新たな目標と経路、創薬を支援するために使用できます、子宮筋の理解を進めることを心に負担すべき生理学と病態生理学。
著者が明らかに何もありません。
この研究は、プロジェクト I3243 を通じてオーストリア科学基金 (FWF) と欧州研究会議 (ERC) 欧州連合のホライゾン 2020年研究とイノベーション プログラム (許諾契約 No 714366) の下でサポートされています。オーストラリア研究会議 (ARC) 未来フェローシップ (FT140100730)、アーク探索初期キャリア研究員 (DECRA) フェローシップ (DE150100784) MM、CWG をサポートされています。SA は、ハリス幸福早産出生研究センター助成金によって英国女性の健康管理によってサポートされます。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |
このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します
許可を申請This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved