חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Summary

פרוטוקול זה ממחיש את הצעדים החשובים רצופים הנדרש כדי להעריך את הרלוונטיות של ניטור חיוניות פרמטר בתהליכי תיקון ה-DNA להחיות Bacillus subtilis נבגים לאחר הטיפול עם לחץ נמוך פלזמה על-ידי מעקב מתויג פלורסצנטיות DNA תיקון חלבונים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים זמן לפתור קונפוקלית וסריקה.

Abstract

פלזמה-עיקור הוא אלטרנטיבה מבטיחה שיטות העיקור קונבנציונאלי למטרות תעשייה, קליני, ומטרות בחלל. לחץ נמוך פלזמה (LPP) הפרשות מכיל קשת רחבה של מינים הפעילים, אשר להוביל איון מיקרוביאלי מהירה. ללמוד את היעילות ואת מנגנוני עיקור מאת ל"י/נ, אנו משתמשים נבגים של האורגניזם מבחן Bacillus subtilis בגלל עמידותם יוצאת דופן מפני תהליכי עיקור קונבנציונלי. אנו מתארים את הייצור של B. subtilis נבג monolayers, תהליך עיקור פלזמה לחץ נמוך ב כור פלזמה inductively בשילוב כפול, אפיון מורפולוגיה נבג באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM), ו ניתוח של נביטה, תוצר של נבגים על ידי מיקרוסקופ תא חי. יעד עיקרי של מינים פלזמה הוא חומר גנטי (DNA), תיקון פלזמה-induced נגעים DNA בעת התחייה נבג הוא חיוני להישרדות של האורגניזם. כאן, אנחנו לומדים את קיבולת נביטה של נבגים ותיקון התפקיד של ה-DNA במהלך נבג, תוצר לאחר הטיפול עם ל"י/נ באיתור מתויג fluorescently DNA תיקון חלבונים (רקה) עם זמן לפתור פלורסצנטיות קונאפוקלית מיקרוסקופ. מטופלים, נבג לא מטופל monolayers הם מופעלים עבור נביטה, דמיינו במיקרוסקופ הפוכה קונאפוקלית תא חי לאורך זמן לעקוב אחרי התגובה של נבגים בודדים. התצפיות שלנו לחשוף השבר של הנבטת ו. הנוכחי נבגים תלויה משך הטיפול-LPP להגיע למינימום לאחר 120 ס' רקה-YFP קרינה פלואורסצנטית (חלבון פלורסצנטיות צהוב) זוהה רק כמה נבגים ופיתח בכל . הנוכחי תאים עם העלאה קלה בנבגים שטופלו ל"י/נ יתר על כן, חלק מהחיידקים וגטטיבי נגזר שטופלו LPP נבגים הראו עלייה ציטופלזמה, נטו lyse. השיטות שתואר לניתוח של נבגים בודדים יכול להיות למופת לחקר היבטים אחרים של נבג ותוצר.

Introduction

יעד מרכזי של חקר החלל הוא החיפוש אחר חתימות של צורות חיים ושל מולקולות על גופים פלנטריים וירח אחרים במערכת השמש שלנו. העברת מיקרואורגניזמים או מולקולות כדור הארץ לאזורים קריטי של חקר הוא סיכון מסוים לפגיעה פיתוח, שלמות של החיים-זיהוי משימות על גופים פלנטריים כגון מאדים ואת אירופה¹. ההנחיות הבינלאומי של הגנה על כוכבי הלכת, הוקמה על ידי הוועדה של שטח מחקר (COSPAR) בשנת 1967, לכפות חוקים נוקשים על משימות רובוטיות ומזומן כוכבי לכת אחרים, ירחים שלהם, אסטרואידים וגופים שמימיים אחרים ולווסת ניקוי ועיקור של חללית, רכיבי חומרה קריטיים מוקדמת להשיק כדי לשלול זיהום מיקרואורגניזמים יבשתי ולמנוע זיהום לחצות של גופים שמימיים². במהלך העשור האחרון, היישום של הלא-thermal פלזמות צבר רחב לב במחקר ביו-רפואי, תזונה, כמו גם בחלל יישומים^3,4,5. פלזמה-עיקור הוא אלטרנטיבה מבטיחה שיטות העיקור קונבנציונאלי כפי שהוא מציע איון חיידקים מהיר ויעיל⁶, בעת היותו עדין כדי רגיש וחומרים יציב חום. פלזמה הפרשות מכילות תערובת של תגובתי סוכני כגון פוטונים אולטרה סגול (UV) ולאחר ספקטרום אולטרה סגול ואקום (VUV) אשר להוביל איון מיקרוביאלי מהירה³אטומים מתרגש/נייטרלי, חלקיקים טעונים, רדיקלים חופשיים. במחקר זה, אנו משתמשים בלחץ נמוך פלזמה שנוצר על ידי זוגי בשילוב inductively פלזמה בלחץ נמוך (DICP) מקור^7,8 כדי להשבית Bacillus subtilis endospores מופץ על זכוכית בדיקת השטח.

חיידקים גראם חיוביים של משפחת Bacillaceae מופצים באופן נרחב בבתי-גידול טבעיים של אדמה, משקעים אוויר כמו כמו דופן סביבות כגון מתקני חדר נקי, תחנת החלל הבינלאומית^{9,10 ,11}. התכונה ברורים ביותר של הסוג של Bacillus היא יכולת ליצור עמידים מאוד endospores רדום (ןלהל נבגים) כדי לשרוד את התנאים שלילי, כגון דלדול מזין¹². הנבגים עמידים בדרך כלל הרבה יותר מאשר עמיתיהם תא וגטטיבית מגוון של טיפולים, לחצים סביבתיים, כולל חום, UV, הקרנה גמא, לייבוש, הפרעה מכנית של כימיקלים רעילים, כגון המחמצנים חזק או סוכני שינוי ב- pH (נבדקה הפניות^13,14) ולכן הם אובייקטים האידיאלי לבדיקת היעילות של שיטות איון מיקרוביאלי. מאז הדנ א הגנומי יעד עיקרי של טיפול פלזמה של^15,חיידקים¹⁶, תיקון פלזמה-induced נגעים דנ א (למשל שוברת הד כפול) על נבג התחייה חיונית להישרדות של חיידקים^{13, 17}.

לכן, אנחנו לומדים את קיבולת נביטה של נבגים ואת התפקיד של DNA לתקן במהלך נבג, תוצר לאחר בטיפול את הנבגים עם לחץ נמוך ארגון פלזמה על-ידי נבגים בודדים הבאים ותיקון שלהם ביטוי של DNA מתויג קרינה פלואורסצנטית חלבון רקה עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות קונאפוקלית זמן לפתור. אנחנו נותנים הוראה צעד אחר צעד של הכנת B. subtilis נבגים ב monolayers להשגת תוצאות הבדיקה לשחזור, הטיפול של ספורה monolayers עם לחץ נמוך פלזמה עבור עיקור, הכנת פלזמה מטופלים נבגים עבור ultrastructural הערכה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM), וניתוח מיקרוסקופיה של תא חי ברמה של נבגים בודדים בהופעה עם ניטור פעיל הדנ א תיקון תהליכים המתרחשים בתוך התא בתגובה טיפול פלזמה.

Protocol

1. ייצור נבג bacillus subtilis , טיהור

1. לייצור נבג, להעביר לילה מ ל תרבות של בהתאמה זן B. subtilis , בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה, 200 מ ל כפול-כוח נוזלי שפר הנבגה לבינוני (לכל ליטר 16 גרם מרק מזין, אשלגן כלורי 2 g, 0.5 ג'י MgSO ₄* 7 שעות₂O, 2 מ ל 1 מ' Ca (₃)₂, 2 מ ל- 0.1 M-MnCl-₂ * • 4 H₂O, 2 mL מ"מ 1 מכל₄, 2 מ ל- 50% (w/v)-גלוקוז-¹⁸) ולטפח אותו עם לערבב נמרצת ב 37 ° C 72 h או עד > 95% של התרבות יש sporulated. הנבגים של זנים הבאים משמשים: B. subtilis PY79 (סוג פראי) B. subtilis PY79Δרקה:: ניאו (לקויה של חלבון תיקון ה-DNA רקה) PY79 B. subtilis רקה-yfp:: חתול (רקה התמזגו עם צהוב חלבון פלואורסצנטי [YFP]¹⁹).
2. הקציר נבגים על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 3000 g x 50 מ ל צינורות ולטהר את הדוגמאות על-ידי כביסה חוזרות שלבים (עד 15 פעמים) באמצעות סטרילי מזוקקים H₂O ולבדוק לקבלת מעמד של טוהר, נביטה על-ידי ניגודיות שלב מיקרוסקופ. ודא נבג המתלים מורכבות מתוך שלב בהיר נבגים (> 99%) הינם ללא תאים וגטטיבי (מוטות), נבגים מונבטים (מראה שחור / אפור) ופסולת תאים, אחרת עוד ניסויים מיקרוסקופ יכול לעשות. לשטוף את הדגימה עד טוהר הרצוי.
3. קבוע כייל הנבג על ידי ציפוי החוצה µL 50 של דילולים טורי 10-fold על LB-אגר (קרי: שימוש 30 מדגם µL + 270 µL במים סטריליים לקבלת 1:10 דילול. לקחת µL 30 מ דילול מסוים 270 µL H₂O לדילול מטריים וכך הלאה) לחשב את CFU (המושבה יוצרי יחידות), דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר CFU נחישות, להתאים את הדגימה כדי נבגים⁹ 10 לכל mL ריכוז או דילול עם מים סטריליים.

2. דגימה הכנת שהופקדו תרסיס Bacillus subtilis נבגים

הערה: הצטברות חופפים של נבגים עשויים לגרום צל אפקטים במהלך הטיפול, בסופו של דבר וכתוצאה קינטיקה איון זייף. כדי למזער את הבעיה, הכן נבג בדגימות באמצעות טכניקה העדות תרסיס²⁰. בקצרה, שולט הצינור 2-חומר ברמת דיוק גבוהה עם שעון העצר של חשמלי המווסת את התפוקה נוזלי בהופעה עם הזרם המוביל בלחץ גז (כאן N₂). לפזר את הדגימה נוזלי מוזרק דרך שקע זרבובית באמצעות זרימת גז חנקן.

1. מקום נשא לדוגמה בטופס של שקופיות מיקרוסקופיים סטיריליים (עבור הישרדות קינטיקה) או עגולה coverslips 25 מ מ (לצורך מעקב פלורסנט של DNA לתקן תהליכים/cLSM; סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי) בתוך בתרסיס המופעלים חשמלית ריסוס יחידה מזדהים עם הזרבובית. ריכוז נבג משומש צריך להתאים לחצית הריכוז הסופי הרצוי.
2. העברת 1 מ"ל של התרבות נבג לים נוזלים זרבובית וליזום את תהליך התזת של 0.1 s, בלחץ של 1.3 בר. נבג מותז ההשעיה (1 x 10⁷) טפסים סרט דק בשקופית מיקרוסקופיים מתייבש במהירות בתוך שניות כדי ליצור טפט של נבג מבוזרות בצורה אחידה. חנות נשאיות שטופלו הדגימה במיכל סטרילי בטמפרטורת החדר.

3. טיפול פלזמה לחץ נמוך

1. להכין את מערכת פלזמה לטיפול של דגימות ביולוגיות, להפעיל את המערכת-5 הרשות הפלסטינית עם ארגון פלזמה-500 ואט במשך 5 דקות. על ידי זה, כל המשטחים במערכת הם מנקים את לחמם. זה מפחית דבק של מולקולות של אויר, כלומר חנקן, חמצן ומים, תוך אוורור המערכת. לאחר רעלני של המערכת, לפרוק את התא, למקם את הדוגמאות בזהירות במרכז הספינה הכור בעזרתו של ארונות זכוכית.
2. השתמש משכפל ביולוגית לפחות שלושה. לסגור את התא ותתפנה מתחת 2 אבא אחר כך, מילוי הגז תהליך לתוך החדר. לווסת את הלחץ במערכת כדי 5 הפלסטינית.
3. אחרי הפעם תהליך מוגדר, לבטל את אספקת חשמל וגז, בזהירות לפרוק את המערכת כדי למנוע לפוצץ את הדגימות ממחזיק מדגם. לאחר אוורור, להסיר את הדגימות ולמקם את הדגימות עבור הפרמטר הבא במערכת. עבור פקדים שאינם פלזמה-מטופלים לחשוף דגימות אבק בלבד (5 הרשות הפלסטינית) בנוכחות של הגז תהליך מקביל לזמן הארוך ביותר יישומית פלזמה.

4. שחזור והערכה של הישרדות נבג

1. להכין פתרון של בלוק 10% דבק פלסטי (PVA), לכסות המוביל מדגם בזהירות עם-500 µL ולתת להם air-dry עבור 4 h רצועת את השכבה PVA מיובשים (מכיל כעת המדגם נבג) באמצעות מלקחיים סטרילי והעברתה 2 מ ל תגובת הרכבת התחתית. להוסיף 1 מ"ל של מים סטריליים הצינור, להמיס את שכבת PVA ויה vortexing. הליך זה מוביל > 95% התאוששות של נבגים ואינו משפיע על היכולת שלהם נביטה²¹.
2. באופן סדרתי לדלל את הדגימה ב 1:10 במים סטריליים בצלחת 96-ובכן (קרי 270 µL סטרילי H₂O + דילול מדגם/לשעבר 30 µL). צלחת החוצה µL 50 של כל דילול על Lysogeny מרק מזין אגר (ליברות), דגירה הלוחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ולספור את מספר מושבות מבוגר (CFU).

5. חיים התא מיקרוסקופ ומעקב תהליכי תיקון ה-DNA הנבטת נבגים

1. לניסויים נביטה, להכין 1 מ"מ עובי 1.5% LB-אגר פנקס, הרתחה 700 µL בינונית, pipet אותו לתוך צלחת פטרי מיקרוסקופ סטרילי. לאחר 10 דקות, לגזור 8 מ"מ x 8 מ"מ x 1 מ מ LB-אגר pad עם איזמל סטרילי ולהעביר את אגר בזהירות על גבי monolayers נבג אשר מונחות על coverslips זכוכית דקה 25 מ מ.
   הערה: שלב זה הוא קריטי עבור ויזואליזציה של נבגים בודדים ולאפשר בעקבות התגובה שלהם, לקראת ההפעלה של נביטה שנגזרות אגר מזין. לפיכך, LB-אגר משמשת לשתי מטרות, (1) כדי לתקן את הנבגים על פני השטח, אשר מונע relocalization לאורך פני השטח, ממוקד אופטי, ו- (2) כדי להפעיל את הנבג עבור נביטה.
2. לאחר המכסה את הדגימה עם אגר, להעביר coverslip זכוכית במהירות לתוך תא הדמיה מיקרוסקופ הדגימות עם קונאפוקלית סריקה בלייזר במיקרוסקופ אוטומטי עם אופטיקה הפוכה באמצעות 63 X / 1.3 מטוס apochromatic שמן טבילה אובייקטיבי.
3. בצע הדמיה של קרינה פלואורסצנטית (YFP) עם עירור אורך גל של nm ו פליטה 514 ניתן להבחין בין 520 ו 560 ננומטר.
   1. תמונות מלון הרשומה בהיר-שדה באחת מכפילי צילום (נתיב אור ששודרו) במצב סריקה.
   2. להקליט סדרת בצילום מואץ עם כוח לייזר של 2.6%, וקבעו את הצמצם קונאפוקלית ל 5 יחידות אוורירי, בתדר דגימה של מסגרת 1 לכל 30 s מ- 0 h עד 5 שעות, תלוי בניסוי. . זה בולטת במיוחד כי מינונים גבוהים של מונוכרומטי לייזר תאורה-514 nm לחלוטין לעכב נביטה (איור 1א', ב').
4. שומרים את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס (לחות אויר) בשלב חימום במהלך התהליך הדמיה. עבור כל תנאי לצפות בקבצים יש להשתמש בתוכנת עריכה התומכת בפורמט משכפל ביולוגית לפחות שלושה. במקרה של צבירת נבג, נבג מרובה שכבות הפצה או זיהום על ידי חלקיקי אבק, חסימה של הטיפול פלזמה ("צל") עלולה להתרחש ולאפשר נביטה של נבגים מוצלל (איור 1C, D).

איור 1: בעיות פוטנציאליות ציין במהלך תא חי קונאפוקלית מיקרוסקופ פלורסצנטיות פלזמה מטופלים נבגים. (A, B) עיכוב של נבג נביטה על ידי מינונים גבוהים של מונוכרומטי (514 ננומטר) לייזר תאורה. (א) סקירה (3 x 3 מסגרות תפור) של B. subtilis (LAS72, רקה-YFP) נבגים 180 דקות לאחר החניכה של נביטה. המסגרת באמצע נחשף במרווחי s 30 למינונים גבוהים של אור לייזר (514 ננומטר, עוצמת הלייזר 70%), ואילו האזורים שמסביב (= מסגרות) היו לא מואר (התמונה הממוזגת של שדה בהיר וערוץ רקה-YFP פלורסצנטיות; הורה היו מבנים נגרמת על-ידי שימוש 35 מ מ הדמיה מנות עם רשת מוטבעים מיקרומטר 500). (B) מדגים 4 X תצוגה מוגדל של הגבול בין אזור מואר, שאינו מואר מראה כי נבגים, אשר נחשפו מינונים גבוהים של תאורה לייזר מונוכרומטי לא לנבוט ולגדול, ואילו נבגים ב אזורים שאינו מואר לשחזר באופן מלא חיידקים וגטטיבי לבטא בהיר רקה-YFP קרינה פלואורסצנטית (אות ירוק). (C, D) נבגים מכוסה על ידי זיהום חלקיקי או שכבות מרובות של נבג (חיצים) נראה מפני נבגים כבסיס איון על ידי טיפול פלזמה ולאפשר שלהם נביטה, תוצר ("צל אפקט"). נבגים (ג) היו שטופלו פלזמה 60 s ו שבעורך 180 דקות לאחר החניכה של נביטה או (ד) תמורת 120 s ולא עם תמונה לאחר מינימום 240 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

6. סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)

1. השתמש מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כדי לספק ultrastructural מידע אודות המורפולוגיה משטח של נבגים פלזמה מטופלים בהשוואה פקדים ללא טיפול. מעיל monolayers נבג מיובשים על coverslips עם זהב-פלדיום (3 ננומטר) באמצעות לרעוד. להוציא-coater. השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים סריקה שדה פליטה הדמיה הדגימות, פעלו עם 5 מתח ההאצה kV כולל של גלאי בעדשה משני אלקטרונים כדי לחשוף את הטופוגרפיה חדות.

7. ניתוח נתונים

1. לקבוע נבג הישרדות בין המנה N/N₀, כאשר N הוא מספר הממוצע CFU של דגימות שטופלו ו- N₀ הוא הממוצע CFU של פקדים ואקום ללא טיפול. מגרש נבג איון על ידי ארגון טיפול פלזמה כפונקציה של הזמן (בשניות). אקספרס כל הנתונים ממוצעים, סטיות תקן (n = 3).
2. ניתוח תמונות מתקבל על ידי הדמיה תא חי שימוש בתוכנת הדמיה. לכמת את הפרופורציה של נבג ולספור. הנוכחי לאחר טיפול פלזמה, נבגים במסגרות נציג בתחילת הניסוי, כמו גם אחרי 4 שעות. קביעת משמעות מבחני הישרדות נבג, לשימוש חד-כיווני אנובה-בדיקות (ניתוח השונות) עם תוכנה סטטיסטית). P ערכים < 0.05 נחשבים כמו סטטיסטית.

תוצאות

ההישרדות של מטופלים-פלזמה B. subtilis נבגים

טיפול פלזמה של נבגים B. subtilis להשתמש בתוכנית לימוד ירידה בהישרדות עם הגדלת משך הטיפול פלזמה (איור 2). נבגים של המתח לבטא את רקה-ין דבוקה YFP הראה הישרדות עקומות הדומה נבגים של...

Discussion

עיקור וסירוס של משטחים באמצעות בטמפרטורה נמוכה, פלזמה בלחץ נמוך היא חלופה מבטיח עיקור די קונבנציונלי הליכים כגון טיפול עם מייננת קרינה, כימיקלים (למשל גזים כמו H₂O₂ או אתילן אוקסיד) או חום לח ויבש²³. שיטות העיקור רגילים מספקים בעיקר של עיקור יעיל, אך הם ידועים כדי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Two substance nozzle (model 970-8)	Schlick	14,404	230 V, 50 Hz, D 4.484/8, 0.8 mm bore diameter
Luria Bertani Medium	Sigma Aldrich	70122-100G
Tube connectors	Festo	n/a	G 1/8
Magnetvalve DO35-3/2NC-G018-230AC	Bosch Rexroth	820005100
PLN Polyamid tube	Festo	558206	d = 6 mm
Glass slides	VWR	48300-026
Electric Timer 550-2-C	Gefran	F000074	220 V
attofluor cell chamber	Menzel, Fisher Ref.	3406816	d=25 mm, round
MgSO4*7 H2O	Sigma Aldrich	13152
Ca(NO3)2	Sigma Aldrich	202967
MnCl2 * 4 H2O	Sigma Aldrich	244589
FeSO4 * 7H2O	AppliChem	13446-34-9
Glucose	Merck	215422
KCl	Sigma Aldrich	P9541-500G
Nutrient Broth (NB)	Merck	105443
Luria-Bertani (LB)	Merck	110283
96-wellplate	ThermoFisher	243656
Zeiss LSM 780, Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
Leo 1530 Gemini	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
ZEN 2 and ZEN lite 2012 (Software)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	n/a
SigmaPlot, version 13.0 (Statistic software)	Systat GmbH, Erkrath, Germany	n/a
Attofluor cell chamber	Invitrogen	A7816
µ-Dish 35 mm, high Grid-500 Glass Bottom	ibidi	81168