JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הטרוגניות חלוקת תאים HER2 חיובי יכול להיות שנצפו בקבוצת משנה של סרטן השד ומייצר דילמות קליניים. כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול אמין וחסכוני להגדיר, לכמת, ולהשוות בין HER2 אינטרה-גידול הטרוגניות גנטית בסדרה גדולה של סרטן השד heterogeneously מעובד.

Abstract

טיפולים ממוקדים כנגד הקולטן האנושי גורם הגדילה באפידרמיס 2 (HER2) השתנו באופן קיצוני את התוצאה של חולים עם סרטן השד HER2 חיובי. עם זאת, מיעוט מהמקרים הצגת התפלגות הטרוגנית של HER2 חיובי תאים, אשר יוצר אתגרים קליניים גדולים. נכון להיום, אין פרוטוקולים סטנדרטיים ואמין כדי להפוך את אפיון כימות של HER2 הטרוגנית הגברה ג'ין קוהורטות גדולות הוצעו. כאן, אנו מציגים מתודולוגיה תפוקה גבוהה להעריך את מצב HER2 בו זמנית על פני אזורים שונים טופוגרפית של סרטן השד מרובים. בפרט, אנו ממחישים את ההליך מעבדה כדי לבנות מיקרו-מערכים רקמות משופרת (ניסית אותו בעבר) שילוב מיפוי יישוב של הגידולים. כל הפרמטרים TMA מוטבו במיוחד עבור כסף בחיי עיר הכלאה (SISH) של פורמלין-קבוע-מוטבע פרפין (FFPE) רקמות השד. ניתוח Immunohistochemical של סמנים prognostic, ניבוי (קרי, ER, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2) צריכה להתבצע באמצעות הליכים אוטומטיים. פרוטוקול SISH מותאם אישית יושמה כדי לאפשר ניתוח מולקולרית באיכות גבוהה על פני מספר רקמות שעברו הליכים קיבעון, עיבוד, אחסון שונים. במחקר זה, אנו מספקים הוכחה-של-עיקרון כי רצפי DNA ספציפיים יכול להיות סרטן שד מקומי בו זמנית באזורים סימון שבילים ברורים של מרובה ולא מעובד heterogeneously באמצעות שיטה יעילה וחסכונית.

Introduction

HER2 נמצא proto-oncogene overexpressed, הוגדל ב- 15-30%1,סרטן שד פולשני כל2. HER2 ביטוי היא להסיק על ידי הנוכחות של > 10% תאים עם ממברנה חזקה immunohistochemical (IHC) צביעת (3 +), בעוד הגברה ג'ין יכול להידרש כאשר היחס HER2/צנטרומר הוא ≥2 או המספר עותק הגן הוא ≥6, כאשר על סופר לפחות 20 תאים על-ידי בחיי עיר הכלאה (איש)3.

הטרוגניות גנטית אינטרה-הגידול כבר נרחב שמתואר סרטן השד, להיות תורם פוטנציאלי לוואי הערכת סמנים ביולוגיים ו טיפולים תגובה4. על פי המכללה של אמריקאי פתולוגים (CAP), HER2 הטרוגניות קיימת אם HER2 מוגבר ב- > 5% ו- < 50% שחדר גידול תאים5. למרבה הצער, השכיחות האמיתית של HER2 הטרוגניות המרחבי סרטן שד נותרת כנושא למחלוקת בין פתולוגים עם יש מחברים שמירה על זה זהו אירוע נדיר ביותר, מציע את זה עד 40% של המקרים האחרים HER2-הטרוגניות1,5,6,7,8,9,10. למרות המנגנונים הביולוגיים לחזק תנאי זה לא עדיין מלא לאשורן, ההשפעות prognostic וקלינית של הטרוגניות HER2 אינטרה-גידול מכריעים עבור חולי סרטן השד11.

לאחרונה, טכניקות מולקולריות שדה בהיר, כגון הדפסות כסף איש (CISH) וכסף איש (SISH), הופיעו כפעולות אמין כדי לזהות HER2 הטרוגניות ברקמות FFPE, עם כמה יתרונות לעומת איש (פיש) פלורסנט12. למרבה הצער, ניתוח בכמות גדולה של מקרים בודדים נשאר מעשית בלימודי מחקר עוקבה גדול. מספר קבוצות הראו כי השילוב של להסטולוגיה, IHC ולאחר איש עם טכנולוגיות TMA יכול לייצג אסטרטגיה חשוב בחקר הסרטן ביולוגיה13,14,15,16. בשיטה זו אומץ באופן נרחב, דגימות רקמות מחולים שונים ניתן לנתח אותם במקביל, מזעור של רקמות, ריאגנטים המועסקים וטיפוח ובכך ניתוח אחיד של סדרה גדולה של מקרים14. עם זאת, אין פרוטוקולים זמינים עבור סימולטני תפוקה גבוהה מולקולרית אפיון דגימות רקמה מרובים שעברו שונים עיבוד במונחים של ריאגנטים, קיבוע פעמים ושיטות שימור מועסקים, כגון כמו ארכיון בלוקים.

לאור ההשלכות prognostic וקלינית של הטרוגניות המרחבי HER2 סרטן שד, פיתחנו פלטפורמה מולקולרית משולבת כדי להעריך את זה בסדרה גדולה של מקרים heterogeneously מעובד. כאן, אנו מתארים את האסטרטגיות מעבדה ליצור ולנתח את הטרוגניות אינטרה-גידול של HER2 הגברה ניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד באמצעות SISH. הפרוטוקול הבא פותחה עבור גידולים מדידה > 5 מ מ (> pT1b על פי 2017 TNM)17. עבור נגעים קטנים יותר, אנו ממליצים על ביצוע הניתוח על עטיית מקטעים טורי. את הנהלים שלנו מאפשר ניתוח IHC ולאחר SISH בו זמנית של עד 30 סרטן השד, המקיף ממוצע של 6 תחומים ברורים (טווח 4-8) עבור כל מקרה. בסך הכל, 180 ליבות רקמות של 1 מ מ קוטר, עם 500 מיקרומטר בין הליבות, 2 מ מ בין הרשת לבין קצוות ייווצר עבור כל בלוק TMA.

Protocol

מחקר זה אושרה על-ידי הלוחות סקירה מוסדיים מרשות האישורים IRCCS' המלון קרן, החולים פוליקליניקו (policlinico), מילאנו, איטליה.

1. מבחר של חולים, דגימות רקמות

  1. אחזר את השקופיות ארכיוני מכל מקרי שינותח, כולל כל hematoxylin זמין ו אאוזין (H & E), שקופיות IHC מן האבחנה המקורית ותואמים, אם היא קיימת, אחד H & E של רקמת השד ללא אמצעים (למשל, שולי כירורגית) .
  2. ביצוע ביקורות תיק.
    הערה: עבור משימה זו, פתולוגים לפחות שני עם ניסיון בפתולוגיה השד צריך לדון את השקופיות אבחון ולפתור מחלוקות collegially. להשתמש במיקרוסקופ רגיל או כלי telepathology (לטובת האחרונים במחקרים multicentric). אם בכלל, אל תכלול את כל המקרים צורמים.
    1. לבצע את הסיווג מחדש היסטולוגית של כל המקרים לפי המהדורה האחרונה של ארגון הבריאות העולמי (WHO) הסיווג של גידולים של השד18.
    2. ודא כי הרקמה נורמלי לכל מקרה, אם נוכח הדגימות קליניים ארכיוני, כוללת ללא אמצעים מסוף ductal-lobular יחידה אחת לפחות.
    3. לזהות בכל התחומים אמצעים המציגים הטרוגניות cytological, ארכיטקטוני, או תכונות IHC באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (שיבוצעו במשותף על ידי פתולוג ו technician(s) אשר יבנו את ניסית אותו בעבר).
  3. לסמן אזורים טופוגרפית דיסקרטית עם סמן בשקופית זכוכית או בעזרת הכלי הנכון על תוכנה שקופיות דיגיטלי (איור 1 א').
  4. בהתבסס על השקופיות שנבחרו, לאחזר את אבני FFPE המקביל מהארכיון.
    הערה: כדי לייעל את TMA הבנייה, כדי למנוע דלדול רקמות, וכדי לשמר את TMA אגרוף המבנית, מקרים עם < לא להיות כלולים 1 מ מ בעובי רקמת שיורית.

2. לעצב ולבנות ניסית אותו בעבר מבוסס על טכניקת Kononen

  1. צור ולפתוח קובץ גיליון אלקטרוני חדש המשלב את הרשומות של האזורים ברורים בכל מקרה. לכלול את הנתונים הבאים על עמודות נפרדות, כפי שהודגם ב טבלה 1: מקרה מזהה, מזהה בלוק, מזהה אזור, סוג הרקמה (למשל, הרקמות, רכיב פולשני histotype, בחיי עיר רכיב histotype), טופוגרפיה (למשל, גידול ליבה, חזית פולשני), מורפולוגיה (למשל, כיתה גרעינית, אדריכלות, mitoses, תכונות cytological), מצב סמנים ביולוגיים (קרי, קולטן אסטרוגן (ER), קולטני פרוגסטרון (PR), Ki67, ו- HER2), ואת כל שאר התכונות IHC זמינים.
    1. לשמור את המסמך.
  2. ליצור פרוייקט TMA.
    1. התקן, לפתוח את התוכנה מעצבים TMA.
    2. הגדרת הנמען TMA גושי: גישה דרך תפריט File > ניו > בלוק או על-ידי שימוש ב- CTRL + B.
    3. לחץ על השדה הראשון כדי למלא או הקש על מקש Tab, הקלד בממדים של בלוק פראפין: רוחב 35 (מ מ), גובה 20 (מ מ). סוג "2" כערך "שוליים" (קרי, מרחק מהקצה פרפין במ מ) (איור 1B). לשמור את הנתונים על-ידי לחיצה על הכפתור המתאים. התבנית החדשה של גוש הנמען נשמר כעת ומוכנים לשימוש בתבניות מערך חדש של רקמות.
    4. יצירת פרוייקט מערך רקמות: גישה לתפריט קובץ > ניו > מערך רקמות או על-ידי שימוש ב- CTRL + טי
    5. מילוי בשם מערך רקמות, הערות, מחבר ולאחר מכן לחץ על "הבא". לחץ על הסמל "ייבוא", לבחור את קובץ התבנית של הנמען גוש שנוצרו בעבר ולחץ "הבא."
    6. לבחור 1 מ מ כגודל ספוט על-ידי לחיצה על לחצן עגול. בחרו ' מיקרומטר 500 המרווח ספוט אשר הרווח בין שני מרכזים המקומות הסמוכים. לחץ על הסמל במחשבון כדי לחשב את המספר הכולל של כתמים שנוצרו, שאמור להיות 231. לחץ על "הבא".
    7. הגדר את מצב מספור ספוט ידי לחיצה פעם אחת על זה. לחץ על הכפתור "להגדיר" כדי ליצור רשתות ורשתות משנה. מחק את השורה המרכזית (קו 6) ואת העמודות 8 ו- 15. לשמור על 3 נקודות של קו 1 לאוריינטציה. המפה הסופית צריכה להקיף את המספר הכולל של נקודות 183, כפי שמוצג באיור2.
    8. להגדיר את רשימת סוגי רקמות: גישה דרך תפריט File > ניו > רשימת סוגי רקמות או על-ידי שימוש ב- CTRL + ל'
    9. הכנס את התיאורים רקמה שהוגדרה קודם לכן. הקש על חץ למטה או לחץ על הכפתור + כדי להוסיף קו.
    10. הגדרת הפרויקט: גישה דרך תפריט File > ניו > פרוייקט המאיץ או על-ידי שימוש ב- CTRL + פ
    11. מילוי בשם מערך רקמות, הערות ומחבר ולאחר מכן לחץ על "הבא". ייבא את קובץ הגיליון האלקטרוני רשימת סוגי רקמות, המודל מערך רקמות שנוצרו בעבר על-ידי לחיצה על סמלים נאותה.
    12. לחץ על "בחר הכל" ולהגדיר את מספר נקודות עבור כל סוג הרקמה; לחץ על לחצן "שידוך" כדי להחיל הגדרות. תופיע טבלה רישום המספר הכולל של ליבות אשר ניתן לטעום להעביר בלוקים הנמען בפרויקט זה. שמור את הפרויקט, לסגור את התוכנית.
  3. הכינו את גושי מקבל (איור 1B).
    1. מילוי תבניות מתכת נקי עם פרפין אלסטית-65 מעלות צלזיוס.
    2. להשאיר את אבני פרפין להתקרר בטמפרטורת החדר למשך הלילה בתוך התבניות מתכת.
    3. לחלץ את אבני פרפין מתוך תבניות מתכת. אם התרחשה סדקים, למחוק את הבלוק וחזור על שלבים 2.3.1-2.3.3.
  4. לבנות את TMA באמצעות arrayer אוטומטית או חצי אוטומטית19.
    1. אחזר כל נבחרת FFPE רחובות של הסעיפים המתאימים H & E עם ביאורים.
    2. להפעיל את arrayer והכנס את גושי מקבל על הקרוסלה arrayer.
    3. לפתוח את התוכנה תחנת הבקרה arrayer, לחץ על "מערך רקמות חדשות", ולטעון את הפרוייקט שנוצרו בעבר (איור 1C).
    4. לחץ על "המשך", בחר את המיקום של גושי תורם התפריט.
    5. הגדרת המיקום ההתחלתי על כל בלוק הנמען: השתמש במקשי החצים כדי להזיז את אור הלייזר ליישר אותו עם הקצה השמאלי העליון על פרפין הרחוב הנמען.
    6. לחץ על "הבא" וחזור על היישור האנכי.
    7. לחץ על "הבא" כדי ליצור באופן אוטומטי חור ב הקואורדינטה שהוגדרו בעבר הרחוב נמען (מקבל).
    8. רוקן את האגרוף.
    9. מקם את הבלוק התורם לדיגום ולהסיר ליבה של רקמות מן האזור בעבר מוערת של עניין.
    10. הכנס התורם רקמות הליבה לתוך החור בבלוק נמען (מקבל).
    11. הסר את הבלוק תורם arrayer.
    12. חזור על צעדים 2.4.5-2.4.11 עד TMA השלמת.
  5. מכניסים את הצד רקמות של גוש TMA החדש שנוצר בשקופית הריקה סטרילי ומניחים בתנור המעבדה על 45 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
  6. לחץ בעדינות את הבלוק על השקופית עבור 5 s כדי לשטח את הליבות רקמות. חזור על פעם אחת (עבור סכום כולל של פי 2).
  7. להסיר את החסימה TMA יחד עם השקופית מהתנור, להפוך אותם ולנתק בעדינות הרחוב של השקופית.
  8. לכסות את המשטח רקמות TMA עם שכבה דקה של פרפין אלסטית-65 מעלות צלזיוס.
  9. יוצאים לרחוב TMA בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  10. להעביר את גוש TMA-4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
    הערה: הרחוב TMA שניתן לאחסן ב 4 ° C עד תשישות.

3. פתולוגיה וניתוחים Immunohistochemical

  1. חותכים למקטעים TMA.
    1. הנח את גושי מקבל TMA עם הצד הפרפין למטה על משטח-10 ° C למשך 10 דקות להרגע הפרפין.
    2. למלא אמבט ציפה במים הנדסה גנטית והגדר חום 38 מעלות צלזיוס.
    3. במקום להב חדש על מיקרוטום סיבוביים והכנס את הבלוק לתוך הצ'אק מיקרוטום אז הבלוק שעווה פונה הלהב, מיושר במישור האנכי.
    4. גש לרחוב בזהירות עם הלהב ולחתוך כמה חלקים דקים כדי להבטיח שמיקום נכון; התאם במידת הצורך.
    5. לחתוך 3 סעיפים מיקרומטר-עבה.
    6. לאסוף את הסעיפים באמצעות פינצטה ולממן אותם על פני השטח אמבט מים.
    7. לבחור את המקטעים החוצה המים הרותחים בשקופיות זכוכית רגילה ו- IHC/איש.
    8. מקם את השקופיות על מתלה ולאחסן אותם בתנור ב 45 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
      הערה: לאחר מוכן, הסעיפים TMA צריך להיות מוכתם בתוך 24 שעות.
  2. לבצע צביעת פתולוגיה (H & E) באמצעות של autostainer.
    1. הוסף את השקופיות בארון autostainer ולמקם אותם ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. פתח את המגירה עומס של autostainer ושל הוספה שהאצטבה עם הלאמה שקופיות באחת התחנות טעינה עם תקן H & E סרטון גוחנת.
    3. ברגע המגירה סגורה, הקליפ יזוהו באופן אוטומטי על ידי המערכת, הפרוטוקול הבא יתחיל: תנור בתחנת 37 ° C (6 דקות), קסילן (2 דקות), קסילן (2 דקות), אתנול 100% (2 דקות), אתנול 100% (2 דקות), אתנול 95% (2 דקות), אתנול 95% (2 דקות) , מזוקק מים (4 דקות) של Carazzi hematoxylin (9 דקות), מים זורמים בלחץ נמוך (2 דקות), אאוזין 1% (1דקות.), מים זורמים בלחץ נמוך (2 דקות), אתנול 95% (20 s), אתנול 95% (20 s), אתנול 95% (20 s), אתנול 95% (20 s), אתנול 100% (15 s), אתנול 100% (15 s) , קסילן (30 s), קסילן (30 s).
    4. לפרוק את המדפים ממגירת והר השקופית עם מכסה.
      1. לאסוף את טיפת הר עם פיפטה ושים אותו הקצה החיצוני של השקופית כיסוי.
      2. למקם את הצד הרטוב של תגית כיסוי בשקופית ולתת את הר יבש למשך 30 דקות.
  3. לבצע IHC צביעת חדר המיון, יחסי ציבור, Ki67 של HER2 באמצעות של immunostainer אוטומטית.
    הערה: לפני שמתחילים לרוץ מוכתמים, להפעיל את המערכת, תבדקי את המכלים ריאגנט מתכלים (טבלה של חומרים), פסולת מכולות.
    1. מקם את השקופיות TMA לנתח ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הפעל את כלי הנגינה immunostainer והתוכנה.
    3. על התצוגה הבית, לחץ על לחצן פרוטוקולים ולאחר מכן לחץ על יצירת/עריכת פרוטוקולים.
    4. בחר את תקן DAB (3, 3'-diaminobenzidine) IHC ההליך כדי לשנות את תבנית בסיסית.
    5. דגל "Deparaffinization" ברשימת התיבה ולהגדיר את הטמפרטורה בינוני-72 מעלות צלזיוס.
    6. דגל הפתרון גם ההומניסטית והאוטונומית cc1, השוכן הטמפרטורה בינוני 95 ° C, ואת זמן הדגירה-36 דקות.
    7. בדגל בתיבת נוגדן ראשוני, להוסיף את המזהה של מנפק מוטבעת ER (כלי התוכנה תזהה מנפק על הקרוסלה ריאגנט) וקבע זמן הדגירה-16 דקות.
    8. לסמן את התיבה Counterstaining, בחר Hematoxylin אני, והינו ממוקם זמן הדגירה-12 דקות.
    9. לחץ על לחצן "שמירה בשם" ותנו שם הפרוטוקול.
    10. חזור על 3.3.3-3.3.9 את השלבים עבור הנוגדנים הנותרים בעזרת נוגדנים העיקרי הדגירה שעות: PR 16 דקות, Ki67 16 דקות ו- HER2 12 מינימלית להשתמש נוגדנים מראש מדולל מוכן לשימוש (RTU).
    11. התצוגה הבית, לחץ על לחצן צור תווית.
    12. לחץ על לחצן פרוטוקולים ולהוסיף את הפרוטוקולים ER, יחסי ציבור, Ki67 ו- HER2 עבור כל אחד TMA לנתח.
    13. לחץ על לחצן סגור /Print.
    14. כתווית התבנית מופיעה, הזן מזהי TMA עבור התווית.
    15. לחץ על לחצן ' הדפס ' כדי להדפיס את התוויות ולאחר מכן להחילם על השקופיות TMA.
    16. לחץ על סמל הכלי והגדר את מצב ההפעלה כלי כמו "מוכן".
    17. . פתח את המכסה שמכסה את הקרוסלה ריאגנטים למקם מערכת איתור, נוגדנים ראשוני, ולאחר מכן סגור את מכסה המנוע.
    18. לחץ על לחצן קבלה על מגירה שקופית כדי לפתוח אותו, לטעון את השקופיות TMA סגור את המגירה על-ידי לחיצה על אותו לחצן.
    19. הגדר את מצב ההפעלה כלי כמו "רצים" ובצע את ההוראות.
    20. בסוף unload לרוץ, TMA השקופיות על-ידי הקשת את מגירות פתוחות עם לחצן שקופיות שהושלמו על הכלי שליטה שקופית ולאחר מכן לשטוף אותם חמים סבון ומים כדי להסיר כל ריאגנטים הנותרים.
    21. לשטוף את השקופיות תחת קר בלחץ נמוך מים זורמים, מייבשים את השקופיות TMA ולהחיל על coverslip זכוכית לכל שקופית.
  4. ביצוע ניתוח IHC של חדר המיון, PR ו- HER2 בעקבות את האמריקאי האגודה לאונקולוגיה קלינית (ASCO) / קאפ הנחיות, ושל Ki67 לפי ההמלצות של Ki67 הבינלאומי בקבוצת עבודה (טבלה 2) של סרטן השד.
    הערה: ניתוח זה צריכה להתבצע בנפרד בהמקומות רקמות דיסקרטית על ידי פתולוג עם חוויה בפתולוגיה השד.
    1. להעריך את הביטוי ER חיובי אם ≥ 1% גידול התא גרעינים immunoreactive20,21,22,23.
    2. להעריך את הביטוי PR חיוביים אם ≥ 1% גידול התא גרעינים immunoreactive20,21,22,23.
    3. להעריך את הביטוי HER2 כמו: a) ציון 3 + אם קרום במבניו מכתים את זה מלא ואינטנסיבי, ב) ציון 2 + אם קרום במבניו מכתים הוא לא שלם ו/או חלש/בינונית ותוך > 10% של תאים גידול פולשני או מלא, קרום במבניו מכתים הוא אינטנסיבי ובתוך ≤ 10% של תאי גידול פולשני, c) ציון 1 + אם קרום לא הושלמה צביעת הוא חלש/בקושי מורגש ובתוך > 10% של תאי גידול פולשני, d) שלילי אם לא מכתים קיים או קרום צביעת הוא חלש/בקושי מורגש ולא שלם, בתוך ≤ 10% של הגידול פולשנית תאים3,24.
    4. להעריך את האינדקס Ki67 כפי האחוז של תאים עם גרעיני מכתים בתאים אמצעים לפחות 1,000 באופן אקראי שנבחרו שדות ובעוצמת מעל 10 (הגדלה, 400 X)25.

4. SISH ניתוח של HER2

  1. חותכים TMA מקטעים (וחזור על שלב מספר 3.1).
  2. לבצע SISH עבור HER2 באמצעות של immunostainer אוטומטית.
    1. מקם את השקופיות TMA לנתח ב 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    2. הפעל את כלי הנגינה immunostainer והתוכנה.
    3. על התצוגה הבית, לחץ על לחצן פרוטוקולים ולאחר מכן לחץ על יצירת/עריכת פרוטוקולים.
    4. בחר את ההליך "U CKT איש כפול" כדי לשנות את תבנית הבסיס.
    5. דגל "ייבוש" ברשימת התיבה ולהגדיר את הטמפרטורה ב 63 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
    6. דגל "מיזוג התא" ברשימת התיבה, ואז "תא מיזוג CC2", ולהגדיר את הטמפרטורה בזמן 86 ° C ו דגירה-4 דקות.
    7. דגל CC2 מתון (מחזור 1) תקן (מחזור 2), מורחב (מחזור 3) במשך 8 דקות, 12 דקות ו- 8 דקות, בהתאמה.
    8. דגל "איש-פרוטאז 3" ברשימת התיבה ולקבוע זמן הדגירה-16 דקות.
    9. בחר את הגששים HER2DNP ו- CHR17DIG ולהגדיר זמן הדגירה ב 6-אייץ '.
    10. הגדר את הכביסה ב 76 ° C במשך 8 דקות.
    11. להגדיר את זמן הדגירה של SISH multimer (סיל איש DNP HRP) 32 min.
    12. להגדיר זמן הדגירה chromogen כסף (סיל איש DNP CHRC) ב 4 דקות.
    13. לקבוע זמן הדגירה multimer אדום (אדום איש לחפור AP) 24 min.
    14. לקבוע זמן הדגירה chromogen אדום (אדום איש לחפור FR) 8 דקות.
    15. הדגל "Counterstaining" ברשימת התיבה, בחר "HEMATOXYLIN II", ולהגדיר זמן הדגירה ב 8 דקות.
    16. דגל "Counterstaining פוסט" בתיבה, בחר "הכחלת ריאגנט" ולאחר להגדיר זמן הדגירה ב- 4 דקות.
    17. חזור על שלבים של 3.3.11-3.3.15 (בחר שונה U כפול איש CKT לפרוטוקול).
    18. פתוח למכסה שמכסה את הקרוסלה ריאגנטים, למקם את הכביסה ומערכות איתור איש, אז סגור את מכסה המנוע.
    19. חזור על שלבים של 3.3.18-3.3.21.
  3. לבצע ניתוח SISH עבור HER2: להעריך את ההגברה ג'ין HER2 חיובי אם היחס /CEP17 HER2הוא ≥2.0 עם ממוצע HER2 עותק מספר ≥4.0 אותות בכל תא, ושלילי אם היחס /CEP17 HER2< 2.0 עם ממוצע HER2 להעתיק מספר < 4.0 אותות תא3,24.
    הערה: בדומה IHC, ניתוח זה לבצע בנפרד בהמקומות רקמות דיסקרטית פתולוג בעל ניסיון בתחום הפתולוגיה של השד.

תוצאות

מקצה לקצה, 444 שד פולשני סרטן סופחו 15 ניסית אותו בעבר הממוטבות במיוחד איש ניתוחים. בין המקומות 2,664 שנדגמו, 2,651 (99.5%) נציג של האזורים שנבחרו קודם לכן, ולכן נחשבת לשכנוע ניתוחים שלאחר מכן. אינטרה-גידול הטרוגניות נקבע על-ידי IHC ולאחר SIH, עם דגש מיוחד על חלוקות הטרוגנית של HER2 חיובי ש...

Discussion

. הנה, שתוארו האסטרטגיות מעבדה לביצוע ניתוחים SISH של הגן HER2 ו שלה צנטרומר המתאימה בניסית אותו בעבר לתפוקה גבוהה של סרטן השד heterogeneously מעובד. שיטה זו היא חסכונית, יכול להתבצע במעבדות רוב לצורך המחקר של HER2 הטרוגניות ג'ין הגברה ב קוהורטות גדולות של השד סרטן לאחזר טופס פתולוגיה ארכיונים....

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים של אינטרסים.

Acknowledgements

. לא-

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU39601006Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solutionBio Optica, Milan, Italy, EU510002Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylinBio Optica, Milan, Italy, EU506012Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond qualityLaboindustria, Arzergrande, Italy, EU3353326x76 mm microscope slides
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU14046430011Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slidesAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRAVentana medical system, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSSlide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4324Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4286Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4493Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-500Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4149Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
HematoxylinVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2021Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II CounterstainingVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2208Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagentVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2037Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EURM 2255Automated rotary microtome
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUST 5020Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUK080254Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base MoldSakura Finetek Europe B.V7055Stainless-Steel base metal mold

References

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
  2. Montemurro, F., Scaltriti, M. Biomarkers of drugs targeting HER-family signalling in cancer. J Pathol. 232 (2), 219-229 (2014).
  3. Wolff, A. C., et al. Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update. J Clin Oncol. 31 (31), 3997-4013 (2013).
  4. Ng, C. K., Pemberton, H. N., Reis-Filho, J. S. Breast cancer intratumor genetic heterogeneity: causes and implications. Expert Rev Anticancer Ther. 12 (8), 1021-1032 (2012).
  5. Vance, G. H., et al. Genetic heterogeneity in HER2 testing in breast cancer: panel summary and guidelines. Arch Pathol Lab Med. 133 (4), 611-612 (2009).
  6. Murthy, S. S., et al. Assessment of HER2/Neu status by fluorescence in situ hybridization in immunohistochemistry-equivocal cases of invasive ductal carcinoma and aberrant signal patterns: a study at a tertiary cancer center. Indian J Pathol Microbiol. 54 (3), 532-538 (2011).
  7. Ohlschlegel, C., Zahel, K., Kradolfer, D., Hell, M., Jochum, W. HER2 genetic heterogeneity in breast carcinoma. J Clin Pathol. 64 (12), 1112-1116 (2011).
  8. Chang, M. C., Malowany, J. I., Mazurkiewicz, J., Wood, M. 'Genetic heterogeneity' in HER2/neu testing by fluorescence in situ hybridization: a study of 2,522 cases. Mod Pathol. 25 (5), 683-688 (2012).
  9. Bartlett, A. I., et al. Heterogeneous HER2 gene amplification: impact on patient outcome and a clinically relevant definition. Am J Clin Pathol. 136 (2), 266-274 (2011).
  10. Seol, H., et al. Intratumoral heterogeneity of HER2 gene amplification in breast cancer: its clinicopathological significance. Mod Pathol. 25 (7), 938-948 (2012).
  11. Hanna, W. M., et al. HER2 in situ hybridization in breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and genetic heterogeneity. Mod Pathol. 27 (1), 4-18 (2014).
  12. Sanguedolce, F., Bufo, P. HER2 assessment by silver in situ hybridization: where are we now?. Expert Rev Mol Diagn. 15 (3), 385-398 (2015).
  13. Fusco, N., et al. The Contrasting Role of p16Ink4A Patterns of Expression in Neuroendocrine and Non-Neuroendocrine Lung Tumors: A Comprehensive Analysis with Clinicopathologic and Molecular Correlations. PLoS One. 10 (12), e0144923 (2015).
  14. Albanghali, M., et al. Construction of tissue microarrays from core needle biopsies - a systematic literature review. Histopathology. 68 (3), 323-332 (2016).
  15. Navani, S. Manual evaluation of tissue microarrays in a high-throughput research project: The contribution of Indian surgical pathology to the Human Protein Atlas (HPA) project. Proteomics. 16 (8), 1266-1270 (2016).
  16. Fusco, N., et al. HER2 in gastric cancer: a digital image analysis in pre-neoplastic, primary and metastatic lesions. Mod Pathol. 26 (6), 816-824 (2013).
  17. Amin, M. B., et al. . AJCC Cancer Staging Manual. , (2017).
  18. Lakhani, S. R., Ellis, I. O., Schnitt, S. J., Tan, P. H., van de Vijver, M. J. . WHO Classification of Tumours of the Breast. , (2012).
  19. Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat Med. 4 (7), 844-847 (1998).
  20. Fusco, N., et al. Resolving quandaries: basaloid adenoid cystic carcinoma or breast cylindroma? The role of massively parallel sequencing. Histopathology. 68 (2), 262-271 (2016).
  21. Fusco, N., et al. Genetic events in the progression of adenoid cystic carcinoma of the breast to high-grade triple-negative breast cancer. Mod Pathol. 29 (11), 1292-1305 (2016).
  22. Fusco, N., et al. Recurrent NAB2-STAT6 gene fusions and oestrogen receptor-α expression in pulmonary adenofibromas. Histopathology. 70 (6), 906-917 (2017).
  23. Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College Of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer. J Clin Oncol. 28 (16), 2784-2795 (2010).
  24. Fusco, N., Bosari, S. HER2 aberrations and heterogeneity in cancers of the digestive system: Implications for pathologists and gastroenterologists. World J Gastroenterol. 22 (35), 7926-7937 (2016).
  25. Dowsett, M., et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer working group. J Natl Cancer Inst. 103 (22), 1656-1664 (2011).
  26. Dekker, T. J., et al. Determining sensitivity and specificity of HER2 testing in breast cancer using a tissue micro-array approach. Breast Cancer Res. 14 (3), R93 (2012).
  27. De Sio, G., et al. A MALDI-Mass Spectrometry Imaging method applicable to different formalin-fixed paraffin-embedded human tissues. Mol Biosyst. 11 (6), 1507-1514 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1302 HER2microarray

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved