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  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Distribución heterogénea de células HER-2 positivo se puede observar en un subgrupo de cánceres de mama y genera dilemas clínicos. Aquí, presentamos un protocolo fiable y rentable para definir, cuantificar y comparar la heterogeneidad genética de la intra-tumor HER2 en una serie grande de los cánceres de mama heterogéneo procesados.

Resumen

Terapias dirigidas contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2) han cambiado radicalmente el resultado de pacientes con cáncer de mama positivo para HER2. Sin embargo, una minoría de casos muestra una distribución heterogénea de células HER-2 positivo, que genera grandes desafíos clínicos. Hasta la fecha, no hay protocolos confiables y estandarizados para la caracterización y cuantificación de la amplificación del gen HER2 heterogénea en grandes cohortes se han propuesto. Aquí, presentamos una metodología de alto rendimiento para evaluar simultáneamente el estado de HER2 en diferentes áreas topográficas de múltiples cánceres de mama. En particular, nos ilustran el procedimiento de laboratorio para la construcción de microarreglos de tejido mejorado (TMAs) incorporando una asignación específica de los tumores. Todos los parámetros de TMA se han optimizado específicamente para la plata en situ hibridación (SISH) de formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) tejidos del pecho. El análisis de Immunohistochemical de los biomarcadores pronósticos y predictivos (es decir, ER, PR, Ki67 y HER2) debe realizarse mediante los procedimientos automatizados. Se ha implementado un protocolo personalizado de SISH para permitir un análisis molecular de alta calidad a través de múltiples tejidos que experimentaron diferentes procedimientos de fijación, procesamiento y almacenamiento. En este estudio, le ofrecemos una prueba de principio que secuencias específicas de ADN podrían ser cánceres localizados simultáneamente en distintas zonas topográficas de múltiple y heterogéneo procesados usando un método eficiente y rentable.

Introducción

HER2 es un proto-oncogene que se sobreexpresa y amplificado en 15-30% de todos cánceres de mama invasivo1,2. Sobreexpresión de HER2 se infiere por la presencia de > 10% células con membrana fuerte inmunohistoquímica (IHC) tinción (3 +), mientras que la amplificación del gen pueden ser evaluada cuando el número de copias del gen es ≥6, o el HER2/centrómero es ≥ 2 en el recuento en por lo menos 20 células por en situ hibridación (ISH)3.

Heterogeneidad genética intra-tumor ha sido ampliamente descrito en los cánceres de mama, siendo un colaborador potencialmente adverso para la evaluación de biomarcadores y tratamientos respuesta4. Según el Colegio de patólogos americanos (CAP), HER2 heterogeneidad existe si HER2 está amplificado en > 5% y < 50% del tumor de la infiltración de las células5. Lamentablemente, la incidencia real de la heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama sigue siendo un tema de controversia entre patólogos, con algunos autores mantienen es un evento extremadamente raro, y otros que sugieren que hasta un 40% de los casos son HER2-heterogénea1,5,6,7,8,9,10. A pesar de los mecanismos biológicos que sostienen esta condición no son todavía completamente aclarado, los impactos clínicos y pronósticos de la heterogeneidad de HER2 del tumor intra son cruciales para el de pacientes de cáncer de mama11.

Recientemente, técnicas moleculares de campo brillante, como ISH cromogénica (CISH) y ISH plata (SISH), han surgido como métodos confiables para detectar heterogeneidad de HER2 en los tejidos FFPE, con algunas ventajas en comparación con a fluorescente ISH (pescado)12. Lamentablemente, el análisis de a granel de casos individuales sigue siendo poco práctico en estudios de grandes cohortes. Varios grupos han sugerido que la combinación de histoquímica, IHC y ISH con tecnologías TMA podría representar una estrategia valiosa en el estudio de cáncer biología13,14,15,16. Con este método ampliamente adoptado, las muestras de tejido de diferentes pacientes pueden analizarse al mismo tiempo, minimizar el tejido y los reactivos empleados y así fomentar el análisis uniforme de una serie grande de casos14. Sin embargo, no hay protocolos están disponibles para la caracterización molecular simultánea de alto rendimiento de múltiples muestras de tejido que experimentó diferentes de procesamiento en cuanto a reactivos, fijación de tiempos y métodos de conservación empleados, tales como archivo bloques.

Dada las implicaciones clínicas y pronósticas de heterogeneidad espacial de HER2 en cáncer de mama, hemos desarrollado una plataforma integrada de molecular para evaluar en series grandes de casos procesados heterogéneo. Aquí, describen las estrategias de laboratorio para generar y analizar la heterogeneidad intra-tumor de amplificación de HER2 en TMAs de alto rendimiento de cáncer de mama por medio de SISH. El siguiente protocolo ha sido desarrollado para medir los tumores > 5 mm (> pT1b según el TNM 2017)17. Para lesiones más pequeñas, se recomienda realizar el análisis en las secciones seriales Full-Face. Nuestro procedimiento permite el análisis simultáneo de la IHC y SISH de hasta 30 cáncer de mama, que abarca una media de 6 zonas diferenciadas (rango 4-8) para cada caso. En conjunto, se generarán 180 núcleos de tejido de 1 mm de diámetro, con 500 μm entre los núcleos y de 2 mm entre la cuadrícula y los bordes de cada bloque TMA.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado por las juntas de revisión institucional de IRCCS Ca' Granda Fundación, Hospital Policlínico, Milán, Italia.

1. selección de pacientes y muestras de tejido

  1. Recuperar el archivo diapositivas de todos los casos a ser analizados, incluyendo todas las disponible hematoxilina y eosina (H & E) y diapositivas IHC de la diagnosis original y, si está presente, un H & E de emparejar el tejido mamario no neoplásicas (p. ej., margen quirúrgico) .
  2. Realizar comentarios de caso.
    Nota: Para esta tarea, por lo menos dos patólogos con experiencia en patología mamaria deben discutir las diapositivas diagnóstico y resolver los desacuerdos colegialmente. Utilizar herramientas de telepatología (el último en estudios multicéntricos favorezcan) o un microscopio convencional. Eventualmente, excluir todos los casos discordantes.
    1. Realizar la reclasificación histológica de todos los casos según la última edición de la clasificación de la Organización Mundial de la salud (OMS) de tumores de mama18.
    2. Asegúrese de que el tejido normal para cada caso, si está presente en las muestras clínicas archivísticas, comprende al menos una unidad ductal lobular terminal no neoplásicas.
    3. Identificar todas las zonas neoplásicas que muestra un heterogéneas citológico, arquitectónico, o IHC utilizando un microscopio de campo brillante (a realizar conjuntamente por un patólogo y la realizada que construirá los TMAs).
  3. Resaltar las áreas topográficas discretas con un marcador de la diapositiva de cristal o con la herramienta adecuada en un software de diapositivas digitales (figura 1A).
  4. En base a las diapositivas seleccionadas, recuperar los bloques FFPE correspondientes de los archivos.
    Nota: Para optimizar el TMA de construcción, para evitar el agotamiento del tejido y para preservar el TMA punch integridad estructural, casos con < 1 mm de espesor tejido residual debe ser excluido.

2. diseñar y construir basados en la técnica de Kononen TMAs

  1. Crear y abrir un nuevo archivo de hoja de cálculo incorpora los registros de las distintas áreas de cada caso. Incluir los siguientes datos en columnas separadas, como se ejemplifica en la tabla 1: identificación de caso, bloque ID, ID de área, tipo de tejido (por ejemplo, tejido normal, histotype de componente invasor, en situ componente histotype), topografía (por ejemplo, núcleo de tumor, frente invasivo), morfología (p. ej., grado nuclear, arquitectura, mitosis, características citológicas), estado de biomarcadores (es decir, del receptor del estrógeno (ER), receptor de la progesterona (PR), Ki67 y HER2) y todas las demás IHC características disponibles.
    1. Guardar el documento.
  2. Crear un proyecto TMA.
    1. Instalar y abrir el software de diseñador de TMA.
    2. Definir el destinatario TMA bloques: acceso a través del menú Archivo > Nuevo > bloque o mediante CTRL + B.
    3. Haga clic en el primer campo a llenar o presione la tecla Tab y escriba en las dimensiones de los bloques de parafina: ancho 35 (mm), altura 20 (mm). Tipo "2" como el valor de "margen" (es decir, distancia del borde de la parafina en mm) (figura 1B). Guarde los datos pulsando el botón adecuado. La nueva plantilla de bloque receptor ahora está guardado y listo para ser utilizado en plantillas de matriz de tejido nuevo.
    4. Crear un proyecto de arreglo de discos de tejido: acceso al menú Archivo > Nuevo > matriz de tejido o mediante CTRL + T.
    5. Llenar en el nombre de la matriz tejido, comentarios y el autor, a continuación, haga clic en "siguiente". Haga clic en el icono "importar", elegir el archivo de plantilla de bloque destinatario creado anteriormente y haga clic en "siguiente".
    6. Elegir 1 mm como el tamaño del punto pulsando el botón redondo. Elegir 500 μm como punto espaciado es el espacio entre dos centros de lugares vecinos. Haga clic en el icono de la calculadora para calcular el número total de puntos creado, que debe ser 231. Haga clic en "siguiente".
    7. Definir el modo de numeración de punto haciendo clic una vez en él. Haga clic en el botón "definir" para crear redes y sub redes. Eliminar la línea central (línea 6) y las columnas 8 y 15. Mantener 3 puntos de la línea 1 para la orientación. El mapa final debe abarcar a un número total de 183 puntos, según lo representado en la figura 2.
    8. Definir la lista de tipos de tejidos: acceso a través del menú Archivo > Nuevo > lista de tipos de tejidos o mediante CTRL + L.
    9. Inserte las descripciones de tejido previamente definidas. Presione flecha abajo o haga clic en el botón + para añadir una línea.
    10. Definir el proyecto: acceso a través del menú Archivo > Nuevo > proyecto o mediante CTRL + P.
    11. Llenar en el nombre de la matriz de tejido, comentarios y el autor, a continuación, haga clic en "siguiente". Importar el archivo de hoja de cálculo, lista de tipos de tejido y el modelo de matriz de tejido previamente creado haciendo clic en los iconos apropiados.
    12. Haga clic en "seleccionar todo" y definir el número de puntos para cada tipo de tejido; Haga clic en el botón de "match" para aplicar la configuración. Aparecerá en una tabla el número total de núcleos que serán muestreados y transferida a los bloques receptores en este proyecto. Guarde el proyecto y cerrar el programa.
  3. Preparar el juego del aceptador (figura 1B).
    1. Llenar moldes metálicos limpios con parafina elástica a 65 ° C.
    2. Dejar los bloques de parafina se enfríe a temperatura ambiente durante la noche dentro de los moldes de metal.
    3. Extraiga los bloques de parafina de los moldes de metal. Si se producen grietas, deseche el bloque y repetir pasos 2.3.1-2.3.3.
  4. Construir el TMA con un automatizado o semiautomatizado arrayer19.
    1. Recuperar bloques FFPE todos seleccionados y las secciones correspondientes de la H & E con anotaciones.
    2. Encienda el arrayer e inserte el bloque de aceptador en el carrusel de arrayer.
    3. Abra el software de estación de control de arrayer, haga clic en "Nueva matriz de tejido" y cargue el proyecto creado anteriormente (figura 1).
    4. Haga clic en "Continuar" y seleccione la posición de los bloques de donantes en el menú.
    5. Definir la posición de partida en cada bloque receptor: Utilice las teclas de flecha para mover la luz láser y alinee con el borde superior izquierdo en la parafina del bloque del receptor.
    6. Haga clic en "siguiente" y repita el procedimiento para la alineación vertical.
    7. Haga clic en "siguiente" para crear automáticamente un agujero en la coordenada anteriormente definida del bloque del destinatario (receptor).
    8. Vacíe el golpe.
    9. Coloque el bloque de donantes para el muestreo y eliminar una base de tejido de la zona anteriormente comentada de interés.
    10. Inserte la base de tejido de donante en el agujero en el bloque receptor (aceptador).
    11. Retire el bloque de donantes de la arrayer.
    12. Repita los pasos 2.4.5-2.4.11 hasta que se complete el TMA.
  5. Poner el lateral de tejido de lo bloque TMA recién generado en una diapositiva en blanco estéril y colocar en el horno de laboratorio a 45 ° C durante 5 minutos.
  6. Presione suavemente el bloque sobre el portaobjetos durante 5 s para aplanar los núcleos de tejido. Repetir una vez (para un total de 2 veces).
  7. Retire el bloque TMA junto con la diapositiva del horno, voltearlos y suavemente separar el bloque de la diapositiva.
  8. Cubrir la superficie del tejido TMA con una fina capa de parafina elástica a 65 ° C.
  9. Deje el bloque TMA a temperatura ambiente durante 2 h.
  10. Transferencia del bloque TMA a 4 ° C por 24 h.
    Nota: El bloque TMA puede almacenarse a 4 ° C hasta la extenuación.

3. histoquímica y análisis inmunohistoquímico

  1. Cortar secciones TMA.
    1. Coloque los bloques de aceptador TMA con el lado de la parafina hacia abajo sobre una superficie de-10 ° C durante 10 minutos enfriar la parafina.
    2. Llene una bañera de flotación con agua ultrapura y ajuste calor a 38 ° C.
    3. Coloque una hoja nueva en un micrótomo rotatorio e Inserte el bloque en el mandril para Microtomo para que el bloque de cera enfrenta a la hoja y se alinea en el plano vertical.
    4. Acercarse cuidadosamente el bloque con la cuchilla y cortar algunas secciones delgadas para asegurar que la colocación es correcta; ajustar si es necesario.
    5. Cortar 3 tramos de μm de espesor.
    6. Recoger las secciones con pinzas y flotan en la superficie del baño de agua.
    7. Escoger las secciones al baño de agua en el portaobjetos de vidrio regular e IHC/ISH.
    8. Coloque el portaobjetos sobre una rejilla y guardar en el horno a 45 ° C durante la noche.
      Nota: Una vez preparado, deben mancharse las secciones TMA dentro de 24 h.
  2. Realizar coloración histoquímica (H & E) con un autostainer.
    1. Inserte las diapositivas en el rack de reactivos autostainer y colocarlos a 60 ° C durante 10 minutos.
    2. Abra el cajón de carga del autostainer e inserte que la rejilla con el TMA se desliza en una de las estaciones de carga con un clip estándar de H & E, hacia el exterior.
    3. Una vez que se cierra el cajón, el clip será reconocido automáticamente por el sistema y comenzará el siguiente protocolo: estación de horno a 37 ° C (6 min), xileno (2 min), xileno (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 100% (2 min), etanol 95% (2 min), etanol 95% (2 min) , agua destilada agua (4 min), hematoxilina de Carazzi (9 min), baja presión agua corriente (2 min), eosina 1% (1 minuto), presión agua corriente (2 min), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), etanol 95% (20 s), 100% de etanol (15 s), etanol 100% (15 s) , xileno (30 s), xileno (30 s).
    4. Extraiga las rejillas del cajón y montar el portaobjetos con un cubreobjetos.
      1. Recoger una gota de Monte con una pipeta y colocar un borde exterior de la diapositiva de cubierta.
      2. Coloque el lado húmedo del cubreobjetos sobre el portaobjetos y dejar el monte seco durante 30 minutos.
  3. Realizar tinción de IHC de ER, PR, Ki67 y HER2 mediante un immunostainer automatizado.
    Nota: Antes de comenzar una carrera de tinción, el sistema y compruebe las botellas de reactivos consumibles (Tabla de materiales) y contenedores de residuos.
    1. Coloque las diapositivas TMA para analizar a 60 ° C durante 10 minutos.
    2. Iniciar el instrumento de immunostainer y software.
    3. En la vista de inicio, haga clic en el botón de protocolos y haga clic en crear/editar los protocolos.
    4. Seleccione el estándar DAB (3, 3'-diaminobenzidina) procedimiento IHC para modificar la plantilla básica.
    5. Bandera de "Parafina" en el cuadro de lista y seleccione la temperatura del medio a 72 ° C.
    6. Bandera la solución desenmascarar cc1, ajustar la temperatura del medio a 95 ° C y el tiempo de incubación en el minuto 36.
    7. Bandera de la caja del anticuerpo primario, introduzca el ID de la distribuidora en línea de ER (el software del instrumento reconocerá el dispensador en el carrusel de reactivos) y establecer el tiempo de incubación en el minuto 16.
    8. Bandera de la caja de la contratinción, seleccione hematoxilina I y sistema el tiempo de incubación en 12 minutos.
    9. Haga clic en el botón "Guardar como" y el nombre del protocolo.
    10. Repita los pasos 3.3.3-3.3.9 para los restantes anticuerpos usando los tiempos de incubación de anticuerpos primarios siguientes: PR 16 min, min 16 Ki67 y HER2 12 minutos utilizan anticuerpos previamente diluida lista para usar (RTU).
    11. En la vista de inicio, clic en crear etiqueta.
    12. Haga clic en el botón de protocolos y añadir los protocolos de ER, PR, Ki67 y HER2 para cada uno de lo TMA para analizar.
    13. Clic en el botón Cerrar /Print.
    14. Como la etiqueta de plantilla aparece, introduzca el ID de TMA para el sello.
    15. Haga clic en el botón Imprimir para imprimir las etiquetas y luego aplicarlos en las diapositivas TMA.
    16. Haga clic en el icono de instrumento y establecer el modo de inicio de instrumento como "Listo".
    17. Abra el capó que cubre el carrusel de reactivos, colocar el sistema de detección y anticuerpos primarios, entonces cierre la cubierta.
    18. Haga clic en el botón frontal en un cajón deslizante abra, cargue los portaobjetos TMA y cerrar el cajón pulsando el mismo botón.
    19. Establecer el modo de inicio de instrumento como "funcionamiento" y siga las instrucciones.
    20. Al final de la ejecución, descarga el TMA se desliza presionando el abrir todos los cajones con enjuague y botón de diapositivas completa en el instrumento de Control diapositiva en calientan con agua jabonosa para eliminar cualquier resto reactivos.
    21. Lavar los portaobjetos con baja presión agua fría, deshidratar las diapositivas TMA y aplica un cubreobjetos de cristal a cada diapositiva.
  4. Realizar análisis de IHQ de ER, PR y HER2 después de la sociedad americana de oncología clínica (ASCO) / directrices, del casquillo y de Ki67 según las recomendaciones de la Internacional Ki67 en grupo de trabajo de cáncer de mama (tabla 2).
    Nota: Este análisis debe realizarse por separado en los puntos discretos del tejido por un patólogo con experiencia en patología mamaria.
    1. Evaluar la expresión de ER como positiva si ≥ 1% de núcleos de células del tumor son immunoreactive20,21,22,23.
    2. Evaluar la expresión de PR como positiva si ≥ 1% de núcleos de células del tumor son immunoreactive20,21,22,23.
    3. Evaluar la expresión de HER2 como: a) score 3 + si membrana periférica tinción completa e intensa, b) puntuación 2 + si tinción de membrana circunferencial es incompleta o débil a moderada y > 10% de las células del tumor invasivo o completa y tinción de membrana circunferencial es intenso y ≤ 10% de las células del tumor invasivo, c) puntuación 1 + si membrana incompleta tinción es débil, apenas perceptible y a > 10% de las células del tumor invasivo, días) negativo si hay ninguna coloración o membrana la coloración es incompleta y débil, apenas perceptible y dentro ≤ 10% del tumor invasivo las células3,24.
    4. Evaluar el índice Ki67 como el porcentaje de células con tinción nuclear en las células neoplásicas por lo menos 1.000 aleatoriamente seleccionado más de 10 campos de alta potencia (aumento de 400 X)25.

4. SISH análisis de HER2

  1. Cortar secciones TMA (Repita el paso 3.1).
  2. Realizar SISH para HER2 mediante un immunostainer automatizado.
    1. Coloque las diapositivas TMA para analizar a 60 ° C durante 10 minutos.
    2. Iniciar el instrumento de immunostainer y software.
    3. En la vista de inicio, haga clic en el botón de protocolos y haga clic en crear/editar los protocolos.
    4. Seleccione el procedimiento de "CKT de ISH doble U" para modificar la plantilla básica.
    5. "Secado" de la bandera en la lista del cuadro y ajustar la temperatura a 63 ° C por 20 min.
    6. "Condicionamiento de la célula" de la bandera en la lista del cuadro, luego "célula acondicionado CC2" y ajustar la temperatura a 86 ° C y la incubación tiempo en 4 minutos.
    7. Bandera de CC2 suave (ciclo 1), estándar (ciclo 2) y extendida (ciclo 3) 8 minutos, 12 minutos y 8 minutos, respectivamente.
    8. Bandera de "ISH-proteasa 3" en la lista del cuadro y el tiempo de incubación en 16 min.
    9. Seleccione las puntas de prueba HER2DNP y CHR17DIG y establezca el tiempo de incubación en 6 h.
    10. Establezca el lavado a 76 ° C por 8 minutos.
    11. Establecer el tiempo de incubación de SISH multimer (SIL ISH DNP HRP) en el minuto 32.
    12. Establecer el tiempo de incubación de plata cromógeno (SIL ISH DNP CHRC) en 4 minutos.
    13. Establecer el tiempo de incubación de multimer rojo (rojo ISH DIG AP) en el minuto 24.
    14. Establecer el tiempo de incubación de cromógeno rojo (rojo ISH cavar FR) en 8 minutos.
    15. Bandera "contratinción" en el cuadro de lista, seleccione "Hematoxilina II" y establezca el tiempo de incubación en 8 minutos.
    16. Bandera "la contratinción de acuerdo" en el cuadro de lista, seleccione "Reactivo de azulado" y establecer el tiempo de incubación en 4 minutos.
    17. Repita los pasos de 3.3.11-3.3.15 (select modificado protocolo U Dual ISH CKT).
    18. Abierto el capó que cubre el carrusel de reactivos, colocar la ropa y los sistemas de detección de ISH, entonces cerrar la capota.
    19. Repita los pasos de 3.3.18-3.3.21.
  3. Realizar análisis SISH HER2: evaluar la amplificación del gen HER2 positivo si la relación de /CEP17 de HER2es ≥2.0 con un promedio HER2 copia número ≥4.0 las señales por la célula y negativo si la proporción de /CEP17 de HER2es < 2.0 con un promedio de HER2 Copiar número < 4.0 señales celular3,24.
    Nota: Similar a IHC, este análisis debe realizarse por separado en los puntos discretos del tejido por un patólogo con experiencia en patología mamaria.

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Resultados

En general, 444 mama invasivo cáncer se incorporaron 15 TMAs optimizados específicamente para análisis ISH. Entre los 2.664 puntos muestreados, 2.651 (99.5%) eran representativos de las áreas previamente seleccionadas y por lo tanto se considera favorable para análisis posteriores. Heterogeneidad intra-tumor se determinó por medio de IHC y SIH, con un enfoque particular sobre la heterogénea distribución de clones de HER2-positivo en las distintas áreas topográficas de los tumore...

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Discusión

Aquí, hemos detallado las estrategias de laboratorio para realizar análisis SISH del gene HER2 y su centrómero correspondiente en TMAs de alto rendimiento de cánceres de mama heterogéneo procesados. Este método es rentable y puede llevarse a cabo en la mayoría de los laboratorios para el estudio de la heterogeneidad de amplificación del gen HER2 en cohortes grandes de los archivos de patología de mama cáncer obtenido forma.

Debido a la importancia clínica de HER2 e...

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Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Ninguno.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU39601006Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solutionBio Optica, Milan, Italy, EU510002Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylinBio Optica, Milan, Italy, EU506012Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond qualityLaboindustria, Arzergrande, Italy, EU3353326x76 mm microscope slides
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU14046430011Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slidesAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRAVentana medical system, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSSlide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4324Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4286Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4493Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-500Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4149Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
HematoxylinVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2021Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II CounterstainingVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2208Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagentVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2037Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EURM 2255Automated rotary microtome
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUST 5020Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUK080254Image capture device - digital pathology scanner
Tissue-Tek III Uni-CassetteSakura Finetek Europe B.V4135Cassette
Tissue-Tek Paraform Standard Base MoldSakura Finetek Europe B.V7055Stainless-Steel base metal mold

Referencias

  1. Allison, K. H., Dintzis, S. M., Schmidt, R. A. Frequency of HER2 heterogeneity by fluorescence in situ hybridization according to CAP expert panel recommendations: time for a new look at how to report heterogeneity. Am J Clin Pathol. 136 (6), 864-871 (2011).
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