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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive può essere osservato in un sottogruppo di tumori al seno e genera dilemmi clinici. Qui, presentiamo un protocollo affidabile ed economico per definire, quantificare e confrontare eterogeneità genetica intra-tumore di HER2 in un'ampia serie di cancri al seno eterogeneo trasformati.

Abstract

Terapie mirate contro il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2) hanno cambiato radicalmente il risultato dei pazienti con tumori al seno HER2-positivo. Tuttavia, una minoranza dei casi viene visualizzata una distribuzione eterogenea delle cellule HER2-positive, che genera grandi sfide cliniche. Fin qui, nessun protocolli affidabili e standardizzati per la caratterizzazione e la quantificazione dell'amplificazione del gene HER2 eterogenei in larghe coorti sono state proposte. Qui, presentiamo una metodologia di alto-rendimento per valutare contemporaneamente lo stato di HER2 in diverse aree topografiche dei cancri al seno più. In particolare, vi illustriamo la procedura di laboratorio per la costruzione di microarrays di avanzata del tessuto (TMAs) incorporando una mappatura mirata dei tumori. Tutti i parametri di TMA sono stati ottimizzati in modo specifico per l'argento in situ ibridazione (SISH) di formalina-fisso la tessuti del seno di paraffina (FFPE). L'analisi di Immunohistochemical dei biomarcatori prognostici e predittivi (cioè, ER, PR, Ki67 e HER2) deve essere eseguita utilizzando procedure automatizzate. Un protocollo personalizzato di SISH è stato implementato per consentire un'analisi molecolare di alta qualità attraverso tessuti multipli che ha subito diverse procedure di fissazione, elaborazione e archiviazione. In questo studio, forniamo un prova-de-principio che sequenze specifiche del DNA potrebbero essere tumori della mammella localizzate simultaneamente in distinte aree topografiche della multipla ed eterogeneo trasformati utilizzando un metodo efficiente ed economico.

Introduzione

HER2 è un proto-oncogene che è overexpressed ed amplificato in 15-30% di tutti i invasivo al seno tumori1,2. Iperespressione di HER2 è dedotto dalla presenza di > 10% di cellule con membrana forte immunoistochimica (IHC) colorazione (3 +), mentre l'amplificazione del gene può essere valutato quando il rapporto di HER2/centromero è ≥ 2 oppure il numero di copie del gene è ≥ 6, sul conteggio almeno 20 celle di in situ di ibridazione (ISH)3.

Eterogeneità genetica intra-tumorale è stata ampiamente descritta nei cancri al seno, essendo un contributo potenzialmente negative per valutazione di biomarcatori e trattamenti risposta4. Secondo la College di patologi americani (PAC), eterogeneità di HER2 esiste se HER2 è amplificato > 5% e < 50% di infiltrazione del tumore cellule5. Purtroppo, l'incidenza effettiva della eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno rimane un argomento di polemica tra patologi, con alcuni autori sostenendo che è un evento eccessivamente raro, e altri che suggeriscono che fino al 40% dei casi sono HER2-eterogenei1,5,6,7,8,9,10. Nonostante i meccanismi biologici che sono alla base di questa condizione non sono ancora completamente chiariti, l'impatto prognostico e clinico di eterogeneità di intra-tumore HER2 è cruciale per seno cancro pazienti11.

Recentemente, luminoso-campo tecniche molecolari, quali ISH cromogenica (CISH) e argento ISH (SISH), sono emersi come metodi affidabili per rilevare HER2 eterogeneità nei tessuti FFPE, con alcuni vantaggi rispetto al fluorescenti ISH (pesce)12. Purtroppo, l'analisi di massa di singoli casi rimane impraticabile in studi di coorte di grande ricerca. Parecchi gruppi hanno suggerito che la combinazione di istochimica, IHC e ISH con tecnologie TMA potrebbe rappresentare una strategia utile nello studio della biologia del cancro13,14,15,16. Con questo metodo ampiamente adottato, campioni di tessuto da pazienti diversi possono essere analizzati contemporaneamente, riducendo al minimo il tessuto e i reagenti impiegati e promuovendo così l'analisi uniforme di una grande serie di casi14. Tuttavia, nessun protocolli sono disponibile per la caratterizzazione molecolare di alto-rendimento simultanea di più campioni di tessuto che ha subito diverse elaborazione in termini di reagenti, tempi di fissazione e metodi di conservazione autonomi, tali come archivio storico blocchi.

Date le implicazioni cliniche e prognostiche di eterogeneità spaziale HER2 nei cancri al seno, abbiamo sviluppato una piattaforma integrata molecolare per valutarlo in ampia serie di casi eterogeneo trasformati. Qui, abbiamo ritrarre le strategie di laboratorio per generare e analizzare l'eterogeneità intra-tumorale di amplificazione di HER2 in high yield TMAs di cancro al seno per mezzo di SISH. Il seguente protocollo è stato sviluppato per i tumori di misura > 5 mm (> pT1b secondo il TNM 2017)17. Per le più piccole lesioni, si consiglia di eseguire l'analisi su sezioni di serie integrale. La nostra procedura consente l'analisi simultanea di IHC e SISH di fino a 30 cancri al seno, che comprende una media di 6 zone distinte (gamma 4-8) per ciascun caso. Complessivamente, 180 nuclei di tessuto di 1 mm di diametro, con 500 µm tra il core e 2 mm tra la griglia e bordi verranno generati per ogni blocco TMA.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dalla Institutional Review Boards da IRCCS Ca' Granda Foundation, ospedale Policlinico, Milano, Italia.

1. selezione dei pazienti e dei campioni di tessuto

  1. Recuperare le diapositive archiviazione di tutti i casi per essere analizzati, compresi tutti i disponibile ematossilina ed eosina (H & E) e diapositive IHC dalla diagnosi originale e, se presente, un H & E di abbinati tessuto neoplastico mammario (ad es., margine chirurgico) .
  2. Eseguire revisioni di caso.
    Nota: Per questa attività, almeno due patologi con esperienza in patologia mammaria dovrebbero discutere le diapositive diagnostiche e risolvere disaccordi collegialmente. Utilizzare un microscopio convenzionale o strumenti di telepatologia (quest'ultimo in studi multicentrici di favore). Se del caso, escludere tutti i casi discordanti.
    1. Eseguire la ri-classificazione istologica di tutti i casi secondo l'ultima edizione della classificazione World Health Organization (WHO) dei tumori del seno18.
    2. Assicurarsi che il tessuto normale per ogni caso, se presenti nei campioni clinici archivistici, comprende almeno una unità duttale lobulare terminale non-neoplastico.
    3. Identificare tutte le aree neoplastiche che mostrano eterogenee citologico, architettonico, o caratteristiche IHC usando un microscopio a campo chiaro (da effettuarsi congiuntamente da un patologo e il tecnico che costruirà il TMAs).
  3. Evidenziare le aree topografiche discrete con un pennarello su vetrino o con l'apposito attrezzo sul software diapositiva digitale (Figura 1A).
  4. Basato su diapositive selezionate, recuperare i corrispondenti blocchi FFPE dagli archivi.
    Nota: Per ottimizzare la TMA costruzione, per evitare lo svuotamento del tessuto e per preservare la TMA punch integrità strutturale, casi con < 1 mm di spessore tessuto residuo dovrebbe essere escluso.

2. progettare e costruire TMAs basato sulla tecnica Kononen

  1. Creare e aprire un nuovo file di foglio di calcolo che incorporano i record delle zone distinte di ogni caso. Includere i seguenti dati su colonne separate, come esemplificato nella tabella 1: caso ID, ID del blocco, Area ID, tipo di tessuto (ad es., tessuto normale, componente invasiva istotipo, in situ componente istotipo), topografia (ad es., nucleo del tumore, invasivo anteriore), morfologia (ad es., grado nucleare, architettura, mitosi, caratteristiche citologiche), lo stato di biomarcatori (cioè, ricevitore dell'estrogeno (ER), ricevitore del progesterone (PR), Ki67 e HER2) e tutte le altre caratteristiche IHC disponibili.
    1. Salvare il documento.
  2. Creare un progetto TMA.
    1. Installare e aprire il software di progettazione di TMA.
    2. Definire il destinatario TMA blocchi: accesso tramite il menu File > New > blocco o utilizzando CTRL + B.
    3. Fai clic nel campo primo di riempire o premere il tasto Tab e digitare nelle dimensioni del blocco paraffina: larghezza 35 mm, altezza 20 (mm). Tipo "2" come il valore di "margine" (cioè, la distanza dal bordo di paraffina in mm) (Figura 1B). Salvare i dati facendo clic sul pulsante appropriato. Il nuovo modello di destinatari bloccati verranno salvate e pronto per essere utilizzato nei nuovi modelli di matrice del tessuto.
    4. Creare un progetto di matrice del tessuto: accesso al menu File > New > tessuto matrice o utilizzando CTRL + T.
    5. Immettere il nome della matrice del tessuto, commenti e autore, quindi fare clic su "Avanti". Fare clic sull'icona di "importazione", scegliere il file di modello di destinatari bloccati precedentemente creato e fare clic su "Avanti".
    6. Scegliere 1 mm come la dimensione dello spot facendo clic sul pulsante rotondo. Scegliere 500 µm come spaziatura spot che è lo spazio tra i due centri dei luoghi vicini. Fare clic sull'icona calcolatrice per calcolare il numero totale di punti creati, che dovrebbe essere 231. Fare clic su "Avanti".
    7. Definire le modalità di numerazione spot facendo clic una volta su di esso. Fare clic sul pulsante "definire" per creare reti e sotto-reti. Elimina la central line (linea 6) e le colonne 8 e 15. Mantenere 3 punti della linea 1 per l'orientamento. La mappa finale dovrebbe comprendere un numero totale di 183 macchie, come rappresentato nella Figura 2.
    8. Definire l'elenco di tipi di tessuto: accesso tramite il menu File > New > elenco di tipi di tessuto o utilizzando CTRL + L.
    9. Inserire le descrizioni di tessuto precedentemente definite. Premere freccia giù oppure fare clic sul pulsante + per aggiungere una riga.
    10. Definire il progetto: accesso tramite il menu File > nuovo > progetto Booster o utilizzando CTRL + P.
    11. Immettere il nome della matrice di tessuto, commenti e autore, quindi fare clic su "Avanti". Importare il file di foglio di calcolo, elenco di tipi di tessuto e modello di matrice del tessuto creato in precedenza cliccando le icone corrette.
    12. Fare clic su "Seleziona tutto" e definire il numero di punti per ogni tipo di tessuto; fare clic sul pulsante "partita" per applicare le impostazioni. Verrà visualizzata una tabella che elenca il numero totale di core che verranno campionate e trasferito al destinatari blocchi in questo progetto. Salvare il progetto e chiudere il programma.
  3. Preparare i blocchi accettore (Figura 1B).
    1. Riempire detersa stampi in metallo con inserti paraffina a 65 ° C.
    2. Lasciare i blocchi di paraffina a raffreddare a temperatura ambiente durante la notte all'interno di stampi in metallo.
    3. Estrarre i blocchi di paraffina da stampi in metallo. In caso di crepe, scartare il blocco e ripetere i passi 2.3.1-2.3.3.
  4. Costruire la TMA utilizzando un arrayer automatizzata o semi-automatico19.
    1. Recuperare tutti i selezionati FFPE blocchi e le corrispondenti sezioni H & E con annotazioni.
    2. Accendere il arrayer e inserire i blocchi di ricettore sulla giostra arrayer.
    3. Aprire il software arrayer control station, cliccare su "Nuovo tessuto Array" e caricare il progetto creato in precedenza (Figura 1).
    4. Fare clic su "Continua" e selezionare la posizione di blocco il donatore dal menu.
    5. Definire la posizione iniziale su ogni blocco di destinatari: utilizzare i tasti freccia per spostare la luce laser e allinearlo con il bordo superiore sinistro sulla paraffina del blocco destinatario.
    6. Fare clic su "Avanti" e ripetere per l'allineamento verticale.
    7. Fare clic su "Avanti" per creare automaticamente un buco nella coordinata precedentemente definita del blocco destinatario (accettore).
    8. Svuotare il pugno.
    9. Posizionare il blocco di donatori per il campionamento e rimuovere un nucleo di tessuto dalla zona precedentemente annotata di interesse.
    10. Inserire il nucleo del tessuto donatore nel foro del blocco di destinatario (accettore).
    11. Rimuovere il blocco di donatore dal arrayer.
    12. Ripetere i passaggi 2.4.5-2.4.11 fino al completamento della TMA.
  5. Mettere il lato del tessuto del blocco TMA appena generato su una diapositiva vuota sterile e metterli in forno laboratorio a 45 ° C per 5 min.
  6. Premere delicatamente il blocco sulla diapositiva per 5 s per appiattire i nuclei di tessuto. Ripetere una volta (per un totale di 2 volte).
  7. Rimuovere il blocco TMA insieme con la diapositiva dal forno, capovolgerli e staccare delicatamente il blocco dalla diapositiva.
  8. Coprire la superficie del tessuto TMA con un sottile strato di paraffina elasticizzato a 65 ° C.
  9. Lasciare il blocco TMA a temperatura ambiente per 2 h.
  10. Trasferimento del blocco TMA a 4 ° C per 24 h.
    Nota: Il blocco TMA può essere memorizzato a 4 ° C fino ad esaurimento.

3. istochimiche e Immunohistochemical analisi

  1. Tagliare sezioni TMA.
    1. Posizionare i blocchi di accettore TMA con il paraffina-lato verso il basso su una superficie di-10 ° C per 10 min raffreddare la paraffina.
    2. Riempire una vasca di galleggiamento con acqua ultrapura e impostare calore a 38 ° C.
    3. Inserire una nuova lama su un microtomo rotativo e inserire il blocco nel mandrino microtomo così il blocco di cera si affaccia la lama ed è allineato sul piano verticale.
    4. Avvicinarsi con cautela il blocco con la lama e tagliare alcune sezioni sottili per garantire che il posizionamento è corretto; regolare se necessario.
    5. Tagliare 3 µm di spessore sezioni.
    6. Pick up le sezioni usando la pinzetta e li galleggiare sulla superficie della vasca dell'acqua.
    7. Scegli le sezioni fuori il bagno di acqua su vetrini IHC/ISH e regolari.
    8. Porre i vetrini in un rack e memorizzarli in forno a 45 ° C durante la notte.
      Nota: Una volta preparato, le sezioni TMA dovrebbero essere macchiate entro 24 h.
  2. Eseguire la colorazione istochimica (H & E) utilizza un autostainer.
    1. Inserire le diapositive nel rack autostainer e metterli a 60 ° C per 10 min.
    2. Aprire il cassetto di caricamento del autostainer e Inserisci che il rack con TMA i vetrini in una delle stazioni di carico con una clip standard di H & E rivolto verso l'esterno.
    3. Una volta che il cassetto è chiuso, il clip verrà riconosciuto automaticamente dal sistema e verrà avviato il seguente protocollo: Stazione forno a 37 ° C (6 min), xilene (2 min), xilene (2 min), etanolo 100% (2 min), etanolo 100% (2 min), etanolo 95% (2 min), etanolo 95% (2 min) , acqua distillata acqua (4 min), ematossilina di Carazzi (9 min), acqua corrente a bassa pressione (2 min), eosina 1% (1 min), acqua corrente a bassa pressione (2 min), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 95% (20 s), etanolo 100% (15 s), etanolo 100% (15 s) , xilene (30 s), xilene (30 s).
    4. Scaricare il rack dal cassetto e montare il vetrino con un vetrino coprioggetto.
      1. Raccogliere una goccia di montaggio con una pipetta e metterlo su un bordo esterno della diapositiva coperchio.
      2. Posizionare il lato bagnato del coprioggetto sul vetrino e lasciare il Monte asciugare per 30 min.
  3. Eseguire IHC che macchia per ER, PR, Ki67 e HER2 utilizzando un immunostainer automatizzato.
    Nota: Prima di iniziare a correre colorazione, avviare il sistema e controllare i flaconi di reagenti consumabili (Tabella materiali) e contenitori di rifiuti.
    1. Porre i vetrini TMA per analizzare a 60 ° C per 10 min.
    2. Avviare lo strumento di immunostainer ed il software.
    3. La vista Home, fare clic sul pulsante di protocolli e quindi fare clic su Crea/modifica protocolli.
    4. Selezionare standard DAB (3, 3'-diaminobenzidina) procedura di IHC per modificare il modello di base.
    5. Bandiera "Sparaffinatura" nell'elenco della casella e impostare la temperatura media a 72 ° C.
    6. La soluzione che smaschera cc1 di flag, impostare la temperatura media a 95 ° C e il tempo di incubazione a 36 min.
    7. Contrassegnare la casella di anticorpo primario, inserire l'ID del dispenser inline ER (software dello strumento riconoscerà l'erogatore sulla giostra reagente) e impostare il tempo di incubazione a 16 min.
    8. Contrassegnare la casella controcolorazione, selezionare ematossilina io e impostare il tempo di incubazione a 12 min.
    9. Fare clic sul pulsante "Salva con nome" e il nome del protocollo.
    10. Ripetere la procedura 3.3.3-3.3.9 per i restanti anticorpi usando i seguenti tempi di incubazione gli anticorpi primari: PR 16 min, Ki67 16 min e HER2 12 min utilizzare anticorpi pre-diluito ready-to-use (RTU).
    11. La vista Home, fare clic sul pulsante Crea etichetta.
    12. Fare clic sul pulsante di protocolli e aggiungere i protocolli ER, PR, Ki67 e HER2 per ciascuna della TMA per analizzare.
    13. Fare clic sul pulsante Chiudi /Print.
    14. Come il modello di etichetta viene visualizzata, immettere gli ID di TMA per l'etichetta.
    15. Fare clic sul pulsante stampa per stampare le etichette e quindi applicarli sulle diapositive TMA.
    16. Fare clic sull'icona dello strumento e impostare la modalità di avvio dello strumento come "Pronto".
    17. Aprire il cappuccio che copre il carosello di reagenti, collocare il sistema di rilevamento e gli anticorpi primari, quindi chiudere il cofano.
    18. Fare clic sul pulsante frontale su un cassetto scorrevole per aprirlo, caricare i vetrini TMA e chiudere il cassetto facendo clic sul pulsante stesso.
    19. Impostare la modalità di avvio dello strumento come "in esecuzione" e seguire le istruzioni.
    20. Alla fine dell'esecuzione, scarico TMA diapositive premendo l'aperto tutti i cassetti con risciacquo e completato diapositive pulsante sullo strumento controllo Slide in caldo acqua e sapone per rimuovere eventuali reagenti restanti.
    21. Lavare i vetrini sotto acqua corrente fredda a bassa pressione, disidratare i vetrini TMA e applicare un vetrino coprioggetti a ogni diapositiva.
  4. Eseguire analisi IHC di ER, PR e HER2 seguendo la società americana di oncologia clinica (ASCO) / CAP linee guida e di Ki67 secondo le raccomandazioni dell'internazionale Ki67 nel gruppo di lavoro di cancro al seno (tabella 2).
    Nota: Questa analisi deve essere eseguita separatamente nei punti discreti del tessuto da un patologo con un'esperienza in patologia mammaria.
    1. Valutare l'espressione di ER come positiva se ≥ 1% dei nuclei delle cellule del tumore sono immunoreactive20,21,22,23.
    2. Valutare l'espressione di PR come positiva se ≥ 1% dei nuclei delle cellule del tumore sono immunoreactive20,21,22,23.
    3. Valutare l'espressione di HER2 come: a) Punteggio 3 + se membrana circonferenza macchiatura completo e intenso, b) Punteggio 2 + se colorazione circonferenziale della membrana è incompleta e/o debole/moderata e all'interno di > 10% delle cellule del tumore invasivo o completa e colorazione di membrana della circonferenza è intenso e ≤ 10% delle cellule del tumore invasivo, c) score 1 + se membrana incompleta colorazione è debole/appena percettibile e all'interno di > 10% delle cellule del tumore invasivo, d) negativo se nessuna macchiatura è presente o membrana la colorazione è incompleta e debole/appena percettibile e all'interno di ≤ 10% del tumore invasivo cellule3,24.
    4. Valutare l'indice di Ki67, come la percentuale di cellule con colorazione nucleare in almeno 1.000 cellule neoplastici casualmente selezionati oltre 10 campi ad alta potenza (ingrandimento, 400 X)25.

4. SISH analisi di HER2

  1. Tagliare sezioni TMA (ripetere il punto 3.1).
  2. Eseguire SISH per HER2 utilizzando un immunostainer automatizzato.
    1. Porre i vetrini TMA per analizzare a 60 ° C per 10 min.
    2. Avviare lo strumento di immunostainer ed il software.
    3. La vista Home, fare clic sul pulsante di protocolli e quindi fare clic su Crea/modifica protocolli.
    4. Selezionare la procedura di "U Dual ISH CKT" per modificare il modello di base.
    5. Bandiera "Asciugatura" nell'elenco della casella e impostare la temperatura a 63 ° C per 20 min.
    6. Bandiera "Cella condizionata" nell'elenco della casella, quindi "cella condizionata CC2" e impostare la temperatura a 86 ° C e a incubazione a 4 min.
    7. Bandiera mite CC2 (ciclo 1), Standard (ciclo 2) ed Extended (ciclo 3) per 8 min, 12 min e 8 min, rispettivamente.
    8. Bandiera "ISH-proteasi 3" nell'elenco della casella e impostare il tempo di incubazione a 16 min.
    9. Selezionare le sonde HER2DNP e CHR17DIG e impostare il tempo di incubazione a 6 h.
    10. Impostare il lavaggio a 76 ° C per 8 minuti.
    11. Impostare il tempo di incubazione multimer (SIL ISH DNP HRP) SISH a 32 min.
    12. Impostare il tempo di incubazione di argento Cromogeno (SIL ISH DNP CHRC) a 4 min.
    13. Impostare il tempo di incubazione multimer rosso (rosso ISH scavare AP) a 24 min.
    14. Impostare il tempo di incubazione di cromogeno rosso (rosso ISH scavare FR) a 8 min.
    15. Bandiera "controcolorazione" nell'elenco della casella, selezionare "Ematossilina II" e impostare il tempo di incubazione a 8 min.
    16. Bandiera "post-Counterstaining" nell'elenco della casella, selezionare "Reagente blu" e impostare il tempo di incubazione a 4 min.
    17. Ripetere i passaggi da 3.3.11-3.3.15 (selezionare modificato protocollo U Dual ISH CKT).
    18. Aprire il cappuccio che copre il carosello di reagenti, posizionare il lavaggio e i sistemi di rilevamento di ISH, quindi chiudere il cofano.
    19. Ripetere i passaggi da 3.3.18-3.3.21.
  3. Eseguire analisi SISH per HER2: valutare l'amplificazione del gene HER2 come positivo se il rapporto di /CEP17 di HER2è  2,0 con una media HER2 copia numero ≥4.0 segnali per cella e negativa se il rapporto di /CEP17 di HER2è < 2.0 con una media di HER2 copia numero < 4.0 segnali/cella3,24.
    Nota: Simile a IHC, questa analisi deve essere eseguita separatamente nei punti discreti del tessuto da un patologo con esperienza in patologia mammaria.

Risultati

Nel complesso, al seno invasivo 444 cancri sono stati incorporati in 15 TMAs specificamente ottimizzato per analisi ISH. Tra i luoghi di 2.664 campionati, 2.651 (99,5%) fossero rappresentative delle zone precedentemente selezionate e quindi considerati suscettibili per analisi successive. Eterogeneità intra-tumorale è stata determinata mediante IHC e SIH, con un focus particolare sulle distribuzioni eterogenee dei cloni di HER2-positive nelle distinte aree topografiche dei tumori.

Discussione

Qui, noi abbiamo dettagliato le strategie di laboratorio per eseguire analisi di SISH del gene HER2 e suo centromero corrispondente in TMAs ad alto rendimento dei cancri al seno eterogeneo trasformati. Questo metodo è conveniente e può essere effettuato nella maggior parte dei laboratori per lo studio dell'eterogeneità di amplificazione genica di HER2 in larghe coorti di seno tumori Estratto forma patologia archivi.

Data l'importanza clinica di HER2 test nel cancro al seno...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Nessuno.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Surgipath ParaplastLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU39601006Tissue embedding medium, 56 °C melting point
Eosin Y  1% water solutionBio Optica, Milan, Italy, EU510002Eosin yellowish, water-soluble
Carazzi’s hematoxylinBio Optica, Milan, Italy, EU506012Alum hematoxylin ripened using potassium iodate
Diamond qualityLaboindustria, Arzergrande, Italy, EU3353326x76 mm microscope slides
Leica CV MountLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EU14046430011Mounting medium, with no monomers, based on polymers of butylmethacrylate in xylene
FLEX IHC microscope slidesAgilent Technologies (Dako),  Santa Clara, CA, USAK8020Coated microscope slides for adhesion of FFPE for use in IHC
BenchMark ULTRAVentana medical system, Tucson, AZ, USAN750-BMKU-FSSlide staining system
CONFIRM anti-Estrogen Receptor (ER) (SP1) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4324Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Progesterone Receptor (PR) (1E2) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2223Primary antibody, ready-to-use
CONFIRM anti-Ki-67 (30-9) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4286Primary antibody, ready-to-use
PATHWAY HER2 (4B5) Rabbit Monoclonal Primary AntibodyVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-4493Primary antibody, ready-to-use
ultraView Universal DAB Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-500Indirect, biotin-free system for detecting mouse IgG, mouse IgM and rabbit primary antibodies
INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe CocktailVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4422INFORM HER2 Dual ISH assay - Dual color in situ hybridization FDA approved automated assay for determining HER2 gene status in breast cancer patients 
ultraView Silver ISH DNP Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-098
ultraView Red ISH DIG Detection KitVentana medical system, Tucson, AZ, USA800-505
ISH Protease 3Ventana medical system, Tucson, AZ, USA780-4149Used in the ISH process to remove protein that surrounds the target DNA sequences of interest
HematoxylinVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2021Modified Gill's hematoxylin counterstain reagent
Hematoxylin II CounterstainingVentana medical system, Tucson, AZ, USA790-2208Modified Meyer's hematoxylin counterstain reagent
Bluing reagentVentana medical system, Tucson, AZ, USA760-2037Aqueous solution of buffered lithium carbonate for bluing hematoxylin stained sections on glass slides
HybReadyVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-4409Formamide-based buffer for ISH assays
EZ Prep (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-102Concentrate solution for paraffin removal from tissue samples during IHC and ISH reactions, and to dilute 1:10.
SSC Buffer (10X)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-110Sodium Chloride Sodium Citrate buffer solution is used for stringency washes and to rinse slides between staining steps and provide a stable aqueous environment for the in situ hybridization reactions. Dilute 1:5.
ULTRA LCSVentana medical system, Tucson, AZ, USA650-210Prediluted (ready-to-use) coverslip solution used as a barrier between the aqueous reagents and the air to prevent evaporation in the IHC and ISH reactions
Reaction Buffer (10x)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-300Tris based buffer solution (pH 7.6 ± 0.2) to rinse slides between staining steps during IHC and ISH. Dilute 1:10.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-223Pretreatment steps in the processing of tissue samples during IHC and ISH. Ready to use.
ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC1)Ventana medical system, Tucson, AZ, USA950-224
ultraView Silver Wash IIVentana medical system, Tucson, AZ, USA780-003Ready-to-use solution to rinse slides between IHC and ISH staining steps
MicrotomeLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EURM 2255Automated rotary microtome
MultistainerLeica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUST 5020Workstation for automated staining and coverslipping
Minicore 1Alphelys, Plaisir, France, EU00-MICO-1Semi-automatic arrayer for TMA contruction with TMA Designer 2 embedded software
Aperio ScanScope CS2Leica Biosystems, Wetzlar, Germany, EUK080254Image capture device - digital pathology scanner
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